Uso del cerebro del embrión de pollo como modelo para análisis in vivo y ex vivo del comportamiento de las células de glioblastoma humano

Resumen

Los embriones de pollo se utilizan para estudiar tumores cerebrales de glioblastoma humano (GBM) in ovo y en cocultivos de cortes cerebrales ex vivo . El comportamiento de las células GBM se puede registrar mediante microscopía de lapso de tiempo en cocultivos ex vivo , y ambas preparaciones se pueden analizar en el punto final experimental mediante un análisis confocal 3D detallado.

Resumen

El embrión de pollo ha sido un sistema modelo ideal para el estudio del desarrollo de vertebrados, particularmente para manipulaciones experimentales. El uso del embrión de pollo se ha extendido para estudiar la formación de tumores cerebrales de glioblastoma humano (GBM) in vivo y la invasividad de las células tumorales en el tejido cerebral circundante. Los tumores GBM se pueden formar mediante la inyección de una suspensión de células marcadas con fluorescencia en el ventrículo del mesencéfalo E5 (tectum óptico) en ovo.

Dependiendo de las células GBM, los tumores compactos se forman aleatoriamente en el ventrículo y dentro de la pared cerebral, y grupos de células invaden el tejido de la pared cerebral. Las secciones de tejido grueso (350 μm) de tecta E15 fija con tumores pueden ser inmunoteñidas para revelar que las células invasoras a menudo migran a lo largo de los vasos sanguíneos cuando se analizan mediante la reconstrucción 3D de imágenes confocales de pila z. Los cortes vivos del mesencéfalo y el prosencéfalo E15 (250-350 μm) se pueden cultivar en insertos de membrana, donde las células GBM marcadas con fluorescencia se pueden introducir en ubicaciones no aleatorias para proporcionar cocultivos ex vivo para analizar la invasión celular, que también puede ocurrir a lo largo de los vasos sanguíneos, durante un período de aproximadamente 1 semana. Estos cocultivos ex vivo pueden ser monitoreados por microscopía de lapso de tiempo de fluorescencia confocal o de campo amplio para observar el comportamiento de las células vivas.

Los cortes cocultivados pueden ser fijados, inmunoteñidos y analizados por microscopía confocal para determinar si la invasión ocurrió o no a lo largo de los vasos sanguíneos o los axones. Además, el sistema de cocultivo se puede utilizar para investigar posibles interacciones célula-célula mediante la colocación de agregados de diferentes tipos de células y colores en diferentes ubicaciones precisas y la observación de los movimientos celulares. Los tratamientos farmacológicos pueden realizarse en cultivos ex vivo , mientras que estos tratamientos no son compatibles con el sistema in ovo . Estos dos enfoques complementarios permiten análisis detallados y precisos del comportamiento de las células GBM humanas y la formación de tumores en un entorno cerebral de vertebrados altamente manipulable.

Introducción

Los estudios in vitro de los comportamientos de las células cancerosas se utilizan a menudo para diseccionar los mecanismos potenciales que operan durante el comportamiento más complejo que se observa durante la formación de tumores y la invasión celular en modelos de xenoinjertos in vivo. Por ejemplo, con el glioblastoma (GBM), los estudios in vitro han descubierto mecanismos de cómo L1CAM opera potencialmente durante la formación de tumores y la invasión cerebral en un nuevo tumor cerebral de xenoinjerto de embrión de pollo modelo 1,2,3,4,5. Aunque los experimentos in vitro e in vivo se complementan entre sí de manera útil, dejan una brecha sustancial en cómo se pueden correlacionar los resultados. Por ejemplo, los análisis mecanicistas de la motilidad de las células GBM en una placa son una situación altamente artificial, y los modelos de xenoinjertos in vivo solo pueden revelar análisis estáticos de puntos de tiempo o puntos finales de formación tumoral y comportamiento celular. Los estudios in vivo que utilizan roedores o embriones de pollo no se prestan fácilmente para monitorear el comportamiento celular mientras las células invaden el tejido cerebral en estos modelos de xenoinjerto. Sin embargo, el modelo de xenoinjerto de embrión de pollo ha demostrado que la proteína de adhesión L1CAM desempeña un papel estimulante en la capacidad invasiva de las células humanas T98G GBM ^2,5.

Se puede llegar a una solución adecuada a este problema mediante métodos de puente tanto in vivo como in vitro utilizando un modelo organotípico de cultivo de corte cerebral, denominado modelo ex vivo . En este modelo ex vivo, el tejido cerebral vivo se puede mantener a un grosor de varios cientos de micras durante unas pocas semanas, lo que hace posible implantar células cancerosas, observar su comportamiento en el tejido real a lo largo del tiempo y luego realizar un análisis de marcadores más detallado en el punto final del experimento.

Un método popular de cultivo de cortes organotípicos ha sido cultivar una rebanada de cerebro de varios cientos de micras de espesor sobre una membrana porosa translúcida o transparente, dejando el tejido expuesto al aire, pero permitiendo que los medios nutritivos sostengan el tejido desde debajo de la membrana (consulte Stoppini et ^al.6). Se han utilizado diferentes variaciones de este método para diferentes estudios, incluido el uso de diferentes medios o diferentes insertos de membrana. Los diferentes insertos de membrana incluyen un inserto de membrana porosa (0,4 μm) de 30 mm de diámetro en una placa de cultivo de 35 mm 6, y insertos de cultivo celular (0,4 μm) para placas de⁶ pocillos⁷. Los diferentes medios incluyen 50% MEM / HEPES + 25% de suero de caballo inactivado por calor + 25% de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)⁸, 50% de medios de suero reducido + 25% de suero de caballo + 25% de HBSS⁹, así como otros. Si se utiliza una membrana translúcida o transparente junto con células GBM marcadas con fluorescencia, entonces dichos cultivos se pueden visualizar desde abajo utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio invertido o confocal 10,11,12,13,14,15.

Si bien se han establecido muchos modelos de xenoinjerto de tumor cerebral ortotópico in vivo y cultivo de cortes de cerebro organotípicos ex vivo utilizando roedores, como se mencionó anteriormente, el embrión de pollo (Gallus gallus) se ha infrautilizado para estos fines. Sin embargo, se ha demostrado que el embrión de pollo es capaz de ser utilizado como modelo de xenoinjerto ortotópico in vivo para el estudio de la invasión de glioma humano y de rata ^1,2,5. Las células xenoinjertadas en cerebros de embriones de pollo han exhibido patrones de invasión similares a los observados en modelos de roedores, lo que respalda aún más el uso de embriones de pollo como modelo in vivo para el análisis de células tumorales GBM. Los embriones de pollo también son baratos, se pueden mantener más fácilmente que los roedores (es decir, en sus cáscaras de huevo en una incubadora de laboratorio) y son mucho más fáciles de trabajar, lo que los convierte en una opción atractiva para estudios de GBM in vivo a corto plazo. Un artículo reciente ha descrito el uso de cultivos de cortes de cerebro de embrión de pollo para la formación y el crecimiento de axones durante el desarrollo normal del cerebro, donde las rodajas fueron viables durante al menos 7 días¹⁶. Sin embargo, falta el uso de tales cultivos de corte de cerebro de embrión de pollo para el análisis ex vivo del comportamiento de las células GBM en un entorno tisular. En este artículo, se describen tanto el trasplante de células GBM humanas y células madre GBM (GSC) en el cerebro de embrión de pollo temprano in vivo, como la introducción de células GBM en cultivos de cortes de cerebro de embriones de pollo vivos ex vivo. También se proporcionan algunos ejemplos representativos de los tumores resultantes y los patrones de invasión celular obtenidos de estas preparaciones.

Protocolo

No se necesitó autorización o aprobación en la Universidad de Delaware para llevar a cabo este trabajo.

1. Inyección de células GBM en el tectum óptico de los pollitos

1. Preparación de GSC y células GBM para inyección
   1. Cultivo de las SGC en los medios de la SGC (Tabla 1). El cultivo estableció líneas celulares de GBM en medios GBM (Tabla 1).
   2. Enjuague las células en placas con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) y coloque 1 ml de solución de tripsina en un plato de 10 cm. Dejar en una incubadora de cultivo celular durante 2-3 minutos hasta que las células comiencen a desprenderse.
   3. Inactivar la tripsina añadiendo 10 ml de medios de cultivo apropiados que contengan suero en la placa de 10 cm y separar las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Coloque la suspensión celular en un tubo de centrífuga cónica de 15 ml.
   4. Granular las células por centrifugación a 800 × g durante 5 min a 4 °C.
   5. Aspirar el medio del pellet celular utilizando una pipeta de vidrio fino desechable unida a un matraz de brazo lateral y una bomba de vacío. Resuspender las células en medios de crecimiento apropiados a una concentración de 10.000 células por microlitro y colocarlas en un tubo de microfuga o un pequeño tubo de rosca sobre hielo.
   6. Mezcle las células con una pequeña cantidad de colorante FCF verde rápido estéril al 1% (use una proporción de 5 μL de colorante/100 μL de suspensión celular).
2. Inyección de células GBM en el tectum óptico E5 en ovo. Véase la figura complementaria 1.
   1. Incubar los huevos de gallina fertilizados en una incubadora de huevos humidificada, con el extremo puntiagudo hacia abajo, a 37,5 °C (el 1er día de incubación es el día embrionario 0 [E0]). En el 6º día de incubación (E5), esterilice la cáscara del huevo rociando con etanol al 70%.
   2. Usando una vela de huevo, trace a lo largo del perímetro del espacio de aire sobre el embrión con un lápiz y cubra el área delineada con cinta transparente.
   3. Usando tijeras curvas, corte suavemente alrededor del área trazada, teniendo cuidado de no cortar las membranas embrionarias o los vasos sanguíneos, y deseche la parte superior de la cáscara del huevo.
   4. Coloque unas gotas de solución salina o medios de cultivo celular sobre la membrana del espacio de aire para humedecerla y que se desprenda fácilmente. Usando pinzas finas, perfore cuidadosamente la membrana del espacio aéreo sobre la parte superior del embrión, retírela y localice la cabeza del embrión de pollo.
   5. Use fórceps finos para agarrar la membrana amnios transparente que rodea inmediatamente al embrión para posicionar la cabeza de modo que el tectum óptico pueda ser inyectado con células. Con una mano, use las pinzas finas para sujetar el amnios y mantener la cabeza en su lugar durante el proceso de inyección. Tenga cuidado de no dañar los vasos sanguíneos extraembrionarios en la membrana corioalantoidea de la yema.
      NOTA: El procedimiento anterior requiere algo de práctica para poder agarrar eficientemente la membrana amnios transparente que rodea íntimamente al embrión, ya que es invisible hasta que se agarra y se tira. Practique el uso de fórceps finos para agarrar el amnios transparente que rodea inmediatamente al embrión.
   6. Mantenga la cabeza firme agarrando la membrana amnios con pinzas finas. Usando una micropipeta de vidrio y una picobomba neumática, inyecte alrededor de 50,000 células en 5 μL de medios de cultivo celular adecuados en el tectum óptico (5 μL es aproximadamente 1/2 de una micropipeta llena).
      NOTA: Ver Cretu et ^al.1 para una imagen de un embrión E5 que ha sido inyectado con células GBM mezcladas con colorante.
   7. Coloque unas gotas de ampicilina de 50 mg / ml sobre el embrión.
   8. Cubra el agujero en la parte superior de los huevos con cinta adhesiva transparente y déjelo en el humidificador hasta E15 para la disección.

