Method Article

Andamios descelularizados derivados de la manzana para la ingeniería de tejidos óseos in vitro e in vivo

DOI:

10.3791/65226

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February 23rd, 2024

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1Department of Physics, University of Ottawa, 2Department of Biology, University of Ottawa, 3Department of Mechanical Engineering, University of Ottawa, 4Department of Surgery, University of Ottawa, 5Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 6Institute for Science, Society and Policy, University of Ottawa, 7SymbioticA, School of Human Sciences, University of Western Australia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este estudio, detallamos métodos de descelularización, caracterización física, imagen e implantación in vivo de biomateriales de origen vegetal, así como métodos para la siembra y diferenciación celular en los andamios. Los métodos descritos permiten la evaluación de biomateriales de origen vegetal para aplicaciones de ingeniería de tejidos óseos.

Abstract

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Los biomateriales de celulosa de origen vegetal se han empleado en diversas aplicaciones de ingeniería de tejidos. Los estudios in vivo han demostrado la notable biocompatibilidad de los andamios hechos de celulosa derivada de fuentes naturales. Además, estos andamios poseen características estructurales que son relevantes para múltiples tejidos, y promueven la invasión y proliferación de células de mamíferos. Investigaciones recientes con tejido de hipantio de manzana descelularizado han demostrado la similitud de su tamaño de poro con el del hueso trabecular, así como su capacidad para apoyar eficazmente la diferenciación osteogénica. El presente estudio examinó más a fondo el potencial de los andamios de celulosa derivados de la manzana para aplicaciones de ingeniería de tejidos óseos (BTE) y evaluó sus propiedades mecánicas in vitro e in vivo . Los preosteoblastos MC3T3-E1 se sembraron en andamios de celulosa derivados de manzanas que luego se evaluaron por su potencial osteogénico y propiedades mecánicas. La tinción con fosfatasa alcalina y rojo de alizarina S confirmó la diferenciación osteogénica en andamios cultivados en medio de diferenciación. El examen histológico demostró una invasión celular generalizada y mineralización a través de los andamios. La microscopía electrónica de barrido (SEM) reveló agregados minerales en la superficie de los andamios, y la espectroscopia de dispersión de energía (EDS) confirmó la presencia de elementos fosfato y calcio. Sin embargo, a pesar de un aumento significativo en el módulo de Young después de la diferenciación celular, se mantuvo más bajo que el del tejido óseo sano. Los estudios in vivo mostraron la infiltración celular y el depósito de matriz extracelular dentro de los andamios derivados de manzanas descelularizados después de 8 semanas de implantación en calvaria de rata. Además, la fuerza requerida para retirar los andamios del defecto óseo fue similar a la carga de fractura previamente reportada del hueso nativo de la pantorrilla. En general, este estudio confirma que la celulosa derivada de la manzana es una candidata prometedora para las aplicaciones de BTE. Sin embargo, la disimilitud entre sus propiedades mecánicas y las del tejido óseo sano puede restringir su aplicación a escenarios de baja carga. Es posible que sea necesaria una reingeniería y optimización estructural adicional para mejorar las propiedades mecánicas de los andamios de celulosa derivados de la manzana para aplicaciones de carga.

Introduction

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Los defectos óseos grandes causados por una lesión o enfermedad a menudo requieren injertos de biomaterial para unaregeneración completa. Las técnicas actuales diseñadas para mejorar la regeneración del tejido óseo utilizan regularmente injertos autólogos, alogénicos, xenogénicos o sintéticos2. Para el injerto óseo autólogo, considerado la práctica de injerto "estándar de oro" para reparar defectos óseos grandes, el hueso se extrae del paciente. Sin embargo, este procedimiento de injerto tiene varios inconvenientes, como las limitaciones de tamaño y forma, la disponibilidad de tejido y la morbilidad del sitio de muestreo3. Además, los procedimientos de injerto autólogo son susceptibles a infecciones del sitio quirúrgico, fracturas posteriores, formación de hematomas en el sitio de muestreo o reconstruido y dolor postoperatorio4. La ingeniería de tejidos óseos (BTE) ofrece una alternativa potencial a los métodos convencionales de injerto óseo5. Combina biomateriales estructurales y células para construir nuevo tejido óseo funcional. Al diseñar biomateriales para BTE, es fundamental combinar una estructura macroporosa, una química de superficie que promueva la adhesión celular y propiedades mecánicas que se asemejen mucho a las del hueso nativo6. Investigaciones anteriores han indicado que el tamaño de poro ideal y el módulo elástico para los biomateriales utilizados en BTE son aproximadamente 100-200 μm7 y 0,1-20 GPa, respectivamente, dependiendo del sitio de injerto8. Además, la porosidad y la interconectividad de poros de los andamios son factores críticos que afectan la migración celular, la difusión de nutrientes y la angiogénesis8.

El BTE ha mostrado resultados prometedores con diversos biomateriales desarrollados y evaluados como opciones alternativas a los injertos óseos. Algunos de estos biomateriales son materiales osteoinductivos, materiales híbridos e hidrogeles avanzados8. Los materiales osteoinductivos estimulan el desarrollo de estructuras óseas recién formadas. Los materiales híbridos están compuestos de polímeros sintéticos y/o naturales8. Los hidrogeles avanzados imitan la matriz extracelular (MEC) y son capaces de suministrar los factores bioactivos necesarios para promover la integración del tejido óseo8. La hidroxiapatita es un material tradicional y una opción común para el BTE debido a su composición y biocompatibilidad9. El vidrio bioactivo es otro tipo de biomaterial para la BTE, que ha demostrado estimular respuestas celulares específicas para activar genes necesarios para la osteogénesis10,11. Los polímeros biodegradables, incluidos el poli(ácido glicólico) y el poli(ácido láctico), también se han utilizado ampliamente en aplicaciones de EEB12. Por último, los polímeros naturales o de origen natural como el quitosano, la quitina y la celulosa bacteriana también han demostrado resultados alentadores para el BTE13. Sin embargo, si bien tanto los polímeros sintéticos como los naturales muestran potencial para BTE, el desarrollo de un andamio funcional con la macroestructura deseada generalmente requiere protocolos extensos.

