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Preparación de montaje completo a base de metanol para la investigación de células ganglionares de la retina

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DOI:

10.3791/65222

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7 de abril de 2023

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1Department of Ophthalmology, Renmin Hospital of Wuhan University

En este artículo

Resumen

El metanol se puede utilizar como medio fijo auxiliar para preparaciones retinianas de montaje completo y almacenamiento a largo plazo, lo que es útil para la investigación de las células ganglionares de la retina.

Resumen

Las células ganglionares de la retina (CGR), que son las neuronas de proyección de la retina, propagan información visual externa al cerebro. Los cambios patológicos en las CGR tienen una estrecha relación con numerosas enfermedades degenerativas de la retina. La inmunotinción retiniana de montaje completo se utiliza con frecuencia en estudios experimentales sobre CGR para evaluar las condiciones de desarrollo y patológicas de la retina. En algunas circunstancias, algunas muestras valiosas de retina, como las de ratones transgénicos, pueden necesitar ser retenidas durante un largo período sin afectar la morfología o el número de CGR. Para obtener resultados experimentales creíbles y reproducibles, es esencial utilizar un medio de conservación eficaz. Aquí, describimos el efecto del metanol como un medio fijo auxiliar para preparaciones retinianas de montaje completo y almacenamiento a largo plazo. En resumen, durante el proceso de aislamiento, el metanol frío (-20 ° C) se pipetea sobre la superficie de la retina para ayudar a fijar los tejidos y facilitar su permeabilidad, y luego las retinas se pueden almacenar en metanol frío (-20 ° C) antes de ser inmunoteñidas. Este protocolo describe el flujo de trabajo de aislamiento de retina y el protocolo de almacenamiento de muestras de tejido, que es útil y práctico para la investigación de CGR.

Introducción

Las células ganglionares de la retina (CGR) son las únicas neuronas de proyección en la retina, e integran y transmiten información visual externa al cerebro1. Muchas enfermedades neurodegenerativas como el glaucoma y la neuropatía óptica traumática se caracterizan por daño irreversible y pérdida de CGR 2,3. El análisis de los cambios morfológicos y cuantitativos de las CGR es un paso crucial para determinar cómo se desarrollan y avanzan las enfermedades neurodegenerativas 4,5.

El ensayo de inmunofluorescencia indirecta es un método ampliamente aceptado para monitorear la distribución de proteínas y el recuento celular. En el laboratorio, la inmunotinción retiniana de montaje completo se utiliza comúnmente en estudios experimentales sobre CGR para evaluar las condiciones fisiológicas y patológicas de la retina6. Los marcadores más comunes utilizados para la cuantificación de RGC en toda la retina incluyen Brn3a, proteína de unión a ARN con empalme múltiple (RBPMS), y así sucesivamente 7,8. La caracterización de la cantidad y distribución de las CGR requiere inmunotinción retiniana de montaje completo de alta calidad. Generalmente, en los protocolos de inmunotinción, la retina se sumerge en fijadores químicos antes de ser incubada en anticuerpos. Los fijadores ideales no deben cambiar la forma de las células, la accesibilidad o afinidad de los epítopos por los anticuerpos, o las dimensiones lineales del tejido 9,10.

Debido a la compleja estructura de la retina, problemas como la fragilidad retiniana y el plegamiento, así como algunas dificultades comunes, como la contracción celular y los núcleos poco claros, son propensos a ocurrir cuando se hace un parche retiniano de montaje completo, lo que tiene un impacto negativo en la investigación experimental. Además, no todas las retinas se inmunotiñen inmediatamente, especialmente cuando se trata de las retinas de ratones transgénicos con precios caros que son de origen precioso, lo que requiere la preservación de las muestras de retina adicionales para su uso posterior.

La solución fijadora adecuada puede fijar el tejido rápidamente, evitar la autólisis tisular, preservar la morfología y estructura normales de las células tisulares y mantener la antigenicidad de las proteínas y otras sustancias10. En la actualidad, la fijación a base de formaldehído se ha utilizado ampliamente en diversos tejidos, incluyendo retinas separadas, oculares hemisecados y globos oculares enteros10. La contracción del tejido y la alteración morfológica de las células son los dos desafíos críticos encontrados después de la inmersión en formaldehído11. Además, las formulaciones de fijación modificada están emergiendo cada vez más para maximizar la retención de las propiedades originales de la retina y las células diana 9,10. Diferentes tratamientos de fijación retiniana pueden afectar la estructura retiniana, la inmunogenicidad de proteínas, la excitación fluorescente y el ciclo de enfriamiento de atenuación de manera diferente12,13. Las retinas fijadas con la solución de Davidson están más morfológicamente intactas en comparación con las fijadas con formalina, pero la solución de Davidson es menos compatible con algunos anticuerpos, como la molécula adaptadora de unión al calcio ionizada del marcador microglial 112. Teniendo en cuenta la naturaleza frágil de las retinas, los investigadores naturalmente se preguntarían si la integridad de la retina, así como las propiedades y la morfología de las células diana, cambiarán después del almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, rara vez se han informado los posibles efectos de la solución de fijación sobre la morfología de las células retinianas y RGC después del almacenamiento durante varios meses. La optimización de la fijación retiniana es crítica para la evaluación y preservación de las CGR.

Proporcionamos una descripción detallada de un método confiable y técnicamente sencillo que utilizamos para la tinción retiniana murina de montaje completo. Nuestro método enfatiza la preparación y almacenamiento adecuados de las retinas para la investigación de RGC, teniendo en cuenta la necesidad de almacenamiento a largo plazo del tejido retiniano, así como aspectos específicos de la formación o degradación de fluoróforos.

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Protocolo

Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. Todos los ratones C57BL / 6J utilizados se obtuvieron del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Wuhan, y todos los experimentos relacionados fueron aprobados por el Comité de Ética de los Experimentos con Animales de la Universidad de Wuhan. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los ratones.

1. Enucleación y fijación de los ojos

  1. Eutanasia a los ratones con asfixia de dióxido de carbono y enuclear el globo ocular suavemente usando pinzas sin dientes.
  2. Enjuague el globo ocular una vez en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  3. Perfore el globo ocular con una aguja de jeringa en la córnea bajo un microscopio (ocular WF: 10x/22; objetivo de aumento continuo: 0.67x-4.5x) para acelerar la fijación en el globo ocular y mejorar la eficiencia de fijación.
  4. Transfiera a una placa de 24 pocillos que contenga 4% de paraformaldehído (PFA).
  5. Fije el globo ocular en PFA al 4% durante 45 minutos y luego transfiéralo a 1x PBS para eliminar el exceso de PFA (lavar tres veces, 5 minutos / vez) inmediatamente.

2. Aislamiento y aplanamiento de la retina

  1. Transfiera el globo ocular a un portaobjetos de vidrio y colóquelo bajo un microscopio de disección (ocular WF: 10x/22; objetivo de aumento continuo: 0.67x-4.5x).
  2. Sostenga los fórceps en una mano y úselos para sujetar el margen de la córnea para evitar el movimiento del globo ocular. Use la otra mano para sostener las tijeras de disección y corte alrededor de la córnea a aproximadamente 1 mm de profundidad a través del limbo corneoescleral. Retire el cristalino y el cuerpo vítreo.
  3. Sostenga el disco óptico en el centro y, utilizando tijeras de disección, corte la retina radialmente a lo largo de los cuatro cuadrantes, alcanzando aproximadamente 2/3 del radio de la retina.
  4. Sujete uno de los bordes esclerales con pinzas dentadas. Con la otra mano, sostenga el borde de la esclerótica con pinzas sin dientes y muévase desde donde la esclerótica está fijada por las pinzas dentadas hacia la base de la esclerótica. Pelar cuidadosamente la retina.
  5. Extraiga PBS usando una pipeta (200 μL) para enjuagar y humedecer la retina, y luego retire cualquier exceso de PBS con un pequeño trozo de papel absorbente. Si es necesario, aplanar suavemente la retina con un cepillo de cerdas pequeñas.
  6. Pipetear lentamente metanol frío (preenfriado en un congelador de -20 °C) gota a gota sobre la superficie interna de la retina (el volumen de metanol no es fijo, siempre y cuando la retina pueda estar completamente cubierta por el metanol). La retina se vuelve blanca y desarrolla una mayor tenacidad.
  7. Aplanar suavemente la retina y eliminar las impurezas como las membranas pigmentarias residuales y el cuerpo vítreo con pequeños cepillos de cerdas. Invierta la retina con pequeños cepillos de cerdas y repita el proceso mencionado anteriormente.
  8. Transfiera la retina tratada con metanol a un pocillo de una placa de 24 pocillos y manténgala empapada en metanol.
  9. Guárdelo a -20 °C durante 1-2 h para la inmunotinción inmediata, o deje la retina en metanol y guárdelo a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo.
  10. Retire el metanol de la placa de 24 pocillos y enjuague la retina con 1x PBS.