2. Disección de regiones cerebrales de embriones E15

NOTA: La disección de cerebros E15 aquí para la fijación es similar a la descrita en el paso 8.2 para cortes de cerebro vivos, pero la disección aquí no tiene que hacerse en condiciones asépticas.

1. Corte la cinta alrededor de la parte superior de la cáscara, permitiendo el acceso al embrión.
2. Decapitar el embrión en el cuello y colocar la cabeza en un plato de 10 cm con una solución estéril de Tyrodes sin calcio y magnesio (CMF Tyrode). Véase la figura complementaria 2.
3. Usando fórceps finos, retire la piel que cubre el cerebro para revelar la duramadre subyacente. Retire los huesos del cráneo en formación en los lados izquierdo y derecho del cerebro. Los huesos del cráneo en formación aún no cubren la mayor parte del cerebro.
4. Use suavemente pinzas puntiagudas finas para rasgar las meninges que recubren el centro del cerebro y pelarlo a cada lado para descubrir el cerebro.
5. Use fórceps curvos para sacar el cerebro desde abajo y sacarlo suavemente de su cavidad.
6. Diseccionar el cerebro en sus partes: cerebro anterior, tecta, cerebelo.
7. Retire la piamadre suprayacente de la tecta con pinzas finas. Tenga en cuenta que la pia se separa fácilmente de la tecta, pero no del cerebro anterior o el cerebelo. Retire la pia del cerebro anterior tocándola o enrollándola en un pequeño trozo de papel de filtro.
8. Coloque las regiones cerebrales disecadas en un plato pequeño.
9. Coloque las regiones cerebrales para la fijación en un pocillo de placa de 24 pocillos y fije en paraformaldehído al 2% (PFA) en tampón de cacodilato de sodio 0.1 M. Dejar actuar durante al menos 24 h a 4 °C.
10. Después de la fijación, enjuague el tejido en 3x PBS durante al menos 1 hora antes de incrustar en agar.

3. Incrustar y cortar regiones cerebrales cosechadas

1. Precaliente una solución de agar al 3,5% y sacarosa al 8% en PBS hasta que se funda y manténgala a temperatura de fusión.
2. Usando pinzas curvas como cuchara, levante suavemente el tectum óptico o la región del cerebro anterior del cerebro del embrión de pollo, y seque ligeramente en papel de filtro para eliminar el líquido adicional para garantizar la adhesión del agar a la superficie externa del cerebro.
3. Con una pipeta de transferencia estéril, llene el molde con solución de agar.
   NOTA: Se puede hacer un molde simple formando papel de aluminio alrededor de un objeto del tamaño adecuado, como pequeños bloques de corte de tejido vibratorio de metal rectangular.
4. Coloque la región del cerebro en agar y deje que el agar se solidifique por completo.
5. Retire el papel de aluminio de alrededor del cerebro incrustado y recorte el exceso de agar alrededor de los lados con una hoja de afeitar o bisturí.
6. Coloque una gota de pegamento de cianoacrilato en el cuadrado de acero inoxidable de la bandeja de corte, coloque el bloque de agarosa con el cerebro sobre el pegamento y deje que el pegamento se adhiera durante 1 minuto. Coloque la bandeja en el mandril de la cortadora de tejido vibrante, apriete y llene la bandeja con suficiente PBS para cubrir la parte superior del bloque de agar.
7. Corte las rebanadas de cerebro en una cortadora de tejido vibrante a un espesor de 350 μm con una cuchilla de afeitar de acero.
8. A medida que las rebanadas de cerebro se cortan y flotan libremente en la bandeja de corte, use una espátula para recoger y quitar las rodajas de la bandeja. Deslice suavemente la sección fuera de la espátula y en una placa de Petri etiquetada de 10 cm con PBS para que las secciones floten libremente.
   NOTA: El agar que rodea el corte cerebral puede desprenderse si el cerebro no está lo suficientemente borrado con papel de filtro para eliminar el exceso de líquido antes de incrustarlo. Si esto ocurre, el tejido cerebral puede retirarse suavemente del agar solidificado y volver a incrustarse después de la secación adecuada del exceso de líquido.

4. Inmunotinción de cortes cerebrales con células tumorales

1. Usando un microscopio estereoscópico equipado con epifluorescencia, examine cortes individuales en el plato de 10 cm uno por uno para detectar la presencia o ausencia de células tumorales.
2. Prepare una cantidad suficiente de solución salina tamponada con fosfato con Triton X-100 al 0,1% y suero de cabra normal al 5% (PBSTG) (ver Tabla 1) para la inmunotinción y enjuague las rodajas a inmunizar.
3. Pozos de medio llenado en una placa de 24 pocillos que se utilizará para teñir secciones del cerebro con PBS.
4. Recorte las esquinas de agar alrededor de las rodajas de cerebro con el borde de una espátula o un bisturí, y colóquelas suavemente en los pocillos que contienen PBS.
5. Aspirar el PBS y reemplazarlo con 350 μL de solución de tinción de anticuerpos primarios en PBSTG (p. ej., 2 μg/ml de UJ127 en PBSTG).
6. Incubar durante 24 h en una cámara frigorífica con una agitación suave para que se vea que la rebanada se mueve libremente dentro del pozo.
7. Después de 24 h, retire la solución de anticuerpos primarios y enjuague 3 x 1 h con PBSTG en una habitación fría con agitación.
8. Cuando termine de enjuagar, incubar en 350 μL/pocillo de solución de tinción de anticuerpos secundaria en PBSTG (p. ej., 1/200 dilución de biotina-GAM en PBSTG). Incubar durante 20 h en una cámara frigorífica con agitación.
   NOTA: Si renuncia al paso terciario e incuba con el anticuerpo secundario que contiene fluorocromo en este paso, cubra para proteger de la luz durante la incubación ahora y luego vaya al paso 4.11.
9. Retire la solución de anticuerpos secundarios y enjuague 3 x 1 h en PBSTG en una cámara frigorífica con agitación.
10. Retire el PBSTG e incube en la solución terciaria (p. ej., dilución 1:250 de Alexa Fluor 647 estreptavidina en PBSTG). Si lo desea, tiñe los núcleos en este paso añadiendo 0,1 μg/ml de bisbenzimida a la mezcla. Incubar durante 20 h en una cámara frigorífica con agitación.
11. Retirar la solución terciaria y enjuagar 3 x 1 h en PBSTG en una cámara frigorífica con agitación.
12. Dejar en PBS hasta que esté listo para montar en portaobjetos de microscopio.

5. Montaje de cortes en portaobjetos de microscopio

1. Prepare tantos portaobjetos de microscopio como secciones haya para montar.
2. Para cada diapositiva, coloque una tira de 50 mm de longitud de cinta eléctrica de vinilo de 10 mil (254 μm) de espesor en una pieza de parafilm.
3. Con un taladro cuadrado de 1 cm x 1 cm, perfore un agujero a través del centro de la cinta aislante y el parafilm.
4. Saque la cinta del parafilm y colóquela encima del portaobjetos del microscopio, dejando espacio para etiquetar la cinta en el portaobjetos.
5. Con una micropipeta, coloque una o dos gotas de medios de montaje antidecoloración en el orificio cuadrado en el centro de la cinta aislante.
6. Use una espátula curva para levantar la sección deseada de la cortadora de tejido vibratorio del PBSTG y absorba completamente la humedad con una toallita de laboratorio limpia o un trozo de papel de filtro.
7. Toque el borde de la rodaja con la gota de montante y use otra espátula para deslizar suavemente la sección en el medio de montaje.
8. Cubra la sección con unas gotas más de montante y coloque cuidadosamente un cubreobjetos de 24 mm x 30 mm (grosor # 1.5) en la parte superior de la sección y el montante.
9. Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas para mantenerlo en su lugar.

6. Microscopía confocal de cortes cerebrales fijos

1. Use fluorescencia de campo amplio para encontrar tumores fluorescentes en el corte cerebral montado usando la lente y los conjuntos de filtros de objetivo apropiados.
   NOTA: Algunos tumores pueden ser bastante grandes y son fácilmente visibles con el objetivo 4x, mientras que las células individuales pueden requerir el objetivo 10x.
2. Cambie a microscopía confocal utilizando una lente de objetivo, láser(es), tamaño estenopeico y ajustes de detector adecuados. Para seguir este protocolo, utilice un objetivo de 20x (apertura numérica [N.A.] = 0,75) para imágenes de rutina y un objetivo de aceite de 60x (N.A. = 1,40) para imágenes de alta resolución.
3. Establezca los límites superior e inferior del eje z y el tamaño del paso (para la situación específica de acuerdo con las instrucciones del fabricante del microscopio confocal) para adquirir secciones ópticas. Adquiera una pila z de secciones ópticas.
4. Utilice el software de microscopio confocal para crear una representación de volumen 3D del tumor, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

7. Preparación de esferoides

1. Creación de placas de poli(2-hidroxietil metacrilato) (poli-HEMA)
   1. Cree una solución de 10 μg/ml de poli-HEMA en etanol al 95% y cubra las placas de Petri de 35 mm (o placas de cultivo celular) con 1 ml de esta solución.
   2. Deje que los platos se asienten en un balancín descubierto durante la noche a temperatura ambiente para desarrollar una capa de la superficie del plato.
      NOTA: El solvente se evaporará y dejará una capa translúcida en el plato, que puede parecer desigual, pero esto no afectará la capacidad de producir esferoides celulares.
   3. Después del secado, esterilice los platos abiertos bajo luz UV en un gabinete de bioseguridad durante 1 h. Reemplace las tapas después de la esterilización. Los platos recubiertos ya están listos para su uso.
2. Tinción DiD fluorescente para microscopía time-lapse
   NOTA: Esta sección es para teñir células individuales con tinte fluorescente DiD que se utilizará para hacer esferoides, lo que optimiza la visualización de la motilidad celular para imágenes de lapso de tiempo en vivo.
   1. Suspender las células en un medio de cultivo sin suero.
   2. Añadir 5 μL de caldo DiD/ml de suspensión celular y mezclar suavemente con pipeteo. Incubar durante 20 min a 37 °C.
   3. Centrifugar la suspensión celular marcada a 800 × g a 5 °C durante 5 min.
   4. Aspire el sobrenadante y resuspenda las células en medios calientes para enjuagar.
   5. Repita este paso de centrifugación y enjuague dos veces más.
      NOTA: Si lo desea, vaya al paso 7.3.6 para crear esferoides inmediatamente después de este proceso.
3. Fabricación de esferoides celulares
   1. Calentar la solución de tripsina/ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,25% a 37 °C.
   2. Cultivo de GSC en medios GSC¹⁷ (Tabla 1) y células de gloima maligna (MG) U-118 en medio de cultivo U-118 (ver Tabla 1). Utilice un plato confluente de 10 cm para la preparación de una placa de 35 mm de esferoides. Agregue factores de crecimiento bFGF (concentración final de 10 ng / ml) y TGF-α (concentración final de 20 ng / ml) a las GSC inicialmente y luego cada 3 días.
      NOTA: Las células utilizadas en el presente estudio fueron verde GSC15-2/K72, verde GSC16-4/K72, rojo U-118/L1LE/mCherry2x y rojo U-118/1879/mCherry2x. Una placa de esferoides debería ser suficiente para dos placas de 6 pocillos de cortes de cerebro en inserciones de membrana.
   3. Enjuague las células de las placas con PBS estéril y coloque 1 ml de solución de tripsina en un plato de 10 cm. Coloque en la incubadora de cultivo celular durante 2-3 minutos hasta que las células comiencen a desprenderse.
   4. Inactivar la tripsina añadiendo 10 ml de medios de cultivo apropiados que contengan suero en la placa de 10 cm y separar las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Coloque la suspensión celular en un tubo de centrífuga cónica de 15 ml.
   5. Granular las células por centrifugación a 800 × g durante 5 min a 4 °C.
   6. Aspirar los medios de la gránula celular y resuspender las células en 10 ml de medio.
   7. Coloque 2 ml de suspensión celular en cada plato recubierto de poli-HEMA de 35 mm y agregue 2 ml más de medio apropiado para obtener 4 ml de medio total por plato. Si utiliza SGC, agregue factores de crecimiento.
   8. Incubar las células en una incubadora de células hasta que los agregados alcancen un tamaño de 100-200 μm, que podría ser de 1-2 días dependiendo de la densidad de las células que fueron plateadas.

