Method Article

Uso del MouseWalker para cuantificar la disfunción locomotora en un modelo de ratón de lesión de la médula espinal

DOI:

10.3791/65207

⸱

March 24th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, 2iNOVA4Health, NOVA Medical School|Faculdade de Ciências Médicas, NMS|FCM, Universidade Nova de Lisboa, 3Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se proporciona una tubería experimental para describir cuantitativamente el patrón locomotor de ratones que caminan libremente utilizando la caja de herramientas MouseWalker (MW), que va desde grabaciones de video iniciales y seguimiento hasta análisis posteriores a la cuantificación. Se emplea un modelo de lesión por contusión de la médula espinal en ratones para demostrar la utilidad del sistema MW.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La ejecución de programas motores complejos y altamente coordinados, como caminar y correr, depende de la activación rítmica de los circuitos espinales y supraespinales. Después de una lesión de la médula espinal torácica, la comunicación con los circuitos aguas arriba se ve afectada. Esto, a su vez, conduce a una pérdida de coordinación, con un potencial de recuperación limitado. Por lo tanto, para evaluar mejor el grado de recuperación después de la administración de medicamentos o terapias, existe la necesidad de herramientas nuevas, más detalladas y precisas para cuantificar la marcha, la coordinación de las extremidades y otros aspectos finos del comportamiento locomotor en modelos animales de lesión de la médula espinal. A lo largo de los años se han desarrollado varios ensayos para evaluar cuantitativamente el comportamiento de caminar libremente en roedores; Sin embargo, generalmente carecen de mediciones directas relacionadas con las estrategias de marcha por pasos, los patrones de huella y la coordinación. Para abordar estas deficiencias, se proporciona una versión actualizada del MouseWalker, que combina una pasarela de reflexión interna total frustrada (fTIR) con software de seguimiento y cuantificación. Este sistema de código abierto se ha adaptado para extraer varias salidas gráficas y parámetros cinemáticos, y un conjunto de herramientas de post-cuantificación puede ser para analizar los datos de salida proporcionados. Este manuscrito también demuestra cómo este método, aliado con pruebas de comportamiento ya establecidas, describe cuantitativamente los déficits locomotores después de una lesión de la médula espinal.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La coordinación efectiva de cuatro extremidades no es exclusiva de los animales cuadrúpedos. La coordinación extremidad anterior-extremidad posterior en humanos sigue siendo importante para realizar varias tareas, como nadar y alteraciones de la velocidad al caminar1. Varios cinemáticos2 y del programa motor 1,3,4 de las extremidades, así como circuitos de retroalimentación propioceptiva5, se conservan entre humanos y otros mamíferos y deben ser considerados al analizar las opciones terapéuticas para los trastornos motores, como la lesión de la médula espinal (LME)6,7,8.

Para caminar, varias conexiones espinales de las extremidades anteriores y posteriores necesitan ser correctamente cableadas y activadas rítmicamente, lo que requiere aportes del cerebro y retroalimentación del sistema somatosensorial 2,9,10. Estas conexiones culminan en los generadores de patrones centrales (GPC), que están situados a nivel cervical y lumbar para las extremidades anteriores y posteriores, respectivamente 1,9,10. A menudo, después de la LME, la interrupción de la conectividad neuronal y la formación de una cicatriz glial inhibitoria12 limitan la recuperación de la función locomotora, con resultados que varían desde la parálisis total hasta la función restringida de un grupo de extremidades dependiendo de la gravedad de la lesión. Las herramientas para cuantificar con precisión la función locomotora después de la LME son críticas para monitorear la recuperación y evaluar los efectos de los tratamientos u otras intervenciones clínicas6.

El ensayo métrico estándar para los modelos de contusión de LME en ratones es la escala de ratón de Basso (BMS)13,14, una puntuación no paramétrica que considera la estabilidad del tronco, la posición de la cola, el paso plantar y la coordinación extremidad anterior-extremidad posterior en un campo abierto. A pesar de que el BMS es extremadamente confiable para la mayoría de los casos, requiere al menos dos evaluadores experimentados para observar todos los ángulos de movimiento de los animales para tener en cuenta la variabilidad natural y reducir el sesgo.