3. Tinción inmunofluorescente de las CGR

  1. Transfiera cuidadosamente la retina a una placa de hemaglutinación de 24 pocillos con una pipeta plástica de Pasteur y bloquee en un 5% de PBS-TX-BSA (5 g de polvo de albúmina de suero bovino disuelto en 100 ml de 1x solución de PBST; el PBST se forma agregando 10 ml de Triton X-100 a 2,000 ml de 1 x PBS) a temperatura ambiente durante 4 h o durante la noche a 4 °C. Mantenga el lado ganglionar hacia arriba.
  2. Extraer el PBS-TX-BSA e incubar la retina a 4 °C durante 48-96 h, añadiendo 100 μL del anticuerpo primario seleccionado (anticuerpo anti-RBPMS de cobaya) mediante una dilución 1:400.
  3. Retire el anticuerpo primario y enjuague la retina tres veces (20 minutos cada una) con 1x PBS, agitando a temperatura ambiente.
  4. Incubar la retina con agitación suave durante la noche a 4 °C con 100 μL del anticuerpo secundario correspondiente (ver Tabla de materiales), cianina Cy3 affiniPure burro anti-cobaya IgG (H+L), utilizando una dilución 1:400.
  5. Enjuague la retina con 1x PBS tres veces (20 minutos cada una).
  6. Coloque la retina plana sobre el portaobjetos con la capa de células ganglionares hacia arriba, deje caer una cantidad adecuada de agente antifluorescente alrededor de la retina con una pipeta y cubra el portaobjetos con un cubreobjetos (tenga cuidado de no tener burbujas).
    NOTA: Para determinar la cantidad adecuada de calmante antifluorescente, asegúrese de que cubra toda la retina. Después de eso, cubra el portaobjetos sin permitir que la retina flote y se mueva fácilmente.
  7. Selle la corredera alrededor con un agente de sellado para evitar que se mueva. Almacene las muestras a -20 ° C y protéjalas de la luz.
  8. Imagen de la retina con un microscopio fluorescente/confocal.

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Resultados

Después de la disección, la retina debe verse como un trébol plano de cuatro hojas. En este estudio, mediante el uso del protocolo descrito anteriormente, la retina se volvió blanca después de que se agregó metanol (Figura 1). Mientras tanto, la retina cambió de suave a flexible y plana. A continuación, los RGC fueron etiquetados con anti-RBPMS8. Se tomaron cuatro campos de imagen en toda la retina de montaje (n = 3) utilizando un microscopio confocal (ocular: 10x; ob...

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Discusión

La fijación es un paso esencial para preservar la retina, lo que puede afectar cualquier investigación posterior de RGC basada en la morfología. La fijación exitosa captura rápidamente la estructura y el estado de las retinas en el momento de exponerlas al medio de fijación, lo cual es crítico para un análisis posterior. Aunque el formaldehído ha sido considerado como uno de los agentes fijadores más comunes para la fijación y preservación de tejidos y células, el formaldehído por sí solo no siempre funciona bien como fi...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conocimiento de ninguna afiliación, membresía, financiamiento o tenencia financiera que pueda afectar la objetividad de este estudio.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Proyecto de Apertura de Hubei Key Laboratories (subvención no. 2021KFY055), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Hubei (subvención no. 2020CFB240) y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (subvención no. 2042020kf0065).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Clúster de cultivo celular de 24 pocillosCostarFijación del globo ocular
placa de hemaglutinación de 24 pocillosLabedit CompanyAnticuerpo de incubación
Portaobjetos de microscopio de adhesiónCitotestO similar
Montaje de enfriamiento antifluorescenteServicebioG1401Ralentización del enfriamiento por fluorescencia
BSA (albúmina sérica bovina)ServicebioGC305010Reactivo de bloqueo
Microscopio confocalOLYMPUSApply Lente de objetivo de 40x
Tijeras curvasJiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.Herramientas de disección
Microscopio de disecciónRWD Life science Co.,LTD 77001S Herramientas dedisección
PinzasJiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.Herramientas de disección
MetanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.20210624GC≥ 99.5%
Esmalte de uñasSecheViteAgente sellador
Agujas Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.Acelere la fijación
Solución de paraformaldehídoServicebioG1101Fijación del globo ocular
PBS (solución salina tamponada con fosfato pH 7,4)ServicebioG0002Enjuague el globo ocular 
Anticuerpo primario: proteína de unión al ARN anti-ARN de conejillo de indias con empalme múltiple (RBPMS)PhosphoSolutionsCat. #1832-RBPMSPara inmunofluorescencia. Utilizado a 1:400
Anticuerpo secundario: Cy3 affiniPure burro anti-cobaya IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch706-165-148Para inmunofluorescencia. Utilizado en 1:400
Tijeras rectasJiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.Herramientas de disección

Referencias

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