8. Disección cerebral de embrión de pollo vivo y corte de corte de tejido vibratorio

1. Preparación para la disección
   1. Prepare una placa de inserción de membrana de poliéster de 6 pocillos con 1 ml de medios de cultivo de corte de cerebro (consulte la Tabla 1) debajo del inserto de membrana.
   2. Esterilice el área de trabajo y las herramientas con etanol al 70%.
   3. Coloque la placa de inserción de 6 pocillos sobre hielo mientras se realiza la disección.
   4. Prepare 100 ml de medios de corte de cortadora de tejido vibrante (Tabla 1) y colóquelos en hielo.
   5. Coloque un vial de agarosa de bajo punto de fusión al 4% en PBS en un baño de agua hasta que se derrita en un líquido (aproximadamente 50 ° C).
   6. Llene la tina de corte de tejido vibrante con hielo.
2. Disección cerebral de embrión de pollo aséptica E14/15
   1. Usando una vela de huevo, trace a lo largo del perímetro de la bolsa de aire sobre el embrión E14 o E15 con un lápiz y cubra el área delineada con cinta transparente.
   2. Usando tijeras curvas o finas, corte suavemente alrededor del área trazada, teniendo cuidado de no cortar la membrana embrionaria o los vasos sanguíneos, y deseche la pieza superior de la cáscara.
   3. Usando pinzas curvas, retire la membrana del espacio aéreo sobre la parte superior del embrión y localice la cabeza del embrión de pollo.
   4. Decapitar el embrión y colocar la cabeza en un plato de 10 cm con solución de CMF estéril fría. Véase la figura complementaria 2.
   5. Usando pinzas finas estériles, retire la piel que cubre el cerebro para revelar la duramadre subyacente. Retire los huesos del cráneo en formación en los lados izquierdo y derecho del cerebro. Los huesos del cráneo en formación aún no cubren la mayor parte del cerebro.
   6. Use suavemente pinzas puntiagudas finas (# 5 o # 55) para rasgar las meninges que recubren el centro del cerebro y pelarlo a cada lado para descubrir el cerebro.
   7. Usando pinzas curvas finas, levante el cerebro desde la parte inferior frontal y sáquelo suavemente de su cavidad.
   8. Diseccionar el cerebro en sus tres partes principales: cerebro anterior, mesencéfalo (tecta óptica), cerebelo. Consulte un atlas del desarrollo de pollitos, si es necesario.
   9. Retire la piamadre suprayacente de la tecta con pinzas finas.
      NOTA: La pia se separa fácilmente de la tecta, pero no del cerebro anterior o el cerebelo. La pia se puede quitar del cerebro anterior tocándola o enrollándola sobre una gasa estéril.
   10. Coloque las regiones cerebrales diseccionadas en un pequeño plato estéril sobre hielo.
3. Incrustar y cortar el cerebro
   1. Usando pinzas curvas como cuchara, levante suavemente el tectum óptico o la región del cerebro anterior y seque ligeramente en una gasa estéril para eliminar el líquido adicional para garantizar la adhesión de la agarosa a la superficie externa del cerebro.
   2. Con una pipeta de transferencia estéril, llene el molde con agarosa de bajo punto de fusión. Prepare un molde simple formando papel de aluminio alrededor de un objeto del tamaño adecuado. El pequeño bloque de corte de tejido vibratorio de metal rectangular se usa rutinariamente como objeto. Véase la figura complementaria 3.
   3. Coloque rápidamente la región del cerebro en agarosa y deje que se solidifique (aproximadamente 4-5 min) en hielo.
      NOTA: El cerebro puede hundirse hasta el fondo del molde antes de que la agarosa se endurezca. Si esto ocurre, espere 1 minuto para dejar que el agar comience a cuajar, y luego coloque la región del cerebro en la agarosa. Trate de suspender la región del cerebro directamente en el medio de la agarosa.
   4. Retire el papel de aluminio de alrededor del cerebro incrustado en la agarosa solidificada y recorte el exceso de agarosa alrededor de los lados con una cuchilla de afeitar estéril o bisturí.
   5. Coloque una gota de pegamento de cianoacrilato en el cuadrado de acero inoxidable del plato / bandeja de corte, coloque el bloque de agarosa con el cerebro y deje que el pegamento se adhiera durante 1 minuto. Coloque el plato / bandeja en el mandril de corte de tejido vibrante, apriete y llene la bandeja con medios de corte para cubrir la parte superior del bloque de agarosa.
   6. Corte las secciones en una cortadora de tejido vibrante a 250-350 μm con un cuchillo de zafiro, que se ha informado que resulta en menos daño al tejido vivo que una hoja de afeitar de acero.
   7. A medida que las rebanadas de cerebro se cortan y flotan libremente en la bandeja de corte, use una espátula estéril para recoger y quitar la rebanada de la bandeja. Deslice suavemente la sección fuera de la espátula y sobre un inserto de membrana usando otra espátula estéril.
      NOTA: Normalmente, se pueden colocar dos o tres cortes de cerebro en cada inserto de membrana, si se desea. La agarosa que rodea el corte del cerebro puede desprenderse si el cerebro no está lo suficientemente borrado con una gasa estéril para eliminar el exceso de líquido. Si esto todavía ocurre después de suficiente secado antes de incrustar, levante suavemente la rodaja sin la agarosa circundante y deslícela sobre el inserto de membrana.
   8. Coloque la placa de 6 pocillos de cortes de cerebro en insertos de membrana en la incubadora de cultivo celular a 37 °C y 5% de_CO2.
   9. El día después del chapado, utilice una pipeta estéril Pasteur para aspirar el medio desde debajo del inserto (hay huecos en los lados de los insertos para permitir que una pipeta acceda al medio que se encuentra debajo). Agregue 1 ml de rebanada fresca a cada pocillo debajo del inserto de membrana. Continúe cambiando los medios cada dos días a partir de entonces.
   10. Espere unos días para que las rebanadas de cerebro se adhieran firmemente a los insertos de membrana y parezcan aplanarse un poco. Esta es una señal de que las rebanadas son viables y están listas para la introducción de células GBM.

9. Introducción de células GBM en cortes de cerebro

1. Método esferoide
   1. Después de que los esferoides celulares hayan alcanzado un tamaño de 150-200 μm, use una micropipeta de 20 μL ajustada a 5 μL para eliminar uno o varios esferoides de su placa de cultivo. Véase la figura complementaria 3.
   2. Expulse suavemente los medios con esferoides sobre el corte cerebral deseado.
      NOTA: Los esferoides celulares deben ser visibles en la punta de la pipeta. El uso de una punta de pipeta transparente hará que sean más fáciles de ver en la punta. Si el esferoide se cae de la rebanada del cerebro cuando se libera el líquido, se debe usar una pestaña esterilizada con etanol pegada a un palo aplicador de madera delgada para empujar suavemente el esferoide hacia la rebanada cerebral.
   3. Permita que los esferoides crezcan en las rebanadas del cerebro durante 2-5 días.
      NOTA: La limitación aquí parece ser la eventual degradación de los vasos sanguíneos y las células cerebrales en el corte. Los vasos sanguíneos degradados aparecerán como bolas discontinuas en la rebanada cuando se tiñen de laminina.
2. Método de punción de biopsia
   1. Permita que las rebanadas de cerebro se adhieran al parecer aplanarse en el inserto de membrana (puede tomar de 2 a 5 días en cultivo).
   2. Descongele la matriz celular en hielo.
   3. En el gabinete de bioseguridad del cultivo celular, conecte un punzón de biopsia estéril de 1 mm de diámetro a un tubo aspirador de vacío.
   4. Toque suavemente el corte de cerebro con el punzón de biopsia para crear un orificio de 1 mm en el centro del corte de cerebro.
      NOTA: El tejido en el punzón de biopsia será aspirado en el punzón por la aspiradora.
   5. Preparar una suspensión de matriz celular tripsinizando una placa confluente de 10 cm de células al 60% -70% y resuspendiendo en 10 ml de medios; luego, mezcle 1 ml de esa suspensión con 100 μL de matriz.
   6. Con una micropipeta de 20 μL, coloque 1 μL de la mezcla de la matriz celular en cada orificio de las rebanadas cerebrales.
   7. Una vez finalizada la colocación de la mezcla celular, coloque el plato de cortes de cerebro con células incrustadas nuevamente en la incubadora y permita que la matriz se solidifique y las células invadan potencialmente la rebanada cerebral circundante.

10. Microscopía time-lapse de fluorescencia de campo amplio

1. Coloque cinta extraíble alrededor del borde de la placa de 6 pocillos para evitar la evaporación del medio, dejando un pequeño espacio en un lado para el intercambio de gases.
2. Coloque las placas en una cámara de cultivo personalizada en una plataforma automatizada ajustable en un microscopio de epifluorescencia invertida.
   NOTA: La cámara se mantuvo en condiciones atmosféricas de 5% de_CO2 y 95% de aire utilizando un controlador de inyección de gas, y la temperatura se mantuvo a 37 °C con un controlador de temperatura de aire caliente y un inserto de etapa de temperatura controlada. Ver Fotos et ^al.18 para detalles del sistema utilizado aquí.
3. Utilizando un software de control de microscopio adecuado, cree un programa de adquisición de lapso de tiempo que recopile imágenes fluorescentes de las áreas de interés una vez cada 10 minutos durante 20 h.
   NOTA: Si se usa una etiqueta fluorescente verde en las células (por ejemplo, proteína fluorescente verde [GFP]), use la cantidad mínima de luz de excitación azul requerida para visualizar las células para prevenir la fototoxicidad. Las etiquetas rojas (por ejemplo, mCherry) y rojas lejanas (por ejemplo, DiD) no parecen tener este problema potencial debido a la excitación de longitud de onda más larga.

