El presente estudio proporciona un protocolo modificado para aislar macrófagos sinoviales y fibroblastos del tejido de artritis inflamatoria murina.
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Artículo de método
Aislamiento y cultivo de macrófagos sinoviales primarios y fibroblastos a partir de tejido murino de artritis
En este artículo
Resumen
Resumen
La artritis reumatoide es una enfermedad autoinmune que provoca una inflamación crónica de las articulaciones. Los macrófagos sinoviales y los fibroblastos sinoviales tienen un papel central en la patogénesis de la artritis reumatoide. Es importante comprender las funciones de ambas poblaciones celulares para revelar los mecanismos subyacentes a la progresión patológica y la remisión en la artritis inflamatoria. En general, las condiciones experimentales in vitro deben imitar el entorno in vivo tanto como sea posible. Las células derivadas de tejidos primarios se han utilizado en experimentos que caracterizan los fibroblastos sinoviales en la artritis. Por el contrario, en experimentos que investigan las funciones biológicas de los macrófagos en la artritis inflamatoria, se han utilizado líneas celulares, macrófagos derivados de la médula ósea y macrófagos derivados de monocitos sanguíneos. Sin embargo, no está claro si estos macrófagos reflejan realmente las funciones de los macrófagos residentes en los tejidos. Para obtener macrófagos residentes, se modificaron los protocolos anteriores para aislar y expandir tanto los macrófagos primarios como los fibroblastos del tejido sinovial en un modelo de ratón con artritis inflamatoria. Estas células sinoviales primarias pueden ser útiles para el análisis in vitro de la artritis inflamatoria.
Introducción
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune caracterizada por hiperplasia de la membrana sinovial, que conduce a la destrucción articular 1,2. Los macrófagos y fibroblastos residentes en los tejidos están presentes en la membrana sinovial sana para mantener la homeostasis articular. En los pacientes con AR, los fibroblastos sinoviales (SF) proliferan y las células inmunitarias, incluidos los monocitos, se infiltran en la membrana sinovial y en el líquido articular, procesos asociados a la inflamación 1,3,4.
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Protocolo
Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Experimentos con Animales de la Universidad de Ehime y se realizaron de acuerdo con las Directrices de la Universidad de Ehime para Experimentos con Animales (37A1-1*16).
1. Preparación de instrumentos, reactivos y medios de cultivo
- Prepare el medio de cultivo de la siguiente manera: complemente el Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y una solución antibiótica-antimicótica al 1% (anti-anti).
- Preparar el medio de digestión de la siguiente manera: complementar el medio de cultivo con 1 mg/ml de cola....
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Resultados
Los ratones hembra C57BL/6 a las 7-8 semanas de edad sufrieron artritis inducida por anticuerpos de colágeno. Las células similares a macrófagos y las células similares a fibroblastos se aislaron de forma independiente del tejido inflamatorio de la artritis de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente (Figura 2A, B). Las células similares a los macrófagos se utilizaron inmediatamente después del paso 5.7. Las células similares a los fibroblastos se cultivaron inici.......
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Discusión
Este método desarrollado aquí mejora las técnicas anteriores para aislar tanto los SF de la artritis murina como los macrófagos residentes de varios órganos 7,11. El método modificado puede aislar tanto macrófagos como fibroblastos de la membrana sinovial inflamatoria con alta pureza, y es simple y reproducible. Dado que el método no requiere instrumentos complejos como un clasificador de células, cualquiera puede realizarlo. Además, la presente técnica evita las.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores agradecen al personal de la División de Apoyo a la Investigación Médica, el Centro de Apoyo a la Investigación Avanzada (ADRES) y a los miembros de la División de Fisiopatología Integrativa del Centro de Proteociencia (PROS) de la Universidad de Ehime, por su asistencia técnica y apoyo útil. Este estudio fue financiado en parte por las subvenciones KAKENHI de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (a NS) y JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (a YI); subvenciones de la Fundación de Investigación Médica de Osaka para Enfermedades Intratables, la Fundación Nakatomi, la Beca Rising ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5,0 g/L de tripsina/5,3 mmol/L EDTA solución | nacalai tesque | 35556-44 | Diluido con |
| antibiótico HBSS– antimicótico (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Aguja de mariposa | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Colador de células | Falcon | 352340 | 40 µ poro m, Nylon |
| Cellmatrix Tipo I-C | Gelatina Nitta | 637-00773 | Colágeno tipo I-C |
| Tubo de centrífuga 15 | TPP | 91014 | Tubo de 15 mL |
| Tubo de centrífuga 50 | TPP | 91050 | Tubo de 50 mL |
| Colagenasa de C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Colágeno tipo IV |
| Dulbecco' s Águila modificada Medio GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | SIGAM | 173012 | Se realizó la inactivación |
| del calor Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Tijeras | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Placa de cultivo de tejidos 40 | TPP | 93040 | Para cultivo celular |
| Placa de cultivo de tejidos 60 | TPP | 92006 | Para cultivo celular |
| Pinzas | KFI | 1-9749-31 | Pinzas de punta fina |
| Bio Research Center | PRI28-1522 | Punta dentada | |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Microscopio estereoscópico |
Referencias
- Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. Rheumatoid arthritis. Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).
- Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S.
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Reimpresiones y permisos