Por el contrario, las estructuras macroscópicas nativas de celulosa se pueden derivar fácilmente de diversas plantas y nuestro grupo de investigación demostró previamente la aplicabilidad de andamios basados en celulosa derivados de plantas a diferentes reconstrucciones de tejidos. De hecho, después de un simple tratamiento con tensioactivo, aprovechamos la estructura inherente del material vegetal, destacando su potencial como biomaterial versátil14. Además, estos andamios a base de celulosa pueden utilizarse para aplicaciones de cultivo de células de mamíferos in vitro 14, son biocompatibles y favorecen la vascularización subcutánea espontánea 14,15,16,17. Tanto nuestro grupo de investigación como otros han demostrado que estos andamios pueden obtenerse a partir de plantas específicas en función de la aplicación prevista 14,15,16,17,18,19,20. Por ejemplo, la estructura vascular observada en los tallos y hojas de las plantas exhibe una sorprendente similitud con la estructura encontrada en los tejidos animales19. Además, los andamios de celulosa derivados de plantas pueden moldearse fácilmente y someterse a modificaciones bioquímicas superficiales para lograr las características deseadas16. En un estudio reciente, incorporamos un tampón de sal durante el proceso de descelularización, lo que condujo a una mejor adhesión celular observada tanto in vitro como in vivo 16. En el mismo estudio, demostramos la aplicabilidad de andamios de celulosa de origen vegetal en biomateriales compuestos mediante la fundición de hidrogeles sobre la superficie de los andamios. En estudios recientes, se ha demostrado que la funcionalización de andamios derivados de plantas mejora su eficacia18. Por ejemplo, un estudio realizado por Fontana et al. (2017) reveló que la adhesión de los fibroblastos dérmicos humanos estaba respaldada por tallos descelularizados recubiertos de RGD, mientras que los tallos no recubiertos no exhibían la misma capacidad18. Además, los autores también demostraron que los fluidos corporales simulados modificados podrían utilizarse para mineralizar artificialmente tallos de plantas descelularizados. En estudios más recientes, exploramos el concepto de osteogénesis mecanosensible en andamios de celulosa derivados de plantas y evaluamos su potencial para BTE17,20. Además, Lee et al. (2019) utilizaron andamios derivados de plantas para cultivar tejidos similares a los huesos en un entorno in vitro 21. A través de evaluaciones exhaustivas de diferentes fuentes vegetales, los autores identificaron los andamios derivados de la manzana como los más óptimos para el cultivo y la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC). Además, los autores propusieron que los atributos estructurales y mecánicos de los andamios derivados de la manzana desempeñan un papel fundamental en su idoneidad para el propósito previsto. Al ser los andamios iniciales derivados de plantas implementados en aplicaciones de ingeniería de tejidos, se ha demostrado ampliamente que los andamios derivados de manzanas poseen una arquitectura sorprendentemente similar a la del hueso humano, especialmente en términos de sus poros interconectados que van de 100 a 200 μm de diámetro 14,21.

En el presente estudio, investigamos más a fondo el potencial de los andamios de celulosa derivados de la manzana para el BTE y realizamos un análisis de sus propiedades mecánicas tanto in vitro como in vivo. Aunque se han realizado estudios sobre el potencial de los andamios derivados de la manzana para la BTE 17,20,21, sus propiedades mecánicas han sido poco investigadas. Los resultados mostraron invasión silvestre y diferenciación osteogénica de preosteoblastos MC3T3-E1 sembrados en andamios que se cultivaron en medio de diferenciación durante 4 semanas. El módulo de Young de estos andamios fue de 192,0 ± 16,6 kPa, que fue significativamente mayor que el de los andamios en blanco (andamios sin células sembradas) (31,6 ± 4,8 kPa) y los andamios sembrados en células cultivados en medio de no diferenciación (24,1 ± 8,8 kPa). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el módulo de Young del tejido óseo humano sano suele estar dentro del rango de 0,1-2 GPa para el hueso trabecular y aproximadamente 15-20 GPa para el hueso cortical8. Sin embargo, después de una implantación de 8 semanas en un defecto de la pantorrilla de roedores, los andamios sembrados con células parecían estar bien integrados en el hueso circundante, como lo demuestra una fuerza máxima promedio de 113,6 N ± 18,2 N en las pruebas de empuje, que es similar a la carga de fractura previamente reportada del hueso nativo de la pantorrilla22. En general, los resultados obtenidos de este estudio son muy prometedores, especialmente para aplicaciones no portantes. Sin embargo, los andamios de celulosa derivados de la manzana no poseen actualmente las propiedades mecánicas necesarias para adaptarse con precisión al tejido óseo circundante en el sitio del implante. En consecuencia, se requiere un mayor desarrollo para liberar todo el potencial de estos andamios.

Protocol

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Los protocolos experimentales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad de Ottawa.

1. Preparación del andamio

  1. Utilice una cortadora de mandolina para cortar manzanas McIntosh (Canada Fancy) en rodajas de 8 mm de grosor. Corta el tejido de hipantio de las rodajas de manzana en cuadrados de 5 mm x 5 mm.
  2. Coloque las muestras cuadradas en dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,1% durante 2 días.
  3. Lavar las muestras descelularizadas con agua desionizada e incubarlas durante la noche a temperatura ambiente (RT) en 100 mM de CaCl2 para eliminar el surfactante restante.
  4. Esterilizar las muestras (es decir, andamios) en etanol al 70% durante 30 minutos, lavarlas con agua desionizada y colocarlas en una placa de cultivo de 24 pocillos antes de la siembra celular.

