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Artículo de método

Síntesis directa de nanopartículas de oro EM-visibles en células para análisis de localización de proteínas con ultraestructura bien conservada

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DOI:

10.3791/65246

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28 de abril de 2023

1National Institute of Biological Sciences, Beijing, 2Tsinghua Institute of Multidisciplinary Biomedical Research, Tsinghua University

En este artículo

Resumen

El presente protocolo describe una tecnología de etiquetado de microscopía electrónica clonable para detectar proteínas marcadas con metalotioneína en células utilizando una nueva técnica de síntesis de nanopartículas de oro basada en el mecanismo de supresión de autonucleación.

Resumen

El análisis de la localización precisa de moléculas de proteínas en células con resolución ultraestructural es de gran importancia para el estudio de diversos procesos fisiológicos o patológicos en todos los organismos vivos. Por lo tanto, el desarrollo de etiquetas clonables que se pueden utilizar como sondas de microscopía electrónica es de gran valor, al igual que las proteínas fluorescentes han jugado un papel crucial en el campo de la imagen óptica. Recientemente se descubrió el mecanismo de supresión de autonucleación (ANSM), que permite la síntesis específica de nanopartículas de oro (AuNP) en etiquetas ricas en cisteína, como la metalotioneína (MT) y la proteína anticongelante (AFP).

Basado en el ANSM, se desarrolló una tecnología de etiquetado por microscopía electrónica, que permite la detección específica de proteínas marcadas en células procariotas y eucariotas con una eficiencia de etiquetado sin precedentes. Este estudio ilustra un protocolo para la detección de proteínas de fusión MTn (una variante de MT diseñada que carece de residuos reactivos al aldehído) en células de mamíferos con una ultraestructura bien conservada. En este protocolo, la congelación a alta presión y la fijación por congelación y sustitución por congelación se realizaron utilizando fijadores no aldehídos (como ácido tánico, acetato de uranilo) para preservar la ultraestructura casi nativa y evitar daños a la actividad de la etiqueta causada por la reticulación de aldehído.

Se utilizó una simple rehidratación de un solo paso antes de la síntesis de AuNP basada en ANSM. Los resultados mostraron que las proteínas marcadas se dirigieron a varios orgánulos, incluidas las membranas y la luz del retículo endoplásmico (RE), y las matrices mitocondriales se detectaron con alta eficiencia y especificidad. Esta investigación proporciona a los biólogos un protocolo robusto para abordar una enorme gama de cuestiones biológicas a nivel de molécula única en contextos ultraestructurales celulares.

Introducción

En la era postgenómica, el desarrollo de la proteína fluorescente verde (GFP) como reportero de una sola molécula para microscopía óptica ha revolucionado el campo de la investigación moderna en ciencias de la vida 1,2. Durante décadas, la microscopía electrónica (EM) ha sido una herramienta poderosa para observar intuitivamente la ultraestructura celular con resolución a nanoescala3; Sin embargo, la identificación precisa y la localización de las moléculas de proteínas siguen siendo un desafío.

La técnica de marcado EM más utilizada es la técnica de marcado de microscopía inmunoelectrónica (IEM), que se basa en la reacción antígeno-anticuerpo. Sin embargo, aunque se han desarrollado muchas técnicas en el campo del etiquetado IEM, incluyendo IEM pre-incrustado y IEM post-incrustado (en secciones de resina o criosecciones hidratadas), todavía sufre de baja eficiencia de etiquetado (<10%)4,5, que está relacionado con la preparación de la muestra y la calidad de los anticuerpos. Para superar estas limitaciones, el desarrollo de etiquetas codificadas genéticamente tiene un gran potencial de aplicación.

Dos tipos principales de etiquetas EM se han explorado a fondo en los últimos años. Un tipo es el método de tinción DAB, que utiliza etiquetas como APEX2 para oxidar 3,3'-diaminobencidina (DAB) a polímeros osmiófilos para la visualización EM 6,7,8,9,10,11,12. Permite el etiquetado de proteínas de alta abundancia en regiones subcelulares, pero no es adecuado para el recuento de moléculas individuales. El otro tipo utiliza proteínas de unión a metales, como la ferritina 13 y la metalotioneína (MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, para generar depósitos metálicos densos en electrones en situ para visualización EM. Solo este último tiene un potencial real para la visualización y el conteo de moléculas individuales. El tamaño molecular de la ferritina es demasiado grande (~ 450 kD) para que se use como una etiqueta prometedora, mientras que el pequeño tamaño (~ 5 kD) de MT y su capacidad para unir varios iones a través de sus 20 cisteínas han atraído gran atención. Varios laboratorios han intentado etiquetar proteínas de fusión MT purificadas o células que expresan MT incubando directamente con Au +. Estos intentos han demostrado inicialmente que las etiquetas MT pueden unirse a iones de oro para formar señales de alto contraste, pero ninguno ha logrado realmente la identificación efectiva de proteínas individuales en las células, y no son ampliamente aplicables 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.