11. Inmunotinción de cortes de cerebro después de microscopía de lapso de tiempo

NOTA: Este protocolo de inmunotinción está optimizado para teñir vasos sanguíneos con laminina y núcleos con bisbenzimida. Utilice anticuerpos apropiados para la(s) molécula(s) deseada(s) de interés.

1. Aspire el medio desde debajo del inserto de membrana con una pipeta Pasteur y coloque 1 ml de PFA al 2% en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M debajo del inserto y 1 ml encima del inserto para cubrir el corte cerebral. Deje que las rodajas se fijen durante la noche a 4 °C.
2. Retire el fijador de debajo del inserto de membrana y cualquier fijador que quede en el corte del cerebro (el fijador tiende a filtrarse a través del inserto de membrana en el pozo de abajo).
3. Retire el inserto con rodajas del pocillo de 35 mm y colóquelos en un plato de plástico más grande.
4. Prepare una placa de 24 pocillos agregando 350 μL de PBS en tantos pocillos como cortes de cerebro (una rebanada/pocillo cuando se inmuntiñe).
   1. Usando una espátula delgada, retire suavemente la agarosa de alrededor de la rebanada del cerebro sin separar la rebanada cerebral del inserto de membrana. Asegúrese de que la agarosa se desprenda del borde exterior de la rebanada del cerebro fácilmente. Si no, deje la agarosa unida a la rebanada del cerebro.
   2. Usando un bisturí afilado, corte a través de la membrana alrededor del corte del cerebro hasta que el corte con la membrana subyacente esté libre del resto del inserto. Levante la membrana con el corte de cerebro adjunto, usando pinzas finas para agarrar la membrana, y colóquela en un pocillo de la placa de 24 pocillos en PBS.
5. Enjuague las rodajas 3 veces con PBS durante 1 h en la cámara frigorífica con agitación o balanceo suave constante, de modo que la rebanada se mueva dentro del pozo.
6. Mientras se enjuaga, prepare la solución primaria de anticuerpos.
   1. Diluir la antilaminina a 2 μg/ml en PBSTG (ver Tabla 1).
7. Retire el PBS de los pocillos e incube durante la noche en solución de anticuerpos primarios en una habitación fría con agitación suave.
8. Después de al menos 20 h de incubación, aspirar la solución de anticuerpos primarios y enjuagar las secciones 3 veces durante 1 h en PBSTG.
9. Mientras se enjuaga, prepare la solución de anticuerpos secundarios.
   1. Diluir el GAM fluorescente con el fluorocromo específico necesario para una dilución 1:200 en PBSTG junto con una concentración de 0,1 μg/ml de bisbenzimida.
   2. Retire PBSTG e incube durante la noche en una habitación fría con agitación en la solución de anticuerpos secundarios fluorescentes.
   3. Retire el anticuerpo secundario y enjuague 2 veces durante 1 h en PBSTG y 1 vez más de 1 h en PBS.
   4. Dejar en PBS hasta que esté listo para montar en portaobjetos de microscopio (sección 5) y ver.

Resultados

Aquí se presentan múltiples figuras para mostrar algunos resultados representativos que se obtuvieron al realizar inyecciones in vivo en el tectum óptico (Figura 1 y Figura 2), cultivar cortes de cerebro vivos y evaluar su viabilidad (Figura 3), crear cultivos de cortes cerebrales ex vivo e implantar células marcadas con fluorescencia utilizando el método de punzón de biopsia (Figura 4), generar esferoides celulares mediante el cultivo de células en poli-HEMA (Figura 5), creando cocultivos de cortes cerebrales ex vivo con esferoides celulares y registrando el comportamiento celular invasivo utilizando microscopía confocal de lapso de tiempo 4D (Figura 6), y analizando el comportamiento celular invasivo de los esferoides en relación con los vasos sanguíneos en preparaciones de cortes cerebrales fijos (Figura 7 y Figura 8). Estos resultados no son de ninguna manera exhaustivos, sino que proporcionan buenos ejemplos de lo que se puede obtener utilizando el cerebro del embrión de pollo como modelo de xenoinjerto para la investigación del GBM humano.

La Figura 1 muestra algunos resultados representativos de tumores que se formaron en el tectum óptico in vivo después de la inyección de GSCs que expresan GFP. Las GSC se adhieren a la superficie ventricular y forman tumores invasivos en la pared cerebral. Las GSC residen claramente cerca de los vasos sanguíneos y parecen estar migrando a lo largo de ellos. Las películas de renders de volumen 3D rotativo de cortes fijos e inmunoteñidos de tumores GSC in vivo se dan en el video suplementario S1, el video suplementario S2, el video suplementario S3 y el video complementario S4. En este experimento, se utilizaron cuatro colores para identificar cinco características (GSC verdes, núcleos blancos, vasos sanguíneos blancos, integrina alfa-6 azul y Sox2 rojo o nestina roja).

La Figura 2 muestra algunos resultados representativos de tumores que se formaron en el tectum óptico in vivo después de la inyección de GSCs que expresan GFP mezclado con células U-118/L1LE² que expresan mCherry debido a la transducción del vector retroviral. Estos experimentos revelaron que a medida que estos tumores se formaban a partir de una suspensión de células mixtas, la clasificación se produjo de tal manera que las GSC residían en la periferia o en el centro, mientras que las células U-118 comprendían un núcleo interno o una corteza externa, dependiendo de la línea GSC específica.

La Figura 3 muestra los resultados de viabilidad de cultivos de cortes cerebrales ex vivo . Después de 1 semana en cultivo, la fijación y la inmunotinción para laminina revelaron muchos vasos sanguíneos intactos y la expresión de Sox2, los cuales se utilizaron aquí para demostrar la viabilidad del corte cerebral. Esto demostró que las rebanadas de cerebro de embriones de pollo podrían cultivarse en insertos de membrana durante aproximadamente 2 semanas y permanecer viables con vasos sanguíneos de apariencia normal y expresión de factores de transcripción.

La Figura 4 muestra los resultados de la introducción de "tapones" de células rojas U-118/L1LE/mCherry (mezcladas con matriz) en cortes de cerebro ex vivo después de crear cavidades en los cortes utilizando el método de punzón de biopsia. Las células U-118 invadieron claramente el tejido cerebral, a veces extensamente, y a menudo a lo largo de los vasos sanguíneos. Sin embargo, la invasión celular no fue uniforme alrededor de la circunferencia de las células introducidas. Los vasos sanguíneos a veces también parecían dañados o ausentes en ciertas rebanadas, presumiblemente debido al trauma adicional del método de punzón o la cantidad de tiempo en cultivo. Esto demostró que el método de punzón de biopsia / tapón celular podría usarse para introducir células GBM en ubicaciones específicas en un corte cerebral cultivado ex vivo , después de lo cual las células invaden el corte cerebral.

La Figura 5 muestra esferoides vivos en cultivo y varios ejemplos de fluorescencia de campo amplio de esferoides de células GBM vivas introducidos en cortes cerebrales ex vivo para experimentos de lapso de tiempo. Las películas de invasión celular de los esferoides en el corte cerebral se dan en el Video Suplementario S5 y el Video Suplementario S6. Esto demostró que los esferoides celulares son otro método exitoso para introducir células GBM o GSC en ubicaciones específicas de un corte cerebral ex vivo, y el comportamiento celular invasivo puede ser monitoreado por microscopía de fluorescencia de campo amplio, aunque la resolución de las células individuales puede ser pobre.

La Figura 6 muestra imágenes estáticas de experimentos confocales de lapso de tiempo de GSC16-4/GFP en vivo e invasión de células U-118/L1LE/mCherry en cortes cerebrales. Las imágenes confocales de la pila z se adquirieron cada 10 minutos durante un período de 20 horas en un experimento de lapso de tiempo multipunto. Las películas de invasión celular de los esferoides en cortes cerebrales tomadas como pilas z confocales a lo largo del tiempo se presentan en Video Suplementario S7, Video Suplementario S8, Video Suplementario S9, Video Suplementario S10 y Video Suplementario S11. Este experimento reveló que las imágenes confocales de lapso de tiempo fueron superiores a la fluorescencia de campo amplio para rastrear el comportamiento invasivo de las células individuales. Las células U-118/L1LE fueron notablemente más invasivas que las GSC en estas condiciones. Esto es incluso evidente en las imágenes estáticas, con las GSC ubicadas más centralmente y las células U-118 más dispersas.

La Figura 7 muestra varios ejemplos de preparaciones ex vivo de corte cerebral/esferoides, donde dos esferoides diferentes marcados por separado (esferoides U-118/L1LE/mCherry y esferoides GSC16-4/GFP) se colocaron en cortes cerebrales, cultivados durante varios días, y posteriormente fijados, inmunoteñidos para laminina y fotografiados por sección óptica en un microscopio confocal. Esto reveló que ambos tipos de células invadieron la rebanada cerebral y viajaron a lo largo de los vasos sanguíneos. Cuando los diferentes tipos de esferoides estaban lo suficientemente cerca como para ponerse en contacto entre sí, parecía haber poca o ninguna invasión de un tipo de célula en el esferoide del otro tipo de célula, y los esferoides permanecían segregados.

La Figura 8 muestra varios ejemplos de preparaciones ex vivo de corte cerebral/esferoides donde los esferoides de "tipo de células mixtas" generados en cultivo utilizando dos tipos de células marcadas de manera diferente (U-118 / L1LE / mCherry mezclado con GSC16-4 / GFP) se colocaron en cortes cerebrales, se cultivaron durante varios días y posteriormente se fijaron, se inmunotiñeron para laminina y se obtuvieron imágenes mediante sección óptica en un microscopio confocal. Esto reveló que las células rojas U-118/L1LE/mCherry migraron de los esferoides y se dispersaron mucho más evidentemente que las células verdes GSC16-4/GFP, que tendían a permanecer en grupos cerca del centro de los esferoides. Además, las células U-118/L1LE/mCherry también se tiñeron con DiD para que las dos etiquetas separadas (mCherry y DiD) pudieran compararse directamente en las preparaciones ex vivo fijas. La etiqueta DiD todavía se podía detectar, incluso en células individuales que habían invadido el corte cerebral; sin embargo, esto fue como puncta intracelular.