También se han desarrollado otros ensayos para evaluar cuantitativamente el rendimiento motor después de la SCI. Estos incluyen la prueba de rotarod, que mide el tiempo empleado en un cilindro giratorio15; la escalera horizontal, que mide el número de barandillas perdidas y la escalera positiva agarra16,17; y la prueba de marcha del haz, que mide el tiempo que tarda un animal y el número de fallos que comete al cruzar una viga estrecha18. A pesar de reflejar una combinación de déficits motores, ninguna de estas pruebas produce información locomotora directa sobre la coordinación extremidad anterior-extremidad posterior.

Para analizar específicamente y más a fondo el comportamiento al caminar, se han desarrollado otros ensayos para reconstruir los ciclos de pasos y las estrategias de marcha. Un ejemplo es la prueba de huella, donde las patas entintadas de un animal dibujan un patrón sobre una hoja de papel blanco19. Aunque simple en su ejecución, extraer parámetros cinemáticos como la longitud de zancada es engorroso e inexacto. Además, la falta de parámetros dinámicos, como la duración del ciclo escalonado o la coordinación cronometrada, limita sus aplicaciones; De hecho, estos parámetros dinámicos solo se pueden adquirir analizando videos cuadro por cuadro de roedores caminando a través de una superficie transparente. Para los estudios de SCI, los investigadores han analizado el comportamiento al caminar desde una vista lateral utilizando una cinta de correr, incluida la reconstrucción del ciclo de pasos y la medición de las variaciones angulares de cada articulación de la pierna 4,20,21. A pesar de que este enfoque puede ser extremadamente informativo6, sigue centrado en un conjunto específico de extremidades y carece de características adicionales de la marcha, como la coordinación.

Para llenar estos vacíos, Hamers y sus colegas desarrollaron una prueba cuantitativa basada en un sensor táctil óptico utilizando la reflexión interna total frustrada (fTIR)22. En este método, la luz se propaga a través del vidrio a través de la reflexión interna, se dispersa al presionar la pata y, finalmente, es capturada por una cámara de alta velocidad. Más recientemente, se puso a disposición una versión de código abierto de este método, llamada MouseWalker, y este enfoque combina una pasarela fTIR con un paquete de software de seguimiento y cuantificación23. Con este método, el usuario puede extraer un gran conjunto de parámetros cuantitativos, incluidos patrones de paso, espaciales y de marcha, posicionamiento de la huella y coordinación extremidad anterior-extremidad posterior, así como salidas visuales, como patrones de huella (imitando el ensayo de pata entintada6) o fases de postura relativas al eje del cuerpo. Es importante destacar que, debido a su naturaleza de código abierto, se pueden extraer nuevos parámetros actualizando el paquete de scripts de MATLAB.

Aquí, se actualiza el ensamblaje publicado anteriormente del sistema MouseWalker23 . Se proporciona una descripción de cómo configurarlo, con todos los pasos necesarios para lograr la mejor calidad de video, condiciones de seguimiento y adquisición de parámetros. También se comparten herramientas adicionales posteriores a la cuantificación para mejorar el análisis del conjunto de datos de salida de MouseWalker (MW). Finalmente, la utilidad de esta herramienta se demuestra mediante la obtención de valores cuantificables para el rendimiento locomotor general, específicamente los ciclos escalonados y la coordinación extremidad anterior-extremidad posterior, en un contexto de lesión medular (LME).

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los procedimientos de manipulación, quirúrgicos y cuidados postoperatorios fueron aprobados por el Comité Interno Molecular del Instituto de Medicina (ORBEA) y el Comité Portugués de Ética Animal (DGAV) de acuerdo con las directrices de la Comunidad Europea (Directiva 2010/63 / UE) y la ley portuguesa sobre cuidado de animales (DL 113/2013) bajo la licencia 0421/000/000/2022. Para el presente estudio se utilizaron ratones hembra C57Bl/6J de 9 semanas de edad. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales y disminuir el sufrimiento de los animales utilizados en el estudio. El script de MATLAB y la versión independiente del software MW son de código abierto y están disponibles en GitHub.
repositorio (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). Mientras que el software MW se desarrolló en MATLAB R2012b, se ha adaptado para ejecutarse en MATLAB R2022b. La figura 1 ilustra el flujo de trabajo de análisis del MW.