2. Cultivo celular y siembra de andamios

  1. Mantener las células MC3T3-E1 Subclon 4 en placas tratadas con cultivo celular de 10 cm de diámetro en condiciones de cultivo celular (37 °C en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO2).
  2. Prepare un medio de cultivo celular hecho del medio esencial mínimo de Eagle: modificación alfa (α-MEM) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina.
  3. Separar las células de las placas de cultivo por tripsinización (0,05% de tripsina-EDTA) una vez que alcancen el 80% de confluencia.
  4. Centrifugar la suspensión celular a aprox. 200 x g durante 3 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en α-MEM a 2,5 x 107 células por ml.
  5. Pipetear una alícuota de 40 μL de la suspensión celular en la superficie de los andamios y dejar que las células se adhieran durante 1 h en condiciones de cultivo celular. Posteriormente, agregue 2 mL de medio de cultivo a cada pocillo de cultivo de la placa de cultivo.
  6. Reponga el medio de cultivo cada 2-3 días durante 14 días.
  7. Preparar un medio de diferenciación añadiendo 50 μg/mL de ácido ascórbico y 4 mM de fosfato sódico al medio de cultivo celular descrito anteriormente.
  8. Inducir la diferenciación de las células MC3T3-E1 incubando los andamios en medio de diferenciación durante 4 semanas. Reponga el medio cada 3-4 días. Paralelamente, incubar los andamios en un medio de cultivo sin diferenciación (es decir, un medio sin los suplementos para inducir la diferenciación) durante la misma duración, con el mismo programa de cambio de medio para que sirva como control negativo.

3. Mediciones del tamaño de los poros mediante microscopía de barrido láser confocal

  1. Lave los andamios descelularizados derivados de la manzana con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  2. Incubar los andamios en 1 ml de tinción blanca de calcofluor al 10% (v/v) durante 25 min en la oscuridad a RT.
  3. Lave los andamios (n = 3) con PBS y obtenga imágenes de tres áreas seleccionadas al azar por andamio con un microscopio de barrido láser confocal confocal resonante de alta velocidad (CLSM) con un aumento de 10x, utilizando un canal DAPI, de la siguiente manera:
    1. Configuración del filtro de emisión láser: 405 nm (láser); 425-475 nm (emisión)
    2. Ajuste la potencia del láser y el detector manualmente para garantizar una adquisición óptima de la imagen. Adquiera una pila z de 20 imágenes con un tamaño de paso de 5 μm.
  4. Con el software ImageJ, procese y analice las imágenes confocales de la siguiente manera:
    1. Utilice la función Proyección Z a la intensidad máxima para crear una imagen y aplique la función Buscar bordes para resaltar el borde de los poros.
    2. Traza los poros manualmente con la herramienta Selección a mano alzada .
    3. Coloque cada poro como una elipse, mida la longitud del eje mayor, recopile todas las mediciones (un total de 54 en el presente estudio, 6 en 3 áreas seleccionadas al azar para cada andamio) y calcule la longitud promedio.

4. Análisis de la distribución celular mediante microscopía de barrido láser confocal

  1. Lavar tres veces con PBS los andamios sembrados con células cultivados en el medio de no diferenciación o diferenciación. Fije los andamios con paraformaldehído al 4% durante 10 min.
  2. Lave bien cada andamio con agua desionizada, permeabilice las celdas con una solución de Triton-X 100 durante 5 minutos y vuelva a lavar con PBS.
  3. Incubar los andamios en 1 mL de ácido peryódico al 1% durante 40 min y enjuagar con agua desionizada 14,16.
  4. Incubar los andamios en 1 mL de una solución que contenga 100 mM de metabisulfito de sodio y 0,15 M de ácido clorhídrico, suplementado con 100 μg/mL de yoduro de propidio. Sumerja completamente los andamios en la solución.
  5. Lave los andamios con PBS y tiña los núcleos celulares incubando los andamios en una solución de DAPI de 5 mg/ml durante 10 minutos en la oscuridad. Vuelva a lavar bien y guarde los andamios en PBS antes de tomar imágenes.
  6. Imagine tres superficies seleccionadas al azar de tres andamios diferentes sembrados por células con un CLSM resonante de alta velocidad a un aumento de 10x, utilizando los canales DAPI y TRITC, de la siguiente manera:
    1. Configuración del filtro de emisión láser:
      DAPI: Láser: 405 nm; Emisión: 425-475 nm
      TRITC: Láser: 561 nm; Emisión: 570-620 nm
    2. Ajuste la potencia del láser y el detector manualmente para garantizar una adquisición óptima de la imagen. Adquiera una pila z de 20 imágenes con un tamaño de paso de 5 μm.
  7. Utilice el software ImageJ para procesar las imágenes confocales y crear una proyección máxima en el eje z para el análisis de imágenes utilizando la función Z-Project to Maximum Intensity (Proyecto Z a máxima intensidad ).

5. Análisis de fosfatasa alcalina

  1. Lavar tres veces con PBS los andamios sembrados con células cultivados en el medio de no diferenciación o diferenciación. Fije los andamios con formalina tamponada neutra al 10% durante 30 min. Fije los andamios en blanco (andamios sin células sembradas) para que sirvan como control negativo.
  2. Prepare una solución de tinción de 5-bromo-4-cloro-3'-indolibfosfato y tetrazolio nitroazul (BCIP/NBT) disolviendo una tableta de BCIP/NBT en 10 ml de agua desionizada.
  3. Lave los andamios fijos con una solución de interpolación al 0,05 % y tiña con la solución BCIP/NBT durante 20 minutos a RT. Lave los andamios manchados con una solución de interpolación al 0,05 % y guárdelos en PBS antes de la obtención de imágenes.
  4. Imagina los andamios manchados con una cámara digital de 12 megapíxeles.

6. Análisis de deposición de calcio

  1. Lavar tres veces con PBS los andamios sembrados con células cultivados en el medio de no diferenciación o diferenciación. Fije los andamios con formalina tamponada neutra al 10% durante 30 min. Fije los andamios en blanco (andamios sin células sembradas) para que sirvan como control negativo.
  2. Prepare una solución de tinción de rojo de alizarina S (ARS) al 2 % (p/v).
  3. Lave los andamios fijos con agua desionizada y tíñalos con la solución ARS durante 1 h a RT. Lave los andamios manchados con agua desionizada y guárdelos en PBS antes de la toma de imágenes.
  4. Imagina los andamios manchados con una cámara digital de 12 megapíxeles.