Figura 1: Tumores en E15 resultantes de la inyección de GSCs en el tectum óptico E5 in vivo. Las GSC son verdes debido a la expresión de GFP. Las celdas GSC15-2 se muestran en los paneles A, C y E, y las celdas GSC16-4 se muestran en los paneles B, D y F. (A) Vista de bajo aumento del tectum óptico con un tumor cerca del ventrículo (V). La tinción Sox2 se muestra en rojo, que tiñe la mayoría de los núcleos de las células OT. (B) Imagen similar a A pero con celdas GSC16-4 que también están teñidas para nestin en rojo, que puede aparecer amarillo o blanco en la imagen debido a la mezcla de colores y la exposición de la imagen. Los núcleos de OT aparecen blancos debido a la contratinción con bisbenzimida. (C-F) Diferentes perspectivas de renders de volumen generados a partir de pilas z utilizando un objetivo de inmersión en aceite 60x. Los núcleos celulares aparecen blancos debido a la tinción de bisbenzimida, y algunos aparecen rojos en los paneles C y E debido a la inmunotinción para Sox2. La tinción roja en los paneles D y F proviene de la tinción para nestin. Tenga en cuenta que debido a la "mezcla alfa" para renders de volumen en el software de microscopio confocal, los colores no se mezclan como lo harían usando una proyección de intensidad máxima, y el color más frecuente predomina y oscurece el color menos intenso. Los vasos sanguíneos se tiñen de blanco debido a la inmunotinción de laminina. La tinción de la integrina alfa-6 del marcador GSC se muestra en azul y aparece punteada en las superficies de GSC. Las escalas de micras se muestran a lo largo de los bordes de los renders de volumen. Los videos de rotaciones de renders de volumen en los paneles C-F se presentan en Video Suplementario S1, Video Suplementario S2, Video Suplementario S3 y Video Suplementario S4. Barras de escala = 500 μm (A,B). Abreviaturas: GSCs = células madre de glioblastoma; OT = tectum óptico; GFP = proteína verde fluorescente; VB = vaso sanguíneo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Tumores en E15 resultantes de una mezcla de GSCs y células U-118 GBM inyectadas en el tectum óptico E5. Las GSC son verdes debido a la expresión de GFP y las células U-118 / L1LE son rojas debido a la expresión de mCherry. GSC15-2 se muestran en los paneles A-D, y GSC16-4 se muestran en los paneles E y F. (A) Plano z único confocal de bajo aumento de un tumor de células mixtas (flecha) cerca del ventrículo. Los núcleos están teñidos de blanco con bisbenzimida. (B) Mayor aumento (objetivo 10x) del tumor mostrado en A con invasión de células rojas U-118 en el OT cerca de la superficie ventricular. (C) Un plano ligeramente diferente de sección óptica del de A que muestra el tumor (flecha) incrustado más profundamente en la pared OT. (D) Proyección máxima (objetivo 20x) de múltiples planos z del tumor en C que muestra detalles de las células clasificadas dentro del tumor. (E) Imagen de plano z único (objetivo 20x) de un tumor mixto con células GSC16-4, que muestra que la clasificación dentro del tumor ocurrió en un patrón opuesto a las células GSC15-2, con las GSC verdes creando una corteza delgada y uniforme que rodea las células rojas U-118. El área de unión del tumor a la pared OT no se muestra en este plano z. Observe el área del tumor donde hay una discontinuidad de la corteza GSC con células U-118 / L1LE que sobresalen (flecha). La inmunotinción para L1CAM se muestra en azul. (F) La misma imagen que en E, pero mostrando solo las GSC verdes y la tinción L1CAM azul. Barras de escala = 500 μm (A,C), 100 μm (B,D,E,F). Abreviaturas: GSCs = células madre de glioblastoma; OT = tectum óptico; GFP = proteína verde fluorescente; V = ventrículo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Viabilidad de cortes de tectum óptico ex vivo después de 1 semana en cultivo. Las rodajas de tectum óptico E14 se cultivaron en insertos de membrana durante 1 semana y luego se fijaron e inmunotiñeron. En A y B se muestran imágenes confocales (objetivo 10x) de un corte cerebral teñido para núcleos con bisbenzimida (A) e inmunoteñido para laminina (B), que muestra claramente vasos sanguíneos normales e intactos seccionados ópticamente en varias configuraciones en virtud de la tinción de laminina. (C) Una imagen confocal similar a la que se muestra en los paneles A y B donde los núcleos y la tinción de laminina son visibles. (D) Una imagen confocal de mayor aumento (objetivo de aceite 60x) que muestra detalles de tinción nuclear y laminina. (E) Imagen de máxima proyección de pila z confocal (objetivo 20x) de corte cerebral teñido para factor de transcripción Sox2 en rojo y núcleos totales con bisbenzimida en blanco. Tenga en cuenta que la mayoría de los núcleos exhiben tinción Sox2, como se muestra in vivo (ver Figura 1). Barras de escala = 100 μm (A,B,C,E), 25 μm (D). Abreviatura: P = superficie pial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Células U-118/mCherry colocadas en un corte cerebral ex vivo mediante el método de punzón de biopsia. Las cavidades se crearon en cortes de cerebro usando un punzón de biopsia de 1 mm, y luego se implantaron células rojas U-118 / L1LE / mCherry mezcladas con matriz como un "tapón". Después de varios días, las cortes de cerebro fueron reparadas, inmunoteñidas para laminina y montadas en portaobjetos para el análisis del microscopio confocal. Los paneles A y C muestran imágenes de bajo aumento, confocales, de un solo plano z (objetivo 4x) del "tumor" resultante y las células circundantes que invadieron el corte cerebral. (B) Una representación volumétrica de una pila z de la preparación en el panel A con un aumento mayor (objetivo 20x), que muestra una invasión extensa de celdas U-118 (flecha). (D) La imagen muestra una representación de volumen similar de la parte inferior de las celdas extensamente invasoras que se muestran en el panel C. La tinción de laminina se muestra en verde, pero no hay vasos sanguíneos claros aparentes. (E) La imagen muestra parte de un tapón celular y un grupo de células que han invadido el corte cerebral, junto con la tinción de laminina para los vasos sanguíneos en azul. (F) Un mayor aumento de las células invasoras que se muestra en el panel E, y las células se pueden ver claramente alineadas a lo largo de los vasos sanguíneos (flechas). Todos los paneles muestran una contratinción nuclear blanca con bisbenzimida. Barras de escala = 500 μm (A,C), 100 μm (E,F). La escala para los paneles B y D se encuentra a lo largo de los ejes de renderizado de volumen. Abreviatura: OT = tectum óptico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Esferoides de células vivas en cultivo e imágenes de fluorescencia de campo amplio de células GBM vivas en cortes cerebrales ex vivo. En los paneles A y B se muestran imágenes de contraste de fase (utilizando un objetivo 10x en un microscopio invertido) de células GBM U-118/L1LE (A) y GSC (B) que crecen como esferoides (flechas). En el fondo del panel A se muestra la irregularidad fuera de foco del recubrimiento poli-HEMA que puede ocurrir en la placa de cultivo celular. En los paneles C-F se muestran imágenes de fluorescencia de campo amplio de esferoides de células U-118/L1LE y células invasoras (flechas) durante un experimento de lapso de tiempo para monitorear el comportamiento vivo de la invasión en los cortes ex vivo (usando un objetivo 20x en un sistema de microscopio de lapso de tiempo personalizado¹⁸). En los paneles C y E, las células se tiñen con el tinte de membrana fluorescente rojo lejano DiD, y en los paneles D y F, las células se visualizan a través de su expresión mCherry roja. Barras de escala = 100 μm. Los videos de experimentos de lapso de tiempo de fluorescencia de campo amplio que se muestran en los paneles C y D se encuentran en el Video Suplementario S5 y el Video Suplementario S6, respectivamente. Abreviaturas: GBM = glioblastoma; SGC = células madre GBM; S = esferoide. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Imágenes de renderizado de volumen de lapso de tiempo 4D confocal de GSC vivas y células GBM. En todos los paneles se muestran las imágenes de punto final de cinco injertos diferentes de esferoides de células mixtas en cortes cerebrales separados. Para los paneles A-E, se adquirieron imágenes confocales de pila z a pasos de 10 μm cada 10 minutos durante un período de 20 horas. Las preparaciones incluyeron cortes cerebrales con esferoides de células mixtas implantadas de células rojas U-118 / L1LE / mCherry y células verdes GSC16-4 / GFP. Se tomaron imágenes confocales mientras se cultivaban cortes de cerebro en insertos de membrana en una placa de cultivo celular de plástico de 6 pocillos utilizando una lente de objetivo 20x de distancia de trabajo extra larga (ELWD) (0.45 NA), que proporcionó la distancia de trabajo adicional necesaria. Los renders de volumen se generaron utilizando el software de microscopio confocal "Alpha Blending", que da un efecto 3D aparente. Los videos de lapso de tiempo de estos renders de volumen confocal a lo largo del tiempo se presentan en el Video Suplementario S7, el Video Suplementario S8, el Video Suplementario S9, el Video Suplementario S10 y el Video Suplementario S11. Abreviaturas: GBM = glioblastoma; SGC = células madre GBM; GFP = proteína verde fluorescente; NA = apertura numérica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Imágenes confocales de cortes cerebrales fijos con células GBM invasivas de esferoides de diferentes tipos de células. Los esferoides verdes estaban compuestos por células GSC16-4/GFP y los esferoides rojos estaban compuestos por células U-118/L1LE/mCherry. En los paneles A-F se muestran diferentes vistas de cortes cerebrales, en los que se cultivaron múltiples esferoides rojos y verdes durante varios días antes de la fijación e inmunotinción de laminina (azul). Los paneles A-C son de la misma porción OT donde se tomó A con un objetivo 4x, y los paneles B y C son renders de mayor volumen de aumento (objetivo 20x) de células que invadieron el corte cerebral de dos de los esferoides que se muestran en el panel A. Ambos tipos de células invadieron claramente el tejido a lo largo de los vasos sanguíneos. El panel D muestra una representación de volumen (objetivo 20x) de una rebanada cerebral diferente donde dos esferoides diferentes se ubicaron muy juntos, y se ven células de ambos migrando a lo largo del mismo vaso sanguíneo que se encuentra entre ellos (flecha). El panel E es un volumen de alto aumento (objetivo de aceite 60x) que revela que las células verdes están migrando a lo largo de la superficie exterior del vaso sanguíneo, mientras que el glóbulo rojo está migrando dentro del vaso sanguíneo (flecha). El recuadro muestra una sola sección óptica del plano z, donde el glóbulo rojo está claramente rodeado por la tinción azul del vaso sanguíneo (flecha), y la célula verde está claramente fuera del vaso sanguíneo. Barra de escala en recuadro = 50 μm. El panel F muestra una representación de volumen (objetivo 10x) de una rebanada del cerebro anterior con dos esferoides de diferentes colores estrechamente colocados. Muy poca invasión celular, si es que hubo alguna, ocurrió de un esferoide al otro, y existía un límite agudo entre ellos. Los paneles A, B, C y E también muestran una contratinción nuclear blanca con bisbenzimida. Barra de escala = 500 μm (A). Las escalas para los paneles B-F se encuentran a lo largo de los ejes de renderizado de volumen. Abreviaturas: GBM = glioblastoma; SGC = células madre GBM; GFP = proteína verde fluorescente; OT = tectum óptico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Imágenes confocales de cortes cerebrales fijos con células GBM invasivas de esferoides y esferoides de células mixtas marcadas con DiD. Los paneles A-D muestran representaciones de volumen de cortes de cerebro que contenían esferoides de células mixtas compuestas de células verdes GSC16-4 / GFP y células rojas U-118 / L1LE / mCherry. Numerosas células rojas U-118 se dispersaron de los esferoides e invadieron el corte cerebral en todas las direcciones, mientras que las GSC verdes no se dispersaron y permanecieron en las ubicaciones centrales de los esferoides. Los paneles E y F muestran una preparación de rebanada ex vivo con esferoides rojos U-118/L1LE/mCherry también etiquetados con colorante de membrana rojo lejano DiD (mostrado como azul). Después de la fijación, la rebanada se inmunotiñó para laminina en verde. La etiqueta DiD era visible en los glóbulos rojos como tinción puntiaguda (flechas) y era visible incluso en las células que se habían dispersado de los esferoides a lo largo de los vasos sanguíneos. La contratinción nuclear con bisbenzimida no se muestra en esta figura, por lo que la otra tinción es más claramente visible. Barras de escala = 100 μm (E,F). Abreviaturas: GBM = glioblastoma; SGC = células madre GBM; GFP = proteína verde fluorescente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Medio/solución	Composición
Medios de comunicación de la SGC	Mezcla 1:1 de DMEM/F12, suero fetal bovino al 1% (FBS), tampón HEPES 15 mM, L-glutamina 2 mM, 100 μg/ml de penicilina-estreptomicina (pluma/estreptomica), suplemento de B27 al 2% sin vitamina A y heparina de 2,5 μg/ml.
Medios GBM	DMEM (glucosa alta), 10% FBS, pluma/estreptococo y 2 mM de L-glutamina.
Tampón de fijación	PFA al 2% en tampón de cacodilato de sodio 0.1 M
Medio de incrustación	3,5% de agar y 8% de sacarosa en PBS
PBSTG	0.1% Triton X-100 + 5% suero normal de cabra (NGS) en PBS
Medio de cultivo celular U-118 MG	DMEM + 10% FBS + pluma/estreptococo + L-glutamina
Medios de cultivo de corte cerebral	50% MEM + 25% HBSS + 25% Suero de caballo + B27 + pluma/estreptococo + L-glut + 15 mM TAMPÓN HEPES
Medios de corte de cortadora de corte de tejido vibrante	Medio 199 + pluma/estreptococo + 15 mM TAMPÓN HEPES