1. Configuración del aparato MouseWalker (MW)

  1. Ensamble el aparato MW como se describió anteriormente23, o adáptese a las necesidades específicas del diseño experimental (consulte la Tabla de materiales y la Figura suplementaria 1 para obtener más detalles sobre la configuración).
    NOTA: La arena para caminar se puede ampliar para acomodar animales más grandes, como ratas.
  2. Verifique que el plexiglás por donde caminan los animales esté limpio y libre de arañazos. Use un paño de limpieza suave y minimice el uso de solventes orgánicos como amoníaco o etanol en altas concentraciones, que pueden dañar el plexiglás (se recomienda peróxido de hidrógeno al 3%, etanol al 7% o cualquier desinfectante compatible y apropiado para plexiglás). Si es necesario, reemplace el plexiglás.
  3. Configure la cámara de alta velocidad con una lente rápida y una apertura grande (es decir, valores F-stop más pequeños) para capturar una gran cantidad de luz, ya que esto ayuda a registrar las señales fTIR (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: La lente no debe generar distorsiones ópticas, particularmente en los bordes de la imagen. Las distorsiones ópticas se pueden probar registrando un patrón conocido (por ejemplo, rayas o cuadrados) y luego midiendo el tamaño de los bloques en ImageJ/FIJI24 (use la herramienta de línea y luego haga clic en Analizar > medir). Por ejemplo, un cuadrado de 1 cm debe tener las mismas dimensiones de píxeles tanto en el centro de la imagen como en los bordes. Las variaciones deben ser inferiores al 5%.
  4. Ilumine la tira de luz LED multicolor de la caja de luz de fondo.
  5. Encienda la tira de luz LED blanca de la caja de luces de la pasarela.
    NOTA: También se puede usar un LED de color25 para facilitar la distinción de la huella / cuerpo / fondo.
  6. Con las luces de la habitación apagadas, verifique la intensidad de la luz de fondo y la pasarela. Ajuste la intensidad, si es necesario, utilizando un potenciómetro o plástico semiopaco. Estos deben optimizarse para que la intensidad de los píxeles aumente en el siguiente orden: el cuerpo del animal < fondo < huellas.
    1. Para comprobar la intensidad en píxeles del cuerpo/fondo/huellas del animal, abra la secuencia de imágenes en ImageJ/FIJI24 y haga clic en Analizar > medir. La señal de huella no debe estar sobresaturada, ya que esto evitará que se definan los límites de la huella (es decir, dedos de los pies y almohadillas para los pies) (Figura complementaria 2).
  7. Ajuste el contraste de imagen de la pasarela en el software de grabación de video. El contraste se puede ajustar de dos maneras: atenuando o aumentando la iluminación en la tira de LED o ajustando la apertura de la lente de la cámara.
  8. Coloque la lente correctamente para que esté a la misma altura y en el centro del espejo reflectante de 45° y perpendicular (90°) a la pasarela. Esto generará una imagen constantemente proporcional a lo largo de la pasarela izquierda-derecha.
    NOTA: Evite cambiar la posición de la cámara (distancia, altura y orientación) en las múltiples sesiones de grabación. Si es necesario, marque el piso donde se debe colocar el trípode. Esto mantendrá las características de la imagen.
  9. Enfoca la lente en la superficie del plexiglás. Esto se puede probar utilizando un objeto no dañino que toque la superficie del plexiglás.
    NOTA: Con valores de lente F-stop más bajos, la profundidad de campo se reducirá, lo que dificultará el enfoque.
  10. Asegúrese de que todos los ajustes permanezcan inalterados durante el ensayo, ya que pueden cambiar la intensidad de píxeles de los videos grabados.