7. Análisis de mineralización

  1. Lavar tres veces con PBS los andamios sembrados con células cultivados en el medio de no diferenciación o diferenciación. Fijar los andamios con paraformaldehído al 4% durante 48 h. Fije los andamios en blanco (andamios sin células sembradas) para que sirvan como control negativo.
  2. Deshidratar las muestras en soluciones que contengan concentraciones de etanol que aumenten del 50% al 100%, como se describió anteriormente23.
  3. Realice microscopía electrónica de barrido (SEM) y espectroscopía de dispersión de energía (EDS) para analizar agregados minerales de la siguiente manera:
    1. Secar las muestras con un secador de punto crítico, siguiendo el protocolo24 del fabricante.
    2. Aplique una capa de oro de 5 nm en los andamios con un recubrimiento de pulverización catódica de oro, siguiendo el protocolo25 del fabricante.
    3. Visualice la superficie de los andamios con un microscopio electrónico de barrido ajustado a 3 kV, con un aumento de 85x.
    4. Realice EDS ajustando el microscopio electrónico de barrido a 15 kV. En tres áreas seleccionadas al azar por andamio, adquiera espectros EDS para el análisis de la composición de agregados minerales.

8. Medidas del módulo de Young

  1. Retire los andamios sembrados con células de su respectivo medio de incubación e inmediatamente analice las muestras.
  2. Utilizando un aparato de compresión uniaxial hecho a medida equipado con una célula de carga de 1,5 N, comprima los andamios (n = 3 por condición) a una velocidad constante de 3 mm·min-1 hasta una tensión de compresión máxima del 10% de la altura del andamio.
  3. Determine el módulo de Young a partir de la pendiente de la parte lineal de las curvas tensión-deformación. En el presente estudio, el módulo se determinó entre el 9% y el 10% de deformación.

9. Análisis de infiltración celular y mineralización por histología: Andamios in vitro

  1. Lavar tres veces con PBS los andamios sembrados con células cultivados en medio de no diferenciación o diferenciación.
  2. Fije los andamios sembrados con células con paraformaldehído al 4% durante 48 h antes de la resuspensión en etanol al 70% para su almacenamiento.
  3. Histología:
    NOTA: En el presente estudio, toda la preparación histológica (inclusión, seccionamiento y tinción) descrita en los siguientes pasos fue realizada por el Centro de Histología Louise Pelletier (Universidad de Ottawa).
    1. Después de la deshidratación y la inclusión en parafina, corte las muestras en secciones seriadas de 5 μm de grosor, comenzando 1 mm dentro de los andamios, y monte las secciones en portaobjetos de microscopio.
    2. Tiñir las secciones con tinciones de hematoxilina y eosina (H&E) o von Kossa (VK).
    3. Visualice las secciones con un microscopio escáner de portaobjetos con un aumento de 40x (n = 1 andamio en medio de no diferenciación y n = 2 andamios en medio de diferenciación en el presente estudio).
    4. Con el software ImageJ, evalúe visualmente la infiltración celular (tinción H&E) y la mineralización (tinción VK).

10. Modelo de defecto de calvario de rata

  1. Obtenga que los protocolos experimentales sean revisados y aprobados por el comité local de cuidado de animales.
  2. Prepare andamios descelularizados circulares (5 mm de diámetro y 1 mm de espesor) siguiendo la Sección 1 descrita anteriormente y utilizando un punzón de biopsia de 5 mm.
  3. Realizar craneotomía bilateral siguiendo un protocolo establecido26, de la siguiente manera:
    1. Anestesiar ratas macho Sprague-Dawley con isoflurano, primero al 3% hasta que estén inconscientes, y luego al 2-3% durante todo el procedimiento.
    2. Exponga el periostio y el cráneo cortando la piel suprayacente con una hoja de bisturí. Retire el periostio.
    3. Crear defectos bilaterales en ambos huesos parietales a cada lado de la sutura sagital utilizando un taladro dental equipado con una trépano de 5 mm de diámetro bajo irrigación constante de NaCl al 0,9%.
    4. Limpie el hueso circundante con NaCl al 0,9 % para eliminar cualquier fragmento óseo.
    5. Coloque los andamios circulares descelularizados en los defectos.
    6. Cierre la piel suprayacente con suturas 4-0.
  4. Dale a las ratas acceso ilimitado a comida y agua y vigílalas diariamente.
  5. Después de 8 semanas después de la implantación, eutanasia de las ratas mediante inhalación de CO2 y perforación torácica como medida de eutanasia secundaria.
  6. Para exponer el cráneo y recuperar los implantes, retire la piel que cubre el cráneo con una hoja de bisturí.
  7. Corta el cráneo en los huesos frontal y occipital y en el costado de ambos huesos parietales con un taladro dental para extirpar la sección superior del cráneo por completo.

11. Prueba de empuje hacia afuera

  1. Conecte un dispositivo de compresión uniaxial (con una célula de carga de 445 N) al módulo de adquisición de datos USB.
  2. Conecte el módulo de adquisición de datos a un ordenador equipado con una aplicación de software de adquisición de datos.
  3. Inmediatamente después de la extracción craneal, se debe colocar cada muestra (n = 7 implantes de 4 animales en el presente estudio) en el portamuestras del dispositivo de compresión uniaxial, de modo que la cara dorsal del hueso quede hacia arriba.
  4. Baje el émbolo a 0,5 mm/min hasta tocar ligeramente el implante extraído.
  5. Inicie la prueba bajando el émbolo a través del implante hasta que se empuje completamente hacia afuera mientras aplica compresión a una velocidad constante de 0,5 mm/min utilizando el software de adquisición de datos.
  6. Registre la fuerza máxima en la curva de fuerza frente a desplazamiento utilizando el software de adquisición de datos.