Tabla 1: Composición de medios y buffers utilizados en este protocolo.

Figura complementaria 1: Inyección en el tectum óptico E5. (A) Después de cortar un agujero en la cáscara del huevo sobre el espacio de aire, y la membrana del espacio de aire se humedece con solución salina o medios, la membrana se retira con pinzas finas. (B) Para inyectar células en el tectum óptico, el amnios se pellizca y se sujeta con pinzas finas para posicionar la cabeza de modo que el tectum óptico sea accesible.  A continuación, la micropipeta se inserta en el tectum óptico y se inyectan células a presión en él. (C) Después de la inyección de células, se agregan unas gotas de solución de ampicilina sobre el embrión con una jeringa y una aguja fina. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Disección de regiones cerebrales E15. (A) Después de la decapitación, la cabeza del embrión E15 se coloca en un plato con solución estéril de CMF. (B) La piel que recubre el cerebro se extrae con fórceps finos. (C) Los dos huesos del cráneo se extraen de los dos hemisferios del cerebro anterior (FB). (D) La duramadre del tejido conectivo se retira suavemente de rodear el cerebro anterior (FB), el tectum óptico y el cerebelo. (E) Luego se extrae todo el cerebro de la cabeza sacándolo suavemente de la cavidad cerebral desde abajo usando fórceps curvos. (F ) Se muestra la vista dorsal de todo el cerebro extirpado con prosencéfalo (FB), tectum óptico (OT) y cerebelo (CB). (G ) Luego, el cerebro aislado se disecciona en el cerebro anterior (FB), los hemisferios del tectum óptico (OT) y el cerebelo (CB) con tijeras finas. (H ) La delicada pia del tejido conectivo se extrae fácilmente de los hemisferios del tectum óptico (OT) utilizando pinzas finas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Incrustación y corte del tectum óptico E15 y colocación de esferoides celulares. (A) Un hemisferio tectum óptico se sumerge en agarosa de bajo derretimiento utilizando pinzas curvas. (B) Después de que la agarosa se endurezca en hielo, el bloque que contiene el tectum óptico se recorta y se pega al pedestal de acero inoxidable en el plato / bandeja de corte. (C) Después de que el pegamento se seque, el plato / bandeja de corte se coloca en el mandril de la cortadora de tejido vibrante y se llena con medios de corte en frío.  Las rodajas se cortan con el cuchillo de zafiro del bloque de tejido sumergido.  Las rodajas cortadas flotarán en el plato / bandeja y se pueden quitar con una espátula.  (D) Las rodajas cortadas se retiran del plato/bandeja y se colocan directamente sobre insertos de membrana con medios de cultivo de rodajas subyacentes en una placa de varios pocillos. (E) Después de cultivar esferoides celulares en placas recubiertas de poli-HUMA, se elimina un esferoide de la placa en una cantidad mínima de medios utilizando un micropipettor de 20 μL. (F) El esferoide aislado se coloca directamente sobre el corte del cerebro en el medio mínimo. (G) Si el esferoide se cae de la rebanada cerebral debido al flujo de los medios, entonces se puede empujar de nuevo a la rebanada cerebral usando una pestaña pegada a un palo aplicador de madera. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Supplementary Video S1: Video de renderizado de volumen de gran aumento de un pequeño tumor GSC15-2 en E15. Las GSC son verdes debido a la expresión de GFP. El vídeo corresponde a la Figura 1C y muestra las celdas GSC15-2. El video muestra la rotación de un renderizado de volumen generado a partir de una pila z utilizando un objetivo de inmersión en aceite 60x. Los núcleos celulares aparecen blancos debido a la tinción de bisbenzimida, y algunos aparecen rojos debido a la inmunotinción para Sox2. Tenga en cuenta que debido a la "mezcla alfa" para renderizados de volumen en el software de microscopio confocal, los colores no se mezclan como lo harían usando una proyección de intensidad máxima, y el color más intenso predomina y oscurece el color menos intenso. Los vasos sanguíneos se tiñen de blanco debido a la inmunotinción de laminina. La tinción de la integrina alfa-6 del marcador GSC se muestra en azul y aparece punteada en superficies verdes de GSC. Las escalas de micras se muestran a lo largo de los bordes del renderizado de volumen. Haga clic aquí para descargar este video.

Supplementary Video S2: Video del renderizado de volumen de gran aumento del tumor GSC16-4 pequeño en E15. Las GSC son verdes debido a la expresión de GFP. El vídeo corresponde a la Figura 1D y muestra las celdas GSC16-4. El video muestra la rotación de un renderizado de volumen generado a partir de una pila z utilizando un objetivo de inmersión en aceite 60x. Los núcleos celulares aparecen blancos debido a la tinción de bisbenzimida, y algunas GSC aparecen rojas debido a la inmunotinción para la nestina. Tenga en cuenta que debido a la "mezcla alfa" para renderizados de volumen en el software de microscopio confocal, los colores no se mezclan como lo harían usando una proyección de intensidad máxima, y el color más intenso predomina y oscurece el color menos intenso. Los vasos sanguíneos se tiñen de blanco debido a la inmunotinción de laminina. La tinción de la integrina alfa-6 del marcador GSC se muestra en azul y aparece punteada en superficies verdes de GSC. Las escalas de micras se muestran a lo largo de los bordes del renderizado de volumen. Haga clic aquí para descargar este video.

Supplementary Video S3: Video de renders de volumen de gran aumento de tumor GSC15-2 pequeño en E15. Las GSC son verdes debido a la expresión de GFP. El vídeo corresponde a la figura 1E y muestra las celdas GSC15-2. El video muestra la rotación de un renderizado de volumen generado a partir de una pila z utilizando un objetivo de inmersión en aceite 60x. Los núcleos celulares aparecen blancos debido a la tinción de bisbenzimida, y algunos aparecen rojos debido a la inmunotinción para Sox2. Tenga en cuenta que debido a la "mezcla alfa" para renderizados de volumen en el software de microscopio confocal, los colores no se mezclan como lo harían usando una proyección de intensidad máxima, y el color más intenso predomina y oscurece el color menos intenso. Los vasos sanguíneos se tiñen de blanco debido a la inmunotinción de laminina. La tinción de la integrina alfa-6 del marcador GSC se muestra en azul y aparece punteada en superficies verdes de GSC. Las escalas de micras se muestran a lo largo de los bordes del renderizado de volumen. Haga clic aquí para descargar este video.

Supplementary Video S4: Video de renders de volumen de gran aumento de pequeños tumores GSC16-4 en E15. Las GSC son verdes debido a la expresión de GFP. El vídeo corresponde a la figura 1F y muestra las celdas GSC16-4. El video muestra la rotación de un renderizado de volumen generado a partir de una pila z utilizando un objetivo de inmersión en aceite 60x. Los núcleos celulares aparecen blancos debido a la tinción de bisbenzimida, y algunos aparecen rojos debido a la inmunotinción para la nestina. Tenga en cuenta que debido a la "mezcla alfa" para renderizados de volumen en el software de microscopio confocal, los colores no se mezclan como lo harían usando una proyección de intensidad máxima, y el color más intenso predomina y oscurece el color menos intenso. Los vasos sanguíneos se tiñen de blanco debido a la inmunotinción de laminina. La tinción de la integrina alfa-6 del marcador GSC se muestra en azul y aparece punteada en superficies verdes de GSC. Las escalas de micras se muestran a lo largo de los bordes del renderizado de volumen. Haga clic aquí para descargar este video.

Supplementary Video S5: Video de células GBM vivas en corte cerebral ex vivo . El video corresponde a la Figura 5C y muestra imágenes de fluorescencia de campo amplio de esferoides de células U-118 / L1LE y células invasoras durante un experimento de lapso de tiempo para monitorear el comportamiento en vivo de la invasión en el corte ex vivo (usando un objetivo 20x en un sistema de microscopio de lapso de tiempo personalizado). Las células U-118/L1LE se tiñeron con el colorante de membrana fluorescente rojo lejano DiD. Las imágenes fueron adquiridas con una cámara monocromática. Haga clic aquí para descargar este video.

Video complementario S6: Video de células GBM vivas en corte cerebral ex vivo . El video corresponde a la Figura 5D y muestra imágenes de fluorescencia de campo amplio de esferoides de células U-118 / L1LE y células invasoras durante un experimento de lapso de tiempo para monitorear el comportamiento en vivo de la invasión en el corte ex vivo (usando un objetivo 20x en un sistema de microscopio de lapso de tiempo personalizado). Las células fueron fotografiadas a través de su expresión roja mCherry. Las imágenes fueron adquiridas con una cámara monocromática. Haga clic aquí para descargar este video.