2. Adquisición de vídeo

  1. Asegúrese de que los ratones estén familiarizados con la habitación y el aparato antes de realizar la prueba. Ahorre al menos 1 día para la habituación (día 0). Para evitar un entrenamiento excesivo, realice la prueba de MW en un día diferente de las otras pruebas de comportamiento (preferiblemente al día siguiente).
  2. En el software de grabación de vídeo, asegúrese de que al menos 50 cm de la pasarela sean visibles.
  3. Ajuste la configuración de grabación para truncar la región de la pasarela. Esto reducirá el tamaño del video y optimizará la adquisición de video.
  4. Tome una foto o un video corto de una regla regular antes de cada sesión. El número de píxeles por centímetro se utilizará más tarde en la "ventana de configuración" para calibrar los videos.
  5. Comience la adquisición del video y coloque al animal en el borde de la pasarela agarrando la base de la cola para evitar lesiones. Asegúrese de que los animales avancen hacia el borde extremo de la plataforma. Realice las grabaciones de vídeo con al menos 100 fotogramas/s para garantizar transiciones de marcha suaves.
    1. Si es necesario, motive a los animales a moverse golpeando suavemente la pared de la pasarela o chasqueando / aplaudiendo los dedos. Sin embargo, evite los empujones físicos, ya que esto puede afectar los resultados.
    2. Guarde los videos directamente como secuencias de imágenes en formato TIFF (con compresión LZW), JPEG o PNG. En caso de que la cámara grabe como un archivo MOV sin procesar, convierta los videos en secuencias de imágenes abriendo el archivo en ImageJ / FIJI24 y haciendo clic en Archivo > Guardar como secuencia de > imagen (o utilizando otro software, como LosslessCut25).
      NOTA: La mayoría de los animales comienzan a caminar inmediatamente después de ser puestos en la pasarela; Por lo tanto, se recomienda iniciar la adquisición del video antes de colocar al animal.

3. Preparación de los vídeos para el software de seguimiento MW

  1. Filme suficientes tiradas completas de cada ratón individual. El número de animales a filmar por condición y el número de tiradas completas deben decidirse de acuerdo con cada diseño experimental. Una carrera completa es cuando el ratón camina los 50 cm completos de la pasarela sin paradas prolongadas (en este experimento, se seleccionaron tres carreras completas).
    NOTA: Dependiendo del software de adquisición de imágenes, es posible que los videos deban recortarse al ROI más bajo. Esto aumentará la velocidad de seguimiento y generación de salida.
  2. En ImageJ/FIJI24, seleccione los fotogramas en los que está el ratón en la pantalla haciendo clic en Imagen > Pila > Herramientas > Crear una subpila. El seguimiento en el MW requiere que la cabeza y la cola sean visibles en todos los cuadros. Sin embargo, es posible hacer varias subpilas a partir de una sola grabación de video, que luego representará cada ejecución.
  3. Guarde cada subpila por separado en diferentes carpetas haciendo clic en Archivo > Guardar como secuencia > imagen. El software MW luego crea una subcarpeta automáticamente en cada directorio cada vez que uno comienza a analizar una ejecución.