La técnica de síntesis de AuNP basada en ANSM, que consiste en sintetizar AuNP de tamaño 2-6 nm directamente en etiquetas ricas en cisteína (por ejemplo, MT, las variantes MT MTn y MTα, AFP) como etiquetas densas en electrones para la visualización EM, es el primer enfoque confiable y aplicable para el etiquetado de proteínas y la detección de moléculas individuales en células24,25,26. Permite la síntesis específica de AuNPs en proteínas aisladas de fusión de etiquetas y ha logrado una eficiencia de etiquetado sin precedentes en células procariotas (E. coli) y eucariotas (S. pombe) no fijas o fijadas químicamente. Sin embargo, implementar el mismo protocolo en sistemas más avanzados, como células de mamíferos o incluso tejidos, implica desafíos adicionales, como la homeostasis redox intracelular más compleja y la estructura celular más frágil.

Este estudio presenta una tecnología de etiquetado EM clonable, que combina la novedosa técnica de síntesis de AuNP basada en ANSM para etiquetar etiquetas ricas en cisteína (MT) codificadas genéticamente con el método de preparación de muestras HPF / FSF -rehidratación-HPF / FSF, permite la identificación inequívoca de una sola molécula de proteínas marcadas en la membrana ER, la luz ER y la matriz mitocondrial en células HeLa. El método actual combina las características de alta eficiencia de etiquetado, una alta relación señal-ruido, etiquetado de una sola molécula y una fuerte universalidad, y este método tiene amplias perspectivas de aplicación en la investigación de ciencias de la vida.

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Protocolo

Todos los suministros utilizados en este experimento se enumeran en la Tabla de materiales. El flujo de trabajo paso a paso del protocolo actual se muestra en la figura 1.

1. Cultivo celular en discos de zafiro

  1. Transfiera discos de zafiro de 3 mm x 0,16 mm a un tubo centrífugo de 2 ml que contenga 1 ml de etanol y sanice en un limpiador ultrasónico durante 10 minutos.
  2. Queme cada disco de zafiro en una llama de lámpara de alcohol hasta que no haya depósitos visibles en la superficie.
    NOTA: A través del método anterior, los discos de zafiro se pueden reciclar muchas veces.
  3. Etiquete un lado de cada disco de zafiro con un número usando una pluma resistente a solventes (Figura 1A).
    NOTA: La pluma marcador utilizada debe probarse para determinar si es resistente a los disolventes de acetona y metanol de antemano para evitar la pérdida de marcas.
  4. Coloque los discos de zafiro etiquetados en el fondo de una placa de cultivo de 35 mm con el lado etiquetado hacia arriba.
  5. Esterilice la placa de cultivo celular con discos de zafiro bajo luz UV durante 30 minutos.
  6. Voltee los discos de zafiro con pinzas (el lado etiquetado hacia abajo) y esterilice bajo luz UV durante 30 minutos adicionales. Ahora, la placa de cultivo que contiene los discos de zafiro está lista para el cultivo celular.
    NOTA: Los discos de zafiro también se pueden esterilizar en autoclave.
  7. Siembra las células en los discos de zafiro preparados anteriormente y crece hasta una confluencia del 80% -90% en una incubadora celular a 37 °C, 95% de humedad y 5% deCO2 (Figura 1B).
    NOTA: Se generaron líneas celulares HeLa estables que expresan etiquetas MTn como se describe en Jiang et al.26.

2. Congelación a alta presión (HPF)

PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido se utiliza en este experimento. Cuando trabaje con nitrógeno líquido, utilice procedimientos de seguridad adecuados y equipo de protección personal para evitar la congelación y la asfixia.