Video suplementario S7: Video de volumen renderizado imágenes de time-lapse 4D confocal de GSCs vivas y células GBM. El vídeo corresponde a la figura 6A. Las imágenes confocales de pila z se adquirieron a pasos de 10 μm cada 10 minutos durante un período de 20 horas. La preparación consistió en un corte cerebral con esferoides de células mixtas implantadas de células rojas U-118 / L1LE / mCherry y células verdes GSC16-4 / GFP. Se tomaron imágenes confocales mientras se cultivaba el corte cerebral en un inserto de membrana en una placa de cultivo celular de plástico de 6 pocillos utilizando una lente objetivo ELWD 20x (0.45 NA), que proporcionó la distancia de trabajo adicional necesaria. El renderizado del volumen se generó utilizando el software de microscopio confocal "Alpha Blending", que da un efecto 3D aparente. Las escalas de micras se muestran a lo largo de los bordes del renderizado de volumen. El video se observa mejor arrastrando manualmente el control deslizante de progreso de video en el reproductor de video hacia adelante y hacia atrás para observar el movimiento de la celda en lugar de permitir que el reproductor de video continúe a su velocidad lenta normal. Haga clic aquí para descargar este video.

Video suplementario S8: Video de imágenes de renderizado de volumen de time-lapse 4D confocal de GSC vivas y células GBM. El vídeo corresponde a la figura 6B. Las imágenes confocales de pila z se adquirieron a pasos de 10 μm cada 10 minutos durante un período de 20 horas. La preparación consistió en un corte cerebral con esferoides de células mixtas implantadas de células rojas U-118 / L1LE / mCherry y células verdes GSC16-4 / GFP. Se tomaron imágenes confocales mientras se cultivaba el corte cerebral en un inserto de membrana en una placa de cultivo celular de plástico de 6 pocillos utilizando una lente objetivo ELWD 20x (0.45 NA), que proporcionó la distancia de trabajo adicional necesaria. El renderizado del volumen se generó utilizando el software de microscopio confocal "Alpha Blending", que da un efecto 3D aparente. Las escalas de micras se muestran a lo largo de los bordes del renderizado de volumen. El video se observa mejor arrastrando manualmente el control deslizante de progreso de video en el reproductor de video hacia adelante y hacia atrás para observar el movimiento de la celda en lugar de permitir que el reproductor de video continúe a su velocidad lenta normal. Haga clic aquí para descargar este video.

Supplementary Video S9: Video de volumen renderizado imágenes de time-lapse 4D confocal de GSCs vivas y células GBM. El vídeo corresponde a la figura 6C. Las imágenes confocales de pila z se adquirieron a pasos de 10 μm cada 10 minutos durante un período de 20 horas. La preparación consistió en un corte cerebral con esferoides de células mixtas implantadas de células rojas U-118 / L1LE / mCherry y células verdes GSC16-4 / GFP. Se tomaron imágenes confocales mientras se cultivaba el corte cerebral en un inserto de membrana en una placa de cultivo celular de plástico de 6 pocillos utilizando una lente objetivo ELWD 20x (0.45 NA), que proporcionó la distancia de trabajo adicional necesaria. El renderizado del volumen se generó utilizando el software de microscopio confocal "Alpha Blending", que da un efecto 3D aparente. Las escalas de micras se muestran a lo largo de los bordes del renderizado de volumen. El video se observa mejor arrastrando manualmente el control deslizante de progreso de video en el reproductor de video hacia adelante y hacia atrás para observar el movimiento de la celda en lugar de permitir que el reproductor de video continúe a su velocidad lenta normal. Haga clic aquí para descargar este video.

Video Suplementario S10: Video de imágenes de renderizado de volumen de time-lapse 4D confocal de GSCs vivas y células GBM. El vídeo corresponde a la Figura 6D. Las imágenes confocales de pila z se adquirieron a pasos de 10 μm cada 10 minutos durante un período de 20 horas. La preparación consistió en un corte cerebral con esferoides de células mixtas implantadas de células rojas U-118 / L1LE / mCherry y células verdes GSC16-4 / GFP. Se tomaron imágenes confocales mientras se cultivaba el corte cerebral en un inserto de membrana en una placa de cultivo celular de plástico de 6 pocillos utilizando una lente objetivo ELWD 20x (0.45 NA), que proporcionó la distancia de trabajo adicional necesaria. El renderizado del volumen se generó utilizando el software de microscopio confocal "Alpha Blending", que da un efecto 3D aparente. Las escalas de micras se muestran a lo largo de los bordes del renderizado de volumen. El video se observa mejor arrastrando manualmente el control deslizante de progreso de video en el reproductor de video hacia adelante y hacia atrás para observar el movimiento de la celda en lugar de permitir que el reproductor de video continúe a su velocidad lenta normal. Haga clic aquí para descargar este video.

Video suplementario S11: Video de imágenes de renderizado de volumen de time-lapse 4D confocal de GSCs vivas y células GBM. El vídeo corresponde a la figura 6E. Las imágenes confocales de pila z se adquirieron a pasos de 10 μm cada 10 minutos durante un período de 20 horas. la preparación incluyó un corte cerebral con esferoides celulares mixtos implantados de células rojas U-118 / L1LE / mCherry y células verdes GSC16-4 / GFP. Se tomaron imágenes confocales mientras se cultivaba el corte cerebral en un inserto de membrana en una placa de cultivo celular de plástico de 6 pocillos utilizando una lente objetivo ELWD 20x (0.45 NA), que proporcionó la distancia de trabajo adicional necesaria. El renderizado del volumen se generó utilizando el software de microscopio confocal "Alpha Blending", que da un efecto 3D aparente. Las escalas de micras se muestran a lo largo de los bordes del renderizado de volumen. El video se observa mejor arrastrando manualmente el control deslizante de progreso de video en el reproductor de video hacia adelante y hacia atrás para observar el movimiento de la celda en lugar de permitir que el reproductor de video continúe a su velocidad lenta normal. Haga clic aquí para descargar este video.

Discusión

Los pasos críticos en el protocolo para la inyección de células en el ventrículo del mesencéfalo (tectum óptico) incluyen no dañar los vasos sanguíneos en la membrana corioalantoidea en el óvulo o rodear al embrión antes y durante la inyección, aunque la membrana amnios que rodea inmediatamente al embrión se puede tirar suavemente y mantener para posicionar la cabeza al inyectar las células en el mesencéfalo. El amnios es relativamente duro y se puede tirar con fórceps finos para posicionar la cabeza y mantenerla firme con una mano, para la inyección de células con la otra mano en el tectum óptico, que es la estructura grande y redonda en el centro del cerebro. Generalmente, la viabilidad de los embriones inyectados oscila entre el 25% y el 75%, dependiendo de factores desconocidos, y prácticamente todos los embriones que sobreviven contienen al menos un pequeño tumor en el tectum óptico. Los pasos críticos para generar cortes cerebrales viables incluyen secar el tejido del exceso de líquido para que la agarosa se adhiera al cerebro durante el corte y para mantener el tejido y las rodajas frías hasta que se coloquen en el inserto de la membrana. Como los diferentes tipos de células forman esferoides de manera diferente (en velocidad y tamaño), la densidad celular en placas poli-HEMA y el tiempo antes de cosechar los esferoides deben optimizarse para cada tipo de célula.

El trabajo aquí no ha sido objeto de un estudio longitudinal formal de la viabilidad del corte cerebral. Yang et al. utilizaron cultivos de cortes de cerebro de embrión de pollo similares a los utilizados aquí y mostraron buena viabilidad de los cortes durante al menos 7 días¹⁶. Trabajos anteriores mostraron que cuando el tejido de OT se mantuvo en medios subóptimos, aparecieron muchos núcleos picnóticos en el tejido, lo que no ocurrió en las rodajas en el trabajo aquí. Además, cuando las rebanadas degeneran en condiciones subóptimas, los vasos sanguíneos se fragmentan y aparecen como filas de esferas positivas para laminina (no se muestra). Por lo tanto, aunque la viabilidad aquí no ha sido verificada por métodos como la electrofisiología o la expresión activa de caspasa-3, ninguno de los indicadores de muerte celular que se observaron en condiciones de cultivo subóptimas apareció aquí.

El OT se ha centrado en experimentos de tumores cerebrales in vivo porque es la región más fácil de inyectar con el ventrículo más grande. En E5, que es el último día en que el embrión es lo suficientemente pequeño como para permanecer accesible sobre la yema, las inyecciones deben realizarse en un ventrículo, ya que todas las regiones del cerebro no son más que una zona ventricular delgada. Sin embargo, estas inyecciones resultan con éxito en tumores incrustados con células que invaden el parénquima cerebral. A veces, los tumores resultantes se encuentran en el cerebro anterior o el cerebelo, pero esto no es común. Las rebanadas ex vivo de tectum óptico E15 se han utilizado principalmente para experimentos aquí, de modo que los resultados del cocultivo ex vivo se pueden correlacionar con los experimentos de inyección in vivo . Sin embargo, los cortes del prosencéfalo también son adecuados y tienen un área de superficie más grande y un ventrículo muy delgado en comparación con el tectum óptico, lo que podría hacer que el cerebro anterior sea más adecuado para cocultivos ex vivo que no se correlacionan con inyecciones in vivo .

Se ha demostrado aquí que las inyecciones in vivo , seguidas de la fijación de tejidos, la sección de cortadoras de tejido vibratorias y la inmunotinción para laminina y otros marcadores, dieron como resultado imágenes de alta resolución de células GBM y GSC en tejido cerebral muy cerca de los vasos sanguíneos. La capacidad de determinar las interrelaciones entre las células tumorales y los vasos sanguíneos se facilitó enormemente mediante la creación de renders de volumen 3D a partir de pilas z de secciones ópticas confocales utilizando el software confocal y las instrucciones del fabricante. Fueron posibles las imágenes de lapso de tiempo utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio de células marcadas con GFP, mCherry y DiD; Sin embargo, las células migratorias que estaban muy cerca de los esferoides altamente fluorescentes a veces estaban oscurecidas por el "resplandor" del esferoide. Este efecto no deseado se puede minimizar ajustando cuidadosamente los tiempos de exposición para recopilar imágenes de campo amplio. Las imágenes de lapso de tiempo utilizando pilas z confocales a lo largo del tiempo (4D) eliminaron el brillo desenfocado de los esferoides y dieron como resultado células migratorias claramente definidas con un fondo oscuro. Esto no se describió en el protocolo, pero se llevó a cabo de manera similar a las imágenes de lapso de tiempo de campo amplio, que se realizaron mientras los cortes de cerebro estaban en los insertos de membrana transparente en una placa de plástico de 6 pocillos. Aunque las imágenes de lapso de tiempo confocal dan como resultado imágenes marcadamente más claras de células individuales y su comportamiento, un experimento de lapso de tiempo multipunto que recopila pilas z de 10 planos z / punto, a intervalos de 10 minutos durante un período de 20 horas, es un uso extensivo de los galvanómetros de cabezal de escaneo. Como esto podría disminuir significativamente la vida útil de los galvanómetros, este método se usa juiciosamente.