4. Seguimiento

  1. Abra MATLAB, agregue la carpeta que contiene el script MW al directorio de trabajo y ejecute "MouseWalker.m" en la línea de comandos principal.
    NOTA: El uso del software MW en MATLAB permite visualizar mensajes de error de seguimiento en la consola principal de MATLAB y seleccionar los datos de salida deseados (abriendo el archivo de script principal "MouseEvaluate.m" y cambiando las salidas a 1 o 0: el archivo de Excel, gráficos de pasos, trazos de postura y patrones de marcha).
  2. Cargue la carpeta de video como el "Directorio de entrada". También se puede elegir la carpeta de salida; sin embargo, esto no es un requisito ya que el software MW crea una nueva carpeta llamada "Resultados" automáticamente dentro del "Directorio de entrada".
  3. Usando las flechas "<<", "<", ">>" y ">" verifique si todos los cuadros de video están cargados correctamente dentro del software MW.
  4. Vaya a la "Ventana de configuración" donde se encuentran todos los parámetros de calibración y umbral. Estos ajustes pueden cambiar dependiendo de la intensidad de píxeles del fondo y las huellas, así como del tamaño mínimo del cuerpo y las huellas, entre otros factores (ver ejemplo en la Figura complementaria 2). Pruebe el efecto de cambiar algunos parámetros haciendo clic en el botón Vista previa .
    1. Use los diferentes estilos de trama, incluidos "cuerpo + pies + cola", "solo cuerpo", "solo pies" y "solo cola", para ayudar a discriminar partes del cuerpo después de ajustar los parámetros de umbral.
    2. Aproveche las herramientas en el panel lateral derecho para tomar medidas del brillo o tamaño (usando los botones "brillo" y "regla", respectivamente). Todos los ajustes se pueden guardar como "predeterminados" siempre que la distancia de la cámara siga siendo la misma.
  5. Después de ajustar los parámetros de umbral, compruebe que el vídeo está listo para el seguimiento automatizado. Vaya al primer cuadro y haga clic en Auto para comenzar el seguimiento. Este paso se puede seguir en tiempo real, y tarda unos minutos, dependiendo del tamaño del vídeo y del rendimiento del ordenador.
    1. Si el seguimiento automático etiqueta incorrectamente las características del cuerpo, cancele el seguimiento automático, ingrese una nueva configuración y reinicie el proceso.
  6. Una vez completado el seguimiento, compruebe si se necesita una corrección manual. Para corregir, utilice el panel central para seleccionar o anular la selección e indicar la ubicación de las huellas de la pata, la cabeza, la nariz, el cuerpo (dividido en dos segmentos) y la cola (divididos en cuatro segmentos) de la parte delantera derecha (RF), la parte posterior derecha (HR), la delantera izquierda (LF) y la parte posterior izquierda (LH). Guarde los cambios pulsando el botón Guardar .
    NOTA: Todos los botones y la mayoría de los comandos tienen un método abreviado de teclas (consulte el manual asociado para obtener más detalles23). Para facilitar el desplazamiento de video y la ejecución de atajos de teclado, se puede usar un controlador de hardware con botones programables y una rueda de lanzadera como el Contour ShuttlePro V2.
  7. Haga clic en Evaluar para generar los archivos de salida del video rastreado. Dependiendo de la salida deseada seleccionada (consulte el paso 4.1), este paso puede tardar unos minutos.
  8. Compruebe que todos los gráficos de datos de salida se guardan en la carpeta "Resultados". Verifique la precisión del seguimiento examinando algunas de las salidas gráficas, como las "Trazas de postura", donde se puede verificar si todas las posiciones de las patas son consistentes.
    1. Si se identifica un error, corrija manualmente el seguimiento (si es posible; de lo contrario, elimine la carpeta "Resultados" y realice el seguimiento automático nuevamente con la nueva configuración) y haga clic nuevamente en el comando Evaluar .
  9. Compruebe que todas las mediciones cuantitativas generadas por el software MW se guardan en una hoja de cálculo Excel y se resumen en "1. Info_Sheet". Asegúrese de que las opciones de Excel para las delimitaciones de fórmulas coincidan con el script. El separador decimal debe ser ",", y los mil separadores deben ser ";".
  10. Utilice el script "MouseMultiEvaluate.m" para congregar las mediciones de todas las ejecuciones en un nuevo archivo para su análisis.
    1. Para comenzar, genere un archivo .txt que contenga las rutas de carpeta para todos los videos (por ejemplo, "Videofiles.txt"). Asegúrese de que cada línea corresponde a un solo vídeo.
    2. Luego, escriba "MouseMultiEvaluate ('Videofiles.txt')" en la línea de comandos. Se generará un archivo de Excel llamado "ResultSummary.xls" en el directorio de trabajo (vea un ejemplo en el repositorio de GitHub).
      NOTA: La Figura 2 representa las salidas gráficas obtenidas por el software MW de los videos de un animal grabado.