  1. Prepare la máquina de congelación a alta presión al menos 2 h antes del experimento de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  2. Transfiera portadores de aluminio HPF tipo A (hueco: 0.025 / 0.275 mm) a un tubo centrífugo de 2 ml que contenga 1 ml de etanol y sonicar en un limpiador ultrasónico durante 10 min.
  3. Secar los portadores en una placa de Petri cubierta con papel de filtro cualitativo (velocidad media).
  4. Remoje los portadores prelimpiados en 1-hexadeceno.
    NOTA: BSA no se recomienda como crioprotector en el experimento actual, ya que interferirá con la posterior síntesis de nanopartículas de oro.
  5. Use pinzas finas para recoger un disco de zafiro con células de la placa de cultivo; Toque la superficie etiquetada con papel de filtro cualitativo (velocidad media) para eliminar el exceso de medio.
    NOTA: La conductividad térmica del agua es muy baja, y demasiada agua residual afectará el efecto de congelación. Retenga un mínimo de agua para evitar que las células se sequen.
  6. Monte el disco de zafiro en el portamuestras HPF y tape rápidamente el disco con un soporte de aluminio de 0,025 mm de profundidad que contenga 1-hexadeceno (Figura 1C).
  7. Aspirar el exceso de solución con papel de filtro cualitativo (velocidad media).
  8. Cargue el portamuestras para congelarla a alta presión (Figura 1D).
    NOTA: El proceso de carga de la muestra debe ser lo más rápido posible (dentro de 1 minuto) para minimizar las alteraciones fisiológicas debidas a cambios en la temperatura, humedad, pH y contenido de oxígeno.
  9. Descargue el conjunto portador de disco de zafiro bajo nitrógeno líquido en una caja criogénica de espuma y guarde el conjunto en un criovial en nitrógeno líquido antes de usarlo.
    NOTA: El protocolo puede estar en pausa aquí. Las muestras en crioviales se pueden almacenar en un dewar de nitrógeno líquido durante años.

3. Fijación por congelación y sustitución (FSF) y rehidratación (Figura 1E)

  1. Llene la máquina automática de sustitución por congelación (AFS) con nitrógeno líquido y enfríe la cámara a -90 °C.
    PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido se utiliza en este experimento. Cuando trabaje con nitrógeno líquido, utilice procedimientos de seguridad adecuados y equipo de protección personal para evitar la congelación y la asfixia.
  2. Preparar 2 ml de ácido tánico (p/v) al 0,01% en acetona (solución FSF 1) en un recipiente redondo de polipropileno de 20 mm (Figura 1E) en una campana extractora y congelarlo en nitrógeno líquido.
  3. Cargue las muestras (los conjuntos portadores de discos de zafiro) en el recipiente con la solución FSF congelada 1 bajo LN2 utilizando un par de pinzas preenfriadas.
  4. Transfiera el contenedor a la cámara AFS preenfriada para el procesamiento FSF a -90 °C.
  5. Mantener las muestras a −90 °C durante 1 h; Luego, separe los discos de zafiro de los portadores con pinzas preenfriadas y asegúrese de que los lados marcados de los discos de zafiro estén hacia abajo.
    NOTA: Las pinzas deben estar suficientemente preenfriadas para evitar cambios de temperatura. Los discos de zafiro deben separarse fácilmente.
  6. Conservar a -90 °C durante otras 8-10 h; luego, calentar a -60 °C en 3 h.
  7. Sustituir la solución 1 de FSF en el recipiente por acetona preenfriada e incubar durante 1 h. Repita este lavado de acetona 2x.
  8. Calentar a -30 °C en 3 h. Durante este período, prepare y preenfríe 2 ml de acetato de uranilo al 0,01% en acetona (solución 2 de FSF, diluida a partir de acetato de uranilo al 10% en metanol) en un tubo de centrífuga de 2 ml.
    PRECAUCIÓN: El acetato de uranil, utilizado en el experimento actual, es radiactivo y altamente tóxico; Debe manipularse de acuerdo con los procedimientos de seguridad adecuados y eliminarse como residuo químico peligroso.
  9. Sustituir la acetona por la solución 2 de FSF e incubar a -30 °C durante 3 h.
  10. Sustituir la solución 2 de FSF en el recipiente por acetona preenfriada e incubar durante 30 min a −30 °C. Repita este lavado de acetona 2x.
  11. Calentar de -30 °C a 4 °C en 2 h.
  12. Reemplace la acetona con 2 ml de tampón HEPES 0,2 M que contenga 1 mM CaCl 2 y 1 mM MgCl2 a pH 5,5.
  13. Cambie el tampón una vez e incube a temperatura ambiente durante 1 h o a 4 °C durante la noche.
    NOTA: El protocolo puede detenerse aquí durante una noche o continuar durante al menos 6 h hasta que las muestras se congelen nuevamente en el paso 5.