Aunque el sistema de embrión de pollo es muy adecuado tanto para la inyección in vivo como para experimentos de cocultivo ex vivo que investigan el comportamiento de las células GBM, existen varias limitaciones para este sistema modelo. Al igual que con cualquier sistema de xenoinjerto, el entorno en el que se implantan las células humanas no es el cerebro humano, pero el comportamiento de las células GBM parece imitar el de los modelos de roedores y en los pacientes humanos. Después de realizar experimentos de inyección in vivo en E5, normalmente se permite que los tumores se formen durante 10 días, hasta E15. Esto claramente no es tiempo suficiente para estudiar todos los aspectos de la tumorigénesis y la invasión celular. Sin embargo, se ha demostrado aquí que los tumores sólidos se forman en el parénquima cerebral, las células interactúan y se reorganizan dentro del tumor, y la invasión cerebral significativa ocurre tanto a lo largo de los vasos sanguíneos como difusamente dentro de este período de tiempo relativamente corto. Otra limitación del sistema embrionario de pollo in vivo es que no es adecuado para medicamentos u otros tratamientos debido a la yema grande y el sistema circulatorio extraembrionario que opera durante el desarrollo del embrión de pollo. Los tratamientos tópicos con medicamentos líquidos darían como resultado una concentración altamente variable y desconocida en el cerebro debido a la difusión del embrión hacia la masa vitelina mucho más grande. Del mismo modo, la inyección intravenosa de drogas en el muy delicado sistema circulatorio extraembrionario se filtraría o difundiría fuera de los vasos sanguíneos y también daría lugar a concentraciones desconocidas en el cerebro. Esta es una de las principales razones por las que se adoptó el método de cultivo de cortes ex vivo , para que no solo se pudiera observar y rastrear el comportamiento celular a través de microscopía de lapso de tiempo, sino también para que los tratamientos que han tenido éxito en alterar el comportamiento de las células GBM en una placa⁴ puedan probarse en un entorno de tejido cerebral más relevante.

El desarrollo del sistema modelo de tumor cerebral ortotópico de embrión de pollo se considera una adición significativa a los sistemas y herramientas disponibles para el estudio de la formación de tumores GBM y el comportamiento celular invasivo. Es probable que los huevos de gallina fertilizados estén fácilmente disponibles en la mayoría de las áreas, son baratos en comparación con los roedores, no hay costos de cuidado de los animales, los embriones son muy resistentes y resistentes a las infecciones (es decir, la mayoría del trabajo se realiza en una mesa de trabajo), los embriones son altamente manipulables y se pueden cultivar en cultivo sin cáscara¹⁹, y los embriones de pollo no se consideran animales vertebrados y, por lo tanto, no requieren la aprobación de IACUC según las pautas de los NIH (requisitos institucionales). puede variar). Por lo tanto, estas múltiples ventajas hacen que el sistema de embriones de pollo sea muy atractivo si uno limita sus preguntas y experimentos a aquellos que caen dentro de sus limitaciones. Múltiples estudios de células GBM han sido realizados por otros utilizando el embrión de pollo, pero estos han utilizado casi exclusivamente la membrana corioalantoidea (CAM) del embrión 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 y el brote de la extremidad ³⁰, y no el cerebro. También ha habido un informe de implantación de meduloblastoma en el cerebro del pollo en E2³¹. Sin lugar a dudas, el uso del embrión de pollo como un sistema modelo de xenoinjerto ortotópico, como se describe aquí, debería arrojar resultados que son mucho más significativos para la biología tumoral del GBM humano que los estudios que utilizan el CAM.

Aunque estos estudios solo han comenzado a utilizar completamente el sistema modelo de tumor cerebral de embrión de pollo para estudios de células GBM humanas y comportamiento de GSC, se espera que otros amplíen los usos y encuentren más aplicaciones potenciales. Uno podría imaginar que este sistema no solo descubrirá mecanismos que regulan la formación de tumores GBM y el comportamiento celular, sino que también permitirá pruebas preclínicas de medicamentos y sustancias específicas en células específicas de pacientes. Por ejemplo, si los cultivos de cortes de cerebro se establecieran de antemano, entonces las células tumorales, las piezas de resecciones quirúrgicas de tumores o los organoides GBM derivados del paciente³² podrían colocarse directamente en cocultivo ex vivo , y varios tratamientos podrían evaluarse en cuestión de días. Del mismo modo, las células disociadas del paciente podrían inyectarse directamente en el mesencéfalo E5 in ovo para evaluar su capacidad para formar tumores e invadir el parénquima cerebral. Por lo tanto, se espera que las descripciones de los métodos y los resultados representativos aquí faciliten y fomenten un mayor uso de este sistema altamente infrautilizado para la investigación del cáncer cerebral.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Perforadora de papel de agujero cuadrado de 1 cm x 1 cm	Birabira	N/A Pluma
perforadora de biopsia de 1 mm	Robbins Instruments	20335
placa de inserción de 6 pocillos (Corning Transwell)	Millipore Sigma	CLS3450
Pasteur desechable de 9" Pipets Fisher	Scientific	13-678-20C
Tubos de centrífuga de 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Placa de 24 pocillos	Corning Costar	3526
Tubos de centrífuga de 50 mL	Fisher Scientific	05-539-9
Agar	Fisher BioReagents	BP1423-500	para incrustar cerebros fijos
Alexafluor 488 GAM IgG	Jackson Immunoresearch	115-605-146
Alexafluor 647 GAM IgG	conjugado Jackson Immunoresearch	115-545-146
Papel de aluminio	ReynoldsWrap	N/A
Ampicilina	Sigma Aldrich	A-9518
anti-integrina alfa-6 anticuerpo monoclonal GOH3	Santa Cruz Biotechnology	sc-19622
anti-L1CAM anticuerpo monoclonal UJ127	Santa Cruz Biotechnology	sc-53386
anti-laminina anticuerpo monoclonal	Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas	3H11
anti-nestina anticuerpo monoclonal 10C2	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927
anticuerpo monoclonal anti-Sox2 E-4	Santa Cruz Biotechnology	sc-365823
B27 suplemento sin vitamina A	GIBCO	17504-044
bisbenzimida (Hoechst 33258)	Sigma-Aldrich	B2883	tinción nuclear
Incubadora de cultivo celular	Forma		estándar humidificado CO2
incubadora Centrífuga	Beckman Coulter
Microscopio confocal	Nikon Instruments	C2si+	Con cámara de incubadora celular hecha a medida
Lentes de objetivo de microscopio confocal	Nikon Instruments		Lentes Plan Apo, excepto S Lente objetivo Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA para imágenes confocales de lapso de tiempo
Software de microscopio confocal	Nikon Instruments	NIS Elements	versión 5.2
Foreceps curvo	Precision Instruments	504478
Tijeras curvas Herramientas de	Bellas Ciencias
curva	Fisher Scientific	14-375-20
Pegamento de cianoacrilato	Krazy Glue	KG-585 12R
D-Glucosa	Millipore Sigma	G8270
DiD tinte fluorescente rojo lejano	Invitrogen	V22887	Vybrant DiD
DMEM	Sigma Aldrich	D5671
DMEM/F12	Sigma Aldrich	D8437
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma Aldrich	P5493-1L
incubadora de huevos	humidaire
(10 mil de grosor/254 y micro; m)	Scotch	N/A
Etanol 200 prueba	Decon Laboratories	2701
Tinte verde rápido FCF	Productos químicos de investigación de aguacate	16520
FBS	Gemini Bio-products	900-108
papel de filtro	Fisher
Gauze	Dynarex	3353
Capilares de vidrio para microinyección	World Precision Instruments	TW100-4
Glicerol	Fisher BioReagents	BP228-1	para medios
de montaje GSC (células madre de glioblastoma humano)	No aplicable		Aislado de muestras de GBM de pacientes en el laboratorio Galileo en medio GSC y luego transducido con un vector lentiviral que codifica GFP.  Las celdas utilizadas se ubicaron entre el pasaje 10 y el 30.
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)	Corning	21-020-CV
Hemacitómetro	Hausser scientific
Heparina	Fisher Scientific	BP2524-100
Tampón HEPES	Sigma Aldrich	H0887
Suero de caballo (HI)	Gibco	26050-088
FGF-2	humano BioVision	4037-1000
TGF-y alfa humano;	BioVision	4339-1000
Microscopio de contraste de fase invertida	Nikon Instruments	TMS	para la visualización rutinaria de células cultivadas
KCl Fisher	Scientific	BP366
KH2PO4	Fisher Scientific	P284
Película de laboratorio	Parafilm
Labquake Shaker	LabIndustries	T400-110
L-Glut:Pluma:Estreptococo	Gemini Bio-products	400-110
Agarosa de bajo punto de fusión	Fisher Scientific	BP1360	para incrustar cerebros vivos
Matrix	Corning Matrigel	354234
Medium 199	GIBCO	11150-059
MEM	Corning	10-010-CV
			metálico de vibratomo
Puntas de micropipeta (20, 200, 1.000 y micro; L)	Micropipetas Fisherbrand
(20, 200, 1.000 y micro; L)	Cubreobjetos de
(n.º 1,5 de grosor)	Fisherbrand	12544A
NaCl	Fisher Scientific	S271
NaH2PO4 + H2O	Fisher Scientific	S369
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328
Suero de cabra normal	Millipore Sigma	526-M
N-galato de propilo	Sigma Aldrich	P3130	para medios de montaje
Parafilm	Parafilm
Paraformaldehído	Microscopía Electrónica Ciencias	15710
PBS	Sigma Aldrich	P5493-1L
Lápiz
Portaobjetos de microscopio liso	Fisherbrand	12-550-A3
Placa de Petri de plástico de 35 mm	Becton Dickinson	351008
picobomba neumática	World Precision Intruments	PV830
Poli(2-hidroxietil metacrilato)  (poli-HEMA)	Sigma Aldrich	P-3932
de doble filo	PACE		para cortar cortes de cerebro fijos cuchillo
zafiro	Delaware Diamond Cuchillos		para cortar cortes de cerebro vivos
Bisturí	TruMed	1001
Tampón de cacodilato de sodio 0,2 M pH 7,4	Microscopía electrónica Sciences	11652
Cámara de muestras para vibratomo			a medida
	Nikon Instruments	SMZ1500	Equipado con epifluorescencia
Foreceps rectos	World Precision Instruments	500233
tijeras rectas			ciencia fina
Sacarosa	Mallinckrodt	7723
Fluorescencia time-lapse microscopio (fluorescencia de campo amplio)	Nikon Instruments	TE2000-E	Con cámara de incubación de células hecha a medida (ver Fotos et al., 2006)
Placa de cultivo de tejidos de poliestireno 100 mm	Thermo Fisher Scientific	130182	para el cultivo de células
Placa de cultivo de tejidos de poliestireno de 60 mm	Becton Dickinson	353004	para el cultivo de células
Pipeta de transferencia	American Central Scientific Co.	FFP011
Cinta transparente	Scotch
Triton X-100	Sigma Aldrich	T-8787
Tripsina (0,25%) + 2,21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
U-118 MG línea celular GBM humana	ATCC	HTB-15	Las células se transducieron con un vector lentiviral que codifica toda la secuencia de ectodominios de la proteína de adhesión L1CAM y luego con vector lentiviral pCodificación ultracaliente mCherry.  Se desconocen los números de los pasajes.
Bomba de vacío	Cole-Parmer	EW-07532-40	"Air Cadet"
Cortadora de tejidos	vibratoria Vibratome	3000	para el corte de trozos de cerebro vivos y fijos

World Espátula Cinta aislante de Scientific Bloque microscopio Gilson Hoja de afeitar de Microscopio de disección estereoscópica hecho Herramientas de