5. Flujo de trabajo de análisis cinemático de datos

  1. Edite la hoja de Excel generada en el paso 4.10, que contiene los datos para el procesamiento mediante los scripts de Python proporcionados, de acuerdo con los siguientes requisitos previos.
    1. En el encabezado de la primera columna, especifique la condición experimental. Asigne un nombre a cada línea después del nombre del grupo/condición (los individuos de los mismos grupos deben tener el mismo nombre). El primer grupo debe ser el control o la línea de base (esto solo es obligatorio para el trazado de mapas de calor, paso 5.6).
    2. En la segunda columna, especifique el identificador del animal. Esto es obligatorio, aunque esta información no se utilizará para la generación de parcelas.
    3. En la tercera columna en adelante, elija los parámetros motores que se utilizarán para el análisis. Asegúrese de que la primera línea es el nombre del parámetro (estos nombres aparecerán más adelante en los gráficos).
  2. Abra Anaconda Navigator y ejecute Spyder para abrir los scripts de Python suministrados.
    NOTA: Todos los scripts se desarrollaron con Python 3.9.13, se ejecutaron con Spyder 5.2.2 en Anaconda Navigator 2.1.4 y están disponibles en la Tabla de materiales y en el repositorio de GitHub (donde se incluyen materiales adicionales, como un ejemplo de video, un archivo de ejemplo de Excel y un documento de preguntas frecuentes). Es posible ejecutar los scripts fuera del Anaconda Navigator; Sin embargo, esta interfaz gráfica de usuario es más fácil de usar.
  3. Utilice el "Rawdata_PlotGenerator.py" para generar los gráficos de datos sin procesar. Esto permitirá la visualización de cada parámetro en función de la velocidad.
    1. Abra "Rawdata_PlotGenerator.py" en Spyder y ejecute el código haciendo clic en el botón Reproducir .
    2. Seleccione el archivo de Excel a analizar y el nombre de la hoja en la ventana automática. Si no se modificó el nombre de la hoja, escriba "Hoja1".
    3. Los gráficos de datos sin procesar aparecerán en la consola de gráficos (panel superior derecho). Para guardar los gráficos, haga clic en el botón Guardar imagen o Guardar todas las imágenes en la consola del trazado.
  4. Utilice el script "Residuals_DataAnalysis" para calcular los residuos para el análisis de datos. Este script generará un archivo CSV con los cálculos de los residuos para todos los parámetros del motor.
    NOTA: Muchos de los parámetros de marcha medidos extraídos por el MW varían con la velocidad (por ejemplo, velocidad de giro, longitud del paso, duración de la postura, rectitud de la postura e índices de marcha). Por lo tanto, se recomienda realizar un modelo de regresión de mejor ajuste de cada parámetro individual frente a la velocidad para el experimento de referencia y luego determinar los valores residuales para cada grupo experimental en relación con este modelo de regresión. Los datos se expresan entonces como la diferencia con respecto a la línea normalizada residual26.
    1. Abra "Residuals_DataAnalysis.py" en Spyder y ejecute el código haciendo clic en el botón Reproducir .
    2. Seleccione el archivo de Excel a analizar y el nombre de la hoja en la ventana automática. Si no se modificó el nombre de la hoja, escriba "Hoja1".
    3. Guarde el archivo CSV en la misma carpeta que los datos. Es obligatorio que el control (o línea base) sea el primer grupo del archivo de Excel.
  5. Utilice el script "PCA_PlotGenerator.py" para realizar un análisis de componentes principales (PCA).
    NOTA: Este método de reducción de dimensionalidad no supervisado se utiliza para generar una representación más sucinta 27,28,29 de los datos (Figura 3A, B). El script PCA incluye los siguientes pasos. Los datos se procesan primero mediante centrado y escalado, después de lo cual el algoritmo PCA calcula la matriz de covarianza para determinar las correlaciones entre las variables y calcular los vectores propios y los valores propios de la matriz de covarianza para identificar los componentes principales. Los primeros dos o tres componentes principales se eligen para la representación de los datos en gráficos 2D o 3D, respectivamente. Cada punto en las parcelas corresponde a un animal y representa una variable abstracta diferente. Los puntos codificados por colores se utilizan para distinguir los grupos específicos. Como tal, los grupos de puntos reflejan patrones de caminar similares compartidos por los individuos correspondientes.
    1. Abra "PCA_PlotGenerator.py" en Spyder y ejecute el código haciendo clic en el botón Reproducir .
    2. Seleccione el archivo de Excel a analizar y el nombre de la hoja en la ventana automática. Si no se modificó el nombre de la hoja, escriba "Hoja1".
    3. Asegúrese de que los gráficos PCA 2D y 3D aparecen en la consola de trazado (panel superior derecho). Cada color representa un grupo diferente y la leyenda aparece junto a la trama. Para guardar el gráfico, haga clic en Guardar imagen en la consola del trazado.
  6. Utilice "Heatmap_PlotGenerator.py" para generar un mapa de calor. Asegúrese de que el generador de mapas de calor cree una tabla que muestre las diferencias estadísticas entre el grupo de referencia (o grupo de control) y los otros grupos para cada parámetro motor27 (Figura 4). Cada columna representa un grupo, y cada línea se relaciona con un parámetro motor específico.
    NOTA: El análisis estadístico se realizó con un ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey (para distribuciones normales) o un ANOVA de Kruskal-Wallis seguido de la prueba post hoc de Dunn (para distribuciones no normales). Los valores atípicos se excluyeron del análisis. Los valores P están representados por un código de color, con tonos rojos y azules que indican un aumento o disminución en relación con el control (o línea de base), respectivamente. El tono de color representa la significación estadística, con colores más oscuros que muestran una mayor significación y colores más claros que muestran una significación menor. corresponde a P < 0,001; ** corresponde a P < 0,01; y * corresponde a P < 0,05. El blanco indica que no hay variación.
    1. Abra "Heatmap_PlotGenerator.py" en Spyder y ejecute el código haciendo clic en el botón Reproducir .
    2. Seleccione el archivo de Excel a analizar y el nombre de la hoja en la ventana automática. Si no se modificó el nombre de la hoja, escriba "Hoja1".
    3. Seleccione el tipo de datos en la segunda ventana automática: datos sin procesar o datos residuales. Si una opción no está seleccionada, los datos residuales son el valor predeterminado.
    4. El mapa de calor aparecerá en la consola de trazado (panel superior derecho). Para guardar el gráfico, haga clic en Guardar imagen en la consola del trazado.
      Nota : es obligatorio que el control (o línea base) es el primer grupo en el archivo de Excel.
  7. Utilice "Boxplots_PlotGenerator.py" para generar los diagramas de caja. Esta herramienta permitirá la generación de diagramas de caja que representan la distribución de valores para todos los parámetros motores para cada grupo (Figura 5, Figura 6 y Figura 7).
    NOTA: Cada caja contiene la mediana como línea media, y los bordes inferior y superior de las cajas representan los cuartiles 25% y 75%, respectivamente. Los bigotes representan el rango del conjunto de datos completo, excluyendo los valores atípicos. Los valores atípicos se definen como cualquier valor que sea 1,5 veces el rango intercuartil por debajo o por encima de los cuartiles 25% y 75%, respectivamente.
    1. Abra "Boxplots_PlotGenerator.py" en Spyder y ejecute el código haciendo clic en el botón Reproducir .
    2. Seleccione el archivo de Excel a analizar y el nombre de la hoja en la ventana automática. Si no se modificó el nombre de la hoja, escriba "Hoja1".
    3. Seleccione el tipo de datos en la segunda ventana automática: datos sin procesar o datos residuales. Si una opción no está seleccionada, los datos residuales son el valor predeterminado.
    4. Los diagramas de caja aparecerán en la consola de trama (panel superior derecho). Para guardar los gráficos, haga clic en el botón Guardar imagen o Guardar todas las imágenes en la consola del trazado.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El sistema BMS estándar describe los déficits motores gruesos después de SCI14. Debido a su naturaleza subjetiva, generalmente se realizan otros ensayos cuantitativos junto con el BMS para producir una evaluación más detallada y fina de la locomoción. Sin embargo, estas pruebas no muestran información específica sobre los ciclos de pasos, los patrones de paso y la coordinación de las extremidades anteriores y posteriores, lo cual es extremadamente importante para comprender cómo el circuito espina...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, el potencial del método MouseWalker se demuestra mediante el análisis del comportamiento locomotor después de LME. Proporciona nuevos conocimientos sobre alteraciones específicas en los patrones de paso, huella y marcha que de otro modo se perderían en otras pruebas estándar. Además de proporcionar una versión actualizada del paquete MW, las herramientas de análisis de datos también se describen utilizando los scripts de Python suministrados (consulte el paso 5).

Como el MW genera un gra...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen a Laura Tucker y Natasa Loncarevic por sus comentarios sobre el manuscrito y el apoyo brindado por el Centro de Roedores del Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. Los autores quieren agradecer el apoyo financiero de Prémios Santa Casa Neurociências - Premio Melo e Castro para la Investigación de Lesiones de la Médula Espinal (MC-36/2020) a L.S. y C.S.M. Este trabajo fue apoyado por la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 y UIDP/04462/2020), y LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) a C.S.M. L.S. fue apoyado por un contrato de Investigador Principal Individual de CEEC (2021.02253.CEECIND). A.F.I. fue apoyado por una beca doctoral de FCT (2020.08168.BD). A.M.M. fue apoyado por una beca doctoral de FCT (PD/BD/128445/2017). I.M. fue apoyado por una beca postdoctoral de FCT (SFRH / BPD / 118051 / 2016). D.N.S. fue apoyado por una beca doctoral de FCT (SFRH / BD / 138636 / 2018).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
45º Espejo 
2 extrusión de aluminio (2 x 2 cm), 16 cm de altura, 1 en cada ladoExtrusión de aluminio Misumi
2 (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45° , 1 en cada ladoExtrusión de aluminio Misumi
1 (2 x 2 cm), 83 cm de largoEspejo Misumi
87 x 23 cmProveedor general de vidrios 
relleno de cartón negro de papelería generalUtilizamos 2, uno de 69 x 6 cm y otro de 69 x 3 cm para limitar el reflejo en el espejo
Luz de fondo de fondo
109 x 23 cm plexiglás (0,9525 cm de grosor)Proveedorde herrajes generales
2 extrusión lateral de aluminio (4 x 4 cm), 20 cm de largo, 1 a cada ladoMisumi
tira de LED multicolorProveedor
general papel opaco blanco para cubrir el plexigláspapelería general
fTIR Base de soporte y postes
2 extrusión de aluminio (4 x 4 cm), 100 cm de alturaMisumi
60 x 30 cm tablero de pruebas métricoEdmund Optics #54-641
Tornillos M6 de 12 mmEdmund Optics 
Tuercas hexagonales M6 y wahersEdmund Optics 
fTIR Walkway 
109 x 8,5 cm plexiglás (1,2 cm de grosor)Proveedor109 x 8,5 cm plexiglás (1,2 cm de grosor)
109 cm de largo Base-canal de aluminio con 1,6 cm de altura x 1,9 cm de profundidad pliegues gruesos (para sujetar el plexiglás)herrajes generales
2 extrusión lateral de aluminio (4 x 4 cm) 20 cm de longitud, 1 a cada ladoMisumi
relleno de cartón negro Proveedor de papelería generalutilizamos 2 rellenos en cada lado para cubrir los límites del plexiglás, evitando los bordes brillantes
Cámara de alta velocidad (en un trípode)
Blackfly S USB3FLIR#BFS-U3-32S4M-CEsta es una recomendación. El requisito es grabar al menos 100 fotogramas por segundo
Impactador de Horizonte Infinito Sistemas de Precisión e Instrumentación, LLC.#0400
lente
Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mmNikon#1929Este lente se recomienda, sin embargo, se pueden usar otros lentes. Asegúrese de que contenga una apertura grande (es decir, valores de número F más pequeños) para capturar señales fTIR
Software
MATLAB R2022bMathWorks
Python 3.9.13 Fundación de Software
Python Anaconda Navigator 2.1.4Anaconda, Inc.
Spyder 5.1.5 Proyecto Spyder
Muro de pasarela 
2 acrílicos rectales grandes de 100 x 15 cmconveniencia de bricolaje
2 laterales acrilicos trapecios con 6-10 de largo x 15 cm de alturaCualquier tienda
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Script Matlathttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20ScriptMouseWalker script de matlab
Script PCAhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plotspara realizar análisis de componentes principales
Gráficos de datos sin procesar https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20PlotsScript para crear gráficos de datos sin procesar
Análisis de residuoshttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_AnalysisCódigo para calcular residuos a partir de datos sin procesar
Proveedor de hardware Proveedor de de herrajes generales Proveedor de M6 12 mm tornillos Edmund Optics Colaboradores del Cualquier tienda de de conveniencia de bricolajeBoxplots https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Boxplots Script para crear Boxplots Docs https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Docs Documentos adicionales Mapa de calor https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Heatmaps Script para crear mapa de calor

References

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