4. Síntesis de AuNP basada en ANSM para células de mamíferos (Figura 1F)

  1. Lavar con tampón PBS-A 3 veces durante 5 minutos cada vez.
  2. Transfiera los discos de zafiro a una placa de cultivo de 35 mm que contenga 1 ml de tampón PBS-A a temperatura ambiente.
    NOTA: Siempre mantenga los lados marcados de los discos de zafiro hacia abajo, y evite superponer los discos de zafiro y frotar las celdas.
  3. Preparar la solución reductora añadiendo 4,28 μL de 2-mercaptoetanol en un tubo de centrífuga de 2 ml que contenga 1 ml de tampón PBS-A y mezclando bien en una campana extractora.
    PRECAUCIÓN: El 2-mercaptoetanol es tóxico y tiene un olor acre; Debe manipularse de acuerdo con los procedimientos de seguridad adecuados.
  4. Reemplace el tampón PBS-A en la placa de cultivo con 1 ml de solución reductora e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
  5. Prepare el precursor de oro antes de usarlo.
    1. Añadir 80 μL de HAuCl4 de 10 mM enddH2Oen un tubo de centrífuga de 2 ml que contenga 1 ml de solución reductora e inmediatamente vórtice.
      NOTA: La solución puede volverse turbia.
    2. Agregue 80 μL de 500 mM de D-penicilamina en ddH2O en la solución anterior, e inmediatamente vórtice.
      NOTA: La solución puede volver a ser clara.
  6. Sustituir la solución en la placa de cultivo por 1 ml de solución precursora de oro preparada en la etapa 4.5 e incubar durante 2 h a 4 °C.
    NOTA: Un mililitro del precursor de oro es suficiente para reaccionar con aproximadamente 1 × 106 celdas (confluente en una placa de 35 mm). Se necesitan mayores volúmenes del precursor cuando los AuNP se vuelven significativamente más pequeños.
  7. Pesar 0,0038 g de NaBH 4 en un tubo de centrífuga de 1,5 ml, añadir 1 ml de ddH2O helado y vórtice para hacer 100 mM de NaBH4 fresco justo antes de su uso.
  8. Añadir 20-100 μL de NaBH 4 a 100 mM a la solución a partir del paso4.6 , agitar inmediatamente para mezclar bien e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Prepare 100 mM NaBH4 recién para su uso inmediato. Después de agregar el NaBH4, el color de la solución se volverá rojo gradualmente y luego se profundizará. Si no se observa ningún cambio de color, indica en gran medida que el experimento ha fallado.
  9. Reemplace la solución con 2 ml de tampón PBS-A para detener la reacción.
    NOTA: Detener la reacción dentro de los 30 minutos es crítico, ya que una reacción prolongada romperá gradualmente los AuNP.

5. Congelación a alta presión y fijación por congelación y sustitución por congelación (Figura 1C-F)

NOTA: Las muestras son HPF y FSF de nuevo, y el procedimiento es casi el mismo que el descrito anteriormente en la sección 2 y la sección 3 con algunas modificaciones.

  1. Preparar tetróxido de osmio al 1% y acetato de uranilo al 0,1% en acetona (solución 3 de FSF, diluida a partir de tetróxido de osmio al 4% en acetona y acetato de uranilo al 10% en metanol).
    PRECAUCIÓN: El tetróxido de osmio y el acetato de uranilo son sustancias químicas altamente tóxicas; Deben manipularse de acuerdo con los procedimientos de seguridad adecuados y eliminarse como residuos químicos peligrosos.
  2. Cargue las muestras (los conjuntos portadores de discos de zafiro) en el recipiente con la solución FSF congelada 3 bajo LN2 utilizando un par de pinzas preenfriadas.
  3. Transfiera el contenedor a la cámara AFS preenfriada para el procesamiento de FSF a −90 °C, y ejecute el programa FSF de la siguiente manera: mantener a -90 °C durante 8-10 h; luego, calentar a −60 °C en 3 h; mantener a -60 °C durante 3 h; luego, calentar a −30 °C en 3 h; mantener a -30 °C durante 3 h; luego, calentar a 4 °C en 2 h.
  4. Cuando la temperatura alcance los 4 °C, transfiera las muestras a la campana extractora y manténgalas a temperatura ambiente durante 15 min.
  5. Lavar con acetona 3 veces durante 15 minutos cada vez.
  6. Mantener en acetona a temperatura ambiente durante al menos 2 h.

6. Infiltración de resina, incrustación y polimerización

  1. Prepare la mezcla de resina epoxi de acuerdo con las instrucciones del fabricante antes de usar.
    PRECAUCIÓN: La resina epoxi utilizada en el experimento actual es tóxica antes de la polimerización; Debe manipularse de acuerdo con los procedimientos de seguridad adecuados. La resina no polimerizada debe eliminarse como residuo químico peligroso o polimerizarse antes de su eliminación.
  2. Transfiera los discos de zafiro a cápsulas de incrustación de fondo plano e infílelos con resina durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente.
    NOTA: Mantenga los lados marcados de los discos de zafiro hacia abajo.
  3. Polimerizar la muestra a 60 °C en un horno durante al menos 18 h.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí después de la polimerización. Los bloques de muestras polimerizadas se pueden almacenar en un recipiente seco durante años.

7. Sección ultrafina

  1. Recorte cuidadosamente los bloques de muestras polimerizadas con una navaja de afeitar para exponer los discos de zafiro.
  2. Sumerja las puntas de los bloques con discos de zafiro en nitrógeno líquido durante varios segundos y descongele a temperatura ambiente. Repita la acción de congelación-descongelación varias veces para separar los discos de los bloques.
    NOTA: Evite la congelación prolongada, ya que esto puede agrietar los bloques de muestras. Separe suavemente los discos de zafiro con una cuchilla, evitando una fuerza excesiva, que puede dañar las muestras.
  3. Recorte la cara del bloque a una forma trapezoidal para la sección ultrafina (Figura 1G).
  4. Obtener secciones ultrafinas de 70-100 nm con un ultramicrotomo (Figura 1H).
  5. Elija las secciones en rejillas hexagonales de cobre de 200 mallas.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí después de seccionar. Las secciones de las fajas se pueden almacenar en un recipiente seco durante años. Si se desea, las secciones en las rejillas se pueden teñir con acetona de uranilo al 2% para obtener un mejor contraste de membrana. Se debe evitar la tinción de plomo, ya que enmascarará las señales de partículas de nanooro.

8. Imágenes TEM (Figura 1I)

  1. Examine las secciones ultrafinas en las rejillas de cobre utilizando un microscopio electrónico de transmisión. Normalmente, un rango de ampliación de 11 kX a 30 kX es adecuado para visualizar AuNP en las celdas, y se necesita un valor de desenfoque adecuado para garantizar que los AuNP de 2-3 nm sean visibles.

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Resultados

La técnica de síntesis de AuNP basada en ANSM es una herramienta extremadamente útil para etiquetar y detectar proteínas marcadas con MT con TEM26. Para validar su robustez en células de mamíferos, se generaron tres líneas celulares estables que expresan EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn o Mito-acGFP-MTn en células Hela. KDEL es una secuencia canónica de retención/recuperación del retículo endoplásmico C-terminal (ER), que mantiene la proteína de fusión EGFP-MTn-KDEL dentro del lumen ER o el espacio pe...

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Discusión

El estudio presenta aquí una robusta tecnología de etiquetado EM clonable para la visualización de moléculas de proteínas individuales dentro del entorno celular con resolución ultraestructural. Las AuNP sintetizadas directamente en etiquetas ricas en cisteína codificadas genéticamente proporcionan una localización inequívoca y precisa de las proteínas diana. La técnica de congelación a alta presión y la sustitución por congelación preservan excelentemente la ultraestructura de las muestras biológicas. En conjunto, la te...

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Divulgaciones

El autor declara no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

El protocolo descrito aquí se derivó del artículo publicado por Jiang et al. (2020). Este trabajo fue apoyado por subvenciones de MOST (973 Programas nos. 2011CB812502 y 2014CB849902) y por el apoyo financiero del Gobierno Municipal de Beijing.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,025 mm/0,275 mm Portadorde aluminio Beijing Wulundes Biotech Ltd., o Oficina de Ingeniería de M. Wohlwend
TampónDisuelva HEPES (0,2 M) en 980 mL de ddH2O, luego agregue 10 mL de 100 mM de MgCl2 y 10 mL de 100 mM de CaCl2 (concentración final 1 mM), respectivamente, ajuste el pH a 5,5
1,5 mL Microtubo MaxyClear snaplockAxygen ScientificMCT150C
2 mL microtubos con tapón de rosca de polipropilenoBiologix81-0204
200 malla rejilla hexagonal de cobreTedpella incG200HEX
2-mercaptoetanolAmresco0482-250ML
Placas de cultivo celular de 35 mmCorning
Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mLCorning430928
AcetonaBeiijng Tong Guang Fine Chemicals Company31025
Máquina automática de sustitución por congelaciónLeicaAFS2
Portamuestras personalizados de 3,