Análisis de gotitas de lípidos teñidas con fluorescencia con reconstrucción 3D para la evaluación de la esteatosis hepática

Karina Garcia; André Alves; Teresa M. Ribeiro-Rodrigues; Flávio Reis; Sofia Viana

doi:10.3791/65206

Artículo de método

Análisis de gotitas de lípidos teñidas con fluorescencia con reconstrucción 3D para la evaluación de la esteatosis hepática

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DOI:

10.3791/65206

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2 de junio de 2023

Karina Garcia¹^,²^,³^,⁴ , André Alves¹^,²^,³ , Teresa M. Ribeiro-Rodrigues¹^,²^,³ , Flávio Reis¹^,²^,³ , Sofia Viana¹^,²^,³^,⁴

¹Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics & Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), Faculty of Medicine, University of Coimbra, ²Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, ³Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), ⁴Polytechnic Institute of Coimbra, Coimbra Health School

En este artículo

Resumen

En este documento, demostramos un protocolo optimizado basado en fluorescencia BODIPY 493/503 para la caracterización de gotas de lípidos en el tejido hepático. Mediante el uso de proyecciones ortogonales y reconstrucciones 3D, el fluoróforo permite una discriminación exitosa entre esteatosis microvesicular y macrovesicular y puede representar un enfoque complementario a los protocolos histológicos clásicos para la evaluación de esteatosis hepática.

Resumen

Las gotitas de lípidos (LD) son orgánulos especializados que median el almacenamiento de lípidos y desempeñan un papel muy importante en la supresión de la lipotoxicidad y la prevención de la disfunción causada por los ácidos grasos libres (FA). El hígado, dado su papel crítico en el metabolismo de las grasas del cuerpo, está persistentemente amenazado por la acumulación intracelular de LD en forma de esteatosis hepática microvesicular y macrovesicular. La caracterización histológica de los LD se basa típicamente en colorantes diazo solubles en lípidos, como la tinción Oil Red O (ORO), pero una serie de desventajas dificultan consistentemente el uso de este análisis con muestras de hígado. Más recientemente, los fluoróforos lipofílicos 493/503 se han vuelto populares para visualizar y localizar LD debido a su rápida absorción y acumulación en el núcleo de gotas de lípidos neutros. Aunque la mayoría de las aplicaciones están bien descritas en cultivos celulares, hay menos evidencia que demuestre el uso confiable de sondas de fluoróforos lipofílicos como una herramienta de imagen LD en muestras de tejido. En este documento, proponemos un protocolo optimizado basado en diprometeno de boro (BODIPY) 493/503 para la evaluación de LD en muestras de hígado de un modelo animal de esteatosis hepática inducida por dieta alta en grasas (HFD). Este protocolo cubre la preparación de muestras de hígado, la sección de tejidos, la tinción BODIPY 493/503, la adquisición de imágenes y el análisis de datos. Demostramos un aumento del número, la intensidad, la relación de área y el diámetro de LD hepáticas al alimentarse con HFD. Usando proyecciones ortogonales y reconstrucciones 3D, fue posible observar el contenido completo de lípidos neutros en el núcleo LD, que aparecieron como gotitas casi esféricas. Además, con el fluoróforo BODIPY 493/503, pudimos distinguir microvesículas (1 μm < d ≤ 3 μm), vesículas intermedias (3 μm < d ≤ 9 μm) y macrovesículas (d > 9 μm), permitiendo la discriminación exitosa de esteatosis microvesicular y macrovesicular. En general, este protocolo basado en fluorescencia BODIPY 493/503 es una herramienta fiable y sencilla para la caracterización hepática de LD y puede representar un enfoque complementario a los protocolos histológicos clásicos.

Introducción

Las gotas de lípidos (LD), clásicamente vistas como depósitos de energía, son orgánulos celulares especializados que median el almacenamiento de lípidos, y comprenden un núcleo lipídico neutro hidrófobo, que contiene principalmente ésteres de colesterol y triglicéridos (TG), encapsulados por una monocapa de fosfolípidos ^1,2,3.

La biogénesis de LD ocurre en el retículo endoplásmico (RE), comenzando con la síntesis de triacilglicerol (TAG) y ésteres de esteroles. Los lípidos neutros se difunden entre las valvas de la bicapa ER a bajas concentraciones....