12. Análisis de infiltración celular y mineralización por histología: andamios in vivo

  1. Fijar la calvaria extraída y los implantes en formol tamponado neutro al 10% durante 72 h antes de la resuspensión en etanol al 70% para su almacenamiento.
  2. Histología:
    NOTA: En el presente estudio, toda la preparación histológica (inclusión, seccionamiento y tinción) descrita en los siguientes pasos fue realizada por Accel Labs (Montreal, QC, Canadá).
    1. Corte las muestras (incrustadas en metacrilato de metilo) en secciones de 6 μm de grosor en tres niveles diferentes (superior, inferior y hacia el centro) y móntelas en portaobjetos de microscopio.
    2. Tiñe las secciones con H&E o tricrómico de Masson-Goldner (MGT).
  3. Obtener imágenes de las secciones con un microscopio escáner de portaobjetos con un aumento de 40x (4 explantes de 2 animales en el presente estudio).
  4. Con el software ImageJ, evalúe visualmente la infiltración celular (tinción H&E) y la deposición de colágeno (tinción MGT).

Results

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Medición del tamaño de los poros, distribución celular y mineralización in vitro (Figura 1 y Figura 2)
La eliminación completa de los componentes celulares nativos de los andamios de tejido de manzana se logró después de tratar los andamios con SDS y CaCl2 (Figura 1A). Los andamios presentaban una estructura altamente porosa, lo que se confirmó mediante microscopía confocal. La cuantificación de las imágenes demostró un tamaño medio de poro de 154 μm ± 40 μm. La distribución del tamaño de los poros osciló entre 73 μm y 288 μm. Sin embargo, la mayoría de los poros oscilaron entre 100 μm y 200 μm (Figura 1C).

Después de un período de cultivo de 4 semanas en medio de diferenciación, los andamios sembrados con células exhibieron depósitos minerales blancos generalizados (Figura 1A). Los andamios que contenían células mostraban una coloración blanca opaca, lo que sugiere mineralización, que no se observó en los andamios en blanco (andamios sin células sembradas). Además, el análisis mediante microscopía de barrido láser confocal reveló una distribución celular homogénea dentro de los andamios (Figura 1B).

Los andamios sembrados o no con células se tiñeron con BCIP/NBT y ARS para analizar la actividad de ALP y la mineralización, respectivamente (Figura 1D). La tinción BCIP/NBT reveló un aumento sustancial en la actividad de ALP (representada por un fuerte color púrpura) dentro de los andamios sembrados con células cultivados en medio de diferenciación, en contraste con los andamios en blanco o los andamios sembrados con células cultivados en medio de no diferenciación. Del mismo modo, los andamios sembrados con células cultivados en medio de diferenciación exhibieron un color rojo más intenso al teñirse con ARS, lo que indica una mayor mineralización en comparación con los andamios en blanco o los andamios sembrados con células cultivados en medio de no diferenciación. Se observó tinción de fondo en los andamios en blanco, posiblemente debido a la presencia de CaCl2 en el protocolo de descelularización.

Se realizó tinción (H&E y VK) en los andamios para analizar la infiltración celular y la mineralización, y se utilizaron SEM y EDS para evaluar más a fondo la mineralización (Figura 2). La tinción de H&E (Figura 2A) mostró una buena infiltración celular en los andamios sembrados con células cultivados en medio de no diferenciación o diferenciación. Múltiples núcleos eran visibles en la periferia y a lo largo de los andamios. También se observó la presencia de colágeno en los andamios de color rosa pálido. Además, la tinción de VK realizada en los andamios después de 4 semanas de cultivo en medio de diferenciación reveló que las paredes de los poros estaban teñidas, mientras que los depósitos de calcio se detectaron únicamente a lo largo de los bordes exteriores de las paredes de los poros en los andamios cultivados en medio de no diferenciación y pueden haber sido el resultado de la absorción de calcio durante el tratamiento de descelularización. La mineralización localizada en la superficie de los andamios sembrados en células cultivados en medio de diferenciación durante 4 semanas se observó mediante análisis SEM (Figura 2B). Más específicamente, se observaron depósitos minerales que se asemejan a agregados esferoides en la periferia de los poros. Por el contrario, no se observaron agregados minerales en los andamios en blanco ni en los andamios sembrados con células cultivados durante 4 semanas en medio de no diferenciación. Se observaron picos característicos distintivos correspondientes a fósforo (P) y calcio (Ca) en los espectros EDS de las regiones de interés seleccionadas, específicamente en los depósitos minerales observados en los andamios sembrados con células cultivados durante 4 semanas en medio de diferenciación (Figura 2B).

Análisis biomecánico in vitro (Figura 3)
El módulo de Young de los andamios sembrados con células se midió después de 4 semanas de cultivo en medio de no diferenciación o diferenciación (n = 3 para cada condición experimental). Se comparó con el módulo de Young de los andamios en blanco (andamios sin células sembradas) (Figura 3). No se observaron diferencias significativas en el módulo entre los andamios en blanco (31,6 kPa ± 4,8 kPa) y los andamios sembrados en células cultivados en medio de no diferenciación (24,1 kPa ± 8,8 kPa; p = 0,88). Por el contrario, se observó una diferencia significativa entre el módulo de los andamios en blanco (31,6 kPa ± 4,8 kPa) y el de los andamios sembrados en células cultivados en medio de diferenciación (192,0 kPa ± 16,6 kPa; p < 0,001). Además, se observó una diferencia significativa (p < 0.001) entre los módulos de Young de los andamios sembrados en células cultivados en medios de no diferenciación y diferenciación. La Figura 1 suplementaria muestra una curva típica de tensión-deformación para el cálculo del módulo de Young.

Rendimiento biomecánico in vivo y regeneración ósea (Figura 4 y Figura 5)
Se realizaron craneotomías quirúrgicas en un total de 6 ratas Sprague-Dawley. Se crearon defectos bilaterales de 5 mm de diámetro en ambos huesos parietales del cráneo utilizando una fresa de trépano y se implantaron andamios de celulosa derivados de manzana sin células sembradas en los defectos de la pantorrilla (Figura 4A). Después de 8 semanas de implantación, los animales fueron sacrificados y la parte superior de sus cráneos fue recolectada y procesada para pruebas mecánicas o análisis histológicos.

Según la evaluación visual, los andamios parecían estar bien integrados en los tejidos que rodean el cráneo. Se realizaron pruebas mecánicas de empuje para evaluar cuantitativamente la integración de los andamios (n = 7) en la calvaria huésped. Las mediciones se realizaron utilizando un dispositivo de compresión uniaxial (Figura 4B) inmediatamente después de la eutanasia de los animales. Los resultados revelaron que la fuerza máxima fue de 113,6 N ± 18,2 N (Tabla 1).

Se realizó un análisis histológico para evaluar la infiltración celular y el depósito de matriz extracelular dentro de los andamios implantados (Figura 5). La tinción de H&E reveló infiltración celular dentro de los poros del andamio y evidencia de vascularización, como lo demuestra la presencia de vasos sanguíneos dentro de los andamios. Además, la tinción con MGT demostró la presencia de colágeno dentro de los andamios.

figure-results-1
Figura 1: Imágenes del andamio, distribución del tamaño de los poros y mineralización in vitro . (A) Fotografías representativas de un andamio de celulosa derivado de la manzana después de la eliminación de las células nativas y el surfactante (izquierda) y un andamio sembrado con células MC3T3-E1 después de 4 semanas de cultivo en medio de diferenciación osteogénica (derecha). La barra de escala representa 2 mm. (B) Imágenes representativas del microscopio de escaneo láser confocal que muestran células sembradas en andamios de celulosa derivados de manzana después de 4 semanas de cultivo en medio de no diferenciación ("ND") o medio de diferenciación osteogénica ("D"). La barra de escala representa 50 μm. La tinción se realizó en los andamios para celulosa (rojo) con yoduro de propidio y para núcleos celulares (azul) con DAPI. (C) Distribución del tamaño de los poros de los andamios de celulosa derivados de manzanas descelularizados, antes de ser sembrados con células MC3T3-E1, a partir de proyecciones máximas en el eje z de las imágenes confocales. El análisis se realizó en un total de 54 poros en 3 andamios diferentes (6 poros en 3 regiones de interés seleccionadas al azar por andamio). (D) Imágenes representativas de andamios teñidos con 5-bromo-4-cloro-3'-indolibfosfato y nitro-azul tetrazolio (BCIP/NBT) para evaluar la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) y con rojo de alizarina S (ARS) para visualizar la deposición de calcio, lo que indica mineralización (barra de escala = 2 mm - se aplica a todos). Los andamios marcados como "en blanco" (andamios sin células sembradas) no mostraron tinción con BCIP/NBT, lo que indica la ausencia de actividad de ALP. Por otro lado, los andamios sembrados con células cultivados en medio de diferenciación ("D") mostraron una mayor actividad de ALP, indicada por un color azul más intenso, en comparación con los andamios sembrados con células cultivados en medio de no diferenciación ("ND"). Para la tinción con ARS, tanto los andamios en blanco como los andamios cultivados en medio de no diferenciación ("ND") exhibieron un tono más claro de rojo en comparación con los andamios cultivados en medio de diferenciación ("D"). La presencia de deposición de calcio en los andamios cultivados en medio de diferenciación ("D") se ilustró con un color rojo intenso y profundo. Cada análisis se realizó en tres andamios diferentes (n = 3). Esta figura fue adaptada con permiso de Leblanc Latour (2023)27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Análisis histológico, microscopía electrónica de barrido (SEM) y espectroscopía de dispersión de energía (EDS) de andamios in vitro . (A) Imágenes representativas de las secciones transversales histológicas superiores de los andamios. Los andamios incluidos en parafina se cortaron en secciones de 5 μm de espesor que se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para visualizar la infiltración celular, o con von Kossa (VK) para visualizar la mineralización dentro de los andamios. Los andamios se infiltraron con células MC3T3-E1, como lo demuestra la tinción azul (núcleos) y rosa (citoplasma) visible en la periferia y en todo el andamio. El colágeno (rosa pálido) también era visible (recuadro ampliado de "H&E - D"). La mineralización se observó solo en la periferia de las paredes de los poros en los andamios cultivados en medio de indiferenciación ("ND"). Las paredes de los poros de los andamios cultivados en medio de diferenciación ("D") se tiñeron completamente de negro. El análisis se realizó en un andamio cultivado en medio de no diferenciación ("ND") y en dos andamios cultivados en medio de diferenciación ("D") (barra de escala para las imágenes de menor aumento = 1 mm, barra de escala para las imágenes de mayor aumento = 50 μm). (B) Micrografías representativas obtenidas por SEM, así como espectros EDS. Los andamios se sometieron a un recubrimiento de pulverización catódica con oro y se obtuvieron imágenes utilizando un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo a un voltaje de 3,0 kV (barra de escala = 100 μm - se aplica a todos). Se adquirieron espectros EDS en cada andamio. Los picos de fósforo (2,013 keV) y calcio (3,69 keV) se denotan en cada espectro EDS. Tanto el SEM como el EDS se realizaron en tres andamios diferentes. En blanco: andamios sin células sembradas. Esta figura fue adaptada con permiso de Leblanc Latour (2023)27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Módulos de Young de andamios in vitro después de 4 semanas de cultivo en medio de no diferenciación ("ND") o medio de diferenciación ("D"). Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM) de tres muestras replicadas para cada condición. La significación estadística (* indica p<0,05) se determinó mediante un análisis de varianza de una vía (ANOVA) y la prueba post-hoc de Tukey. En blanco: andamios sin células sembradas. Esta figura fue adaptada con permiso de Leblanc Latour (2023)27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Fotografía del andamio antes de la implantación y prueba de empuje después de 8 semanas de la implantación: (A) Fotografía representativa de un andamio antes de la implantación; (B) Dispositivo de compresión uniaxial utilizado para los ensayos de empuje, con la célula de carga indicada con un asterisco (*) y la muestra indicada con una flecha. Esta figura fue adaptada con permiso de Leblanc Latour (2023)27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-5
Figura 5: Análisis histológico de andamios in vitro . Imágenes representativas de cortes transversales histológicos de andamios sin siembra después de 8 semanas de implantación. Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para visualizar las células o tricrómico de Masson-Goldner (MGT) para visualizar el colágeno. La flecha indica glóbulos rojos. La presencia de colágeno es visible (barra de escala = 1 mm y 200 μm para las inserciones izquierda y derecha, respectivamente). Esta figura fue adaptada con permiso de Leblanc Latour (2023)27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Número de muestraFuerza máxima (N)
192.8
2162.7
3140.3
4135.7
537.7
6157.8
767.9
Significar113.6
SEM18.2

Tabla 1: Fuerza máxima medida de las pruebas de empuje.

Figura complementaria 1: Curva típica de tensión-deformación para el cálculo del módulo de Young. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

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Varios estudios in vitro e in vivo han demostrado la biocompatibilidad de la celulosa de origen vegetal y su potencial uso en ingeniería de tejidos 14,15,16,18,19,20, más específicamente para albergar la diferenciación osteogénica 20,21. Los objetivos del presente estudio fueron investigar más a fondo el potencial de los andamios de celulosa derivados de la manzana para la EEB y evaluar las propiedades mecánicas de estos andamios tanto in vitro como in vivo.

Para estudios in vitro, las células preosteoblásticas (MC3T3-E1) se sembraron en los andamios después de eliminar las células nativas del tejido de la manzana. Las células MC3T3-E1 se utilizan comúnmente para investigar la biomineralización de la matriz extracelular 28,29,30. A continuación, los andamios se cultivaron durante 4 semanas en un medio de diferenciación o no diferenciación osteogénica. Los hallazgos indicaron que las células proliferaron y experimentaron diferenciación dentro de los andamios, especialmente cuando se cultivaron en medio de diferenciación, lo que destaca el potencial de los andamios de celulosa derivados de manzanas para apoyar el desarrollo del tejido óseo. Los núcleos celulares fueron observados en gran número en los poros del andamio, corroborando las observaciones reportadas en estudios anteriores 14,15,16,17,20,21. Además, de manera similar a nuestros hallazgos anteriores14 y los de otro grupo21, el diámetro promedio de los poros del andamio fue de ~154 μm, con la mayoría de los poros con diámetros entre 100 μm y 200 μm (Figura 1C). Estas dimensiones concuerdan con el rango ideal de tamaño de poro (100-200 μm) conocido por facilitar el crecimiento óseo7.

El análisis de tinción mostró una mayor actividad de ALP después de un período de cultivo de 4 semanas en medio de diferenciación. Se observaron más depósitos de calcio en la superficie de los andamios sembrados con células cultivados en medio de diferenciación en comparación con los andamios en blanco y los andamios sembrados con células cultivados en medio de no diferenciación. Se han observado resultados similares con hiPSCs diferenciadas en andamios derivados de manzanas21. Si bien la presencia de FA se evaluó cualitativamente en el presente estudio, se pudieron realizar ensayos adicionales para un análisis cuantitativo. La evaluación histológica de los andamios confirmó además que los osteoblastos infiltrados mineralizaron los andamios después de la diferenciación. Cabe destacar que la periferia de los constructos cultivados en medio de no diferenciación también se tiñó con VK. El CaCl2 residual en los andamios puede haber causado esta tinción inespecífica observada en la periferia después de la descelularización. Se realizó un análisis cualitativo de las imágenes SEM para evaluar más a fondo la mineralización. Después del cultivo en medio de diferenciación, los andamios sembrados con células mostraron signos de mineralización de ECM. Los agregados minerales eran visibles en la superficie del andamio, específicamente en los bordes de los poros. Estas observaciones son consistentes con estudios previos que utilizaron ECM30 y andamios derivados de plantas21. Estos agregados estaban ausentes en la superficie de los andamios sin células sembradas. El análisis EDS de los agregados reveló la presencia de altos niveles de P y Ca, lo que sugiere la presencia de apatita. Cabe destacar que, si bien el protocolo descrito en el presente estudio permite visualizar la infiltración celular y la presencia de mineralización, no permite evaluar su progresión en el tiempo. Sería necesario realizar un análisis histológico en múltiples momentos para evaluar completamente esta progresión. Además, se requerirían análisis adicionales para cuantificar la infiltración celular y la mineralización en la superficie, así como en todo el andamio. Por último, si bien la composición elemental de los depósitos minerales se determinó mediante EDS, pueden ser necesarias otras técnicas de caracterización, como la difracción de rayos X (DRX), para proporcionar información sobre la estructura cristalina de los depósitos observados.

El módulo de Young de los andamios fue significativamente mayor después del cultivo en el medio de diferenciación (aproximadamente 8 veces). Por el contrario, el módulo de los andamios cultivados en medio de no diferenciación se asemejó al de los andamios en blanco (andamios sin células sembradas), similar a los hallazgos reportados en un estudio previo con andamios derivados de manzana20. A pesar del mayor módulo de Young de los andamios cultivados en medio de diferenciación, se mantuvo mucho más bajo que el del hueso natural (0,1 a 2 GPa para el hueso trabecular y 15 a 20 GPa para el hueso cortical)8, aloinjerto esponjoso (3,78 GPa)31, injertos aloplásticos de poli-éter-éter-cetona (3,84 GPa)31, titanio (50,20 GPa)31 y aleación de cobalto-cromo (53,15 GPa)31 Implantes. Por lo tanto, los andamios en su formulación actual pueden no ser adecuados para aplicaciones de carga. Cabe destacar que el módulo de Young proporciona información sobre la rigidez de un material. Sin embargo, también se podría considerar el límite elástico para proporcionar una comprensión más amplia de las propiedades mecánicas del andamio.

A continuación, se implantaron andamios de manzana descelularizados en defectos bilaterales de calvario de tamaño crítico de 5 mm en ratas (n = 6 animales). Las pruebas de empuje hacia afuera (en 7 explantes), realizadas para evaluar la integración de los andamios dentro de la calvaria huésped, indicaron que la fuerza máxima promedio fue de 113,6 N ± 18,2 N, lo que es similar a la carga de fractura previamente reportada para el hueso del calvario (127,1 ± 9,6 N)22, lo que sugiere que los andamios se integraron bien en el tejido óseo circundante. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la prueba de empuje solo proporciona información sobre la interfaz entre el andamio y el tejido circundante. Estudios previos han combinado pruebas de empuje con pruebas de indentación para proporcionar una comprensión más amplia de las propiedades mecánicas de la interfaz hueso-implante y del propio andamio22. Además, los defectos bilaterales son más propensos a la desalineación con el émbolo32. La colocación adecuada del explante craneal, el modelo de defecto único o el sistema de sujeción adicional en el dispositivo de prueba universal podría evitar la desalineación32.

En resumen, este estudio confirmó que los andamios de celulosa derivados de la manzana podrían promover la adhesión y proliferación de los preosteoblastos. Además, la mineralización se produjo dentro de los andamios sembrados en células cultivados en medio de diferenciación, lo que llevó a un aumento en el módulo de Young del andamio. Sin embargo, el módulo permaneció significativamente más bajo que el del hueso natural. Curiosamente, la fuerza necesaria para desplazar los andamios de celulosa derivados de la manzana implantados era comparable a la carga de fractura del hueso de la pantorrilla y otros tipos de andamios utilizados anteriormente para BTE22. Finalmente, de manera similar a los resultados ilustrados en informes anteriores, las células se infiltraron en los andamios implantados y depositaron colágeno. En general, este estudio demuestra el potencial de los andamios de celulosa derivados de plantas para aplicaciones de BTE. Estos hallazgos concuerdan con un estudio previo realizado por un grupo de investigación diferente, que corrobora aún más la idoneidad de los andamios de celulosa de origen vegetal para fines de EEB21. Sin embargo, la disparidad en la rigidez de los andamios en comparación con el hueso trabecular o cortical pone de relieve la importancia de desarrollar biomateriales compuestos que puedan igualar más estrechamente las propiedades mecánicas del hueso natural. Por lo tanto, a pesar del creciente interés en la utilización de andamios derivados de plantas para fines de BTE, su uso puede seguir estando limitado a aplicaciones no portantes. Como demostramos anteriormente16, la reingeniería de andamios de celulosa derivados de plantas mediante la modificación química o el desarrollo de compuestos con otros polímeros biológicos/sintéticos puede ser esencial para aplicaciones de carga.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Declaración de conflicto de intereses: M.L.L., M.T. R.J.H., C.M.C., I.C. y A.P. son inventores de solicitudes de patente presentadas por la Universidad de Ottawa y Spiderwort Inc. en relación con el uso de celulosa de origen vegetal para aplicaciones de EEB. M.L.L., R.J.H., C.M.C. y A.P. tienen intereses financieros en Spiderwort Inc.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La financiación de este proyecto fue proporcionada por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) (Discovery Grant) y por la Fundación Li Ka Shing. M.L.L. recibió apoyo del programa TalentEdge de los Centros de Excelencia de Ontario, y R.J.H. recibió el apoyo de una beca de posgrado de NSERC y una beca de posgrado de Ontario (OGS).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4′,6-diamidino-2-fenilindolThermoFisherD1306DAPI
Alizarina roja SSigma-AldrichA5533ARS
Ácido ascórbicoSigma-AldrichA4403Cultivo celular
Cloruro de calcioThermoFisherAA12316CaCl2
Calcofluor blancoSigma-Aldrich18909
TaladroHerramienta quirúrgica
EtanolThermoFisher615095000
Suero fetal bovinoHyclone Laboratories SH30396FBS
FormalinaSigma-AldrichHT50112810% Formalina
Tinción tricrómica de GoldnerSigma-Aldrich1.00485GTC
Hematoxilina y tinción de eosinaFisher ScientificNC1470670H& E
Microscopio de barrido láser confocal resonante de alta velocidadNikonNikon Ti-E A1-R
Ácido clorhídricoSigma-Aldrich258148
software ImageJInstitutos Nacionales de Salud
Irrigación salinaBaxterJF71230.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclon 4 celdasATCCCRL-2593Células preosteoblásticas
ManzanasCanadá
Metacrilato de metiloSigma-AldrichM55909Inclusión histológica
Medio esencial mínimoThermoFisherM0894α-MEM
ParaformaldehídoFisher ScientificO40424%; PFA
Penicilina/EstreptomicinaHyclone LaboratoriesSV30010Cultivo Celular
Ácido peryódicoSigma-Aldrich375810
Solución salina tamponada con fosfatoHyclone Laboratories2810305PBS; sin Ca2+ y Mg2+
Yoduro de propidioInvitrogenp3566
Escaneo microscopio electrónicoJEOLJSM-7500F FESEMSEM y EDS
Microscopio escáner de portaobjetosZeissAXIOVERT 40 CFL
Dodecil sulfato de sodioFisher ScientificBP166SDS
Metabisulfito de sodioSigma-Aldrich31448
Fosfato de sodioThermoFisherBP329
Ratas Sprague-DawleyCharles-River Laboratories400
SuturasEthiconJ494G4-0
TrephineACE Surgical Supply Co583-01825 mm de diámetro
Triton-X 100ThermoFisher807423
TrypsinHyclone LaboratoriesSH30236.02Tween Cell Culture
FisherScientificBP337
Dispositivo de compresión universalCellScaleUniVert
Von Kossa tinciónSigma-Aldrich1.00362Histología
dental McIntosh de grado fantasía Macho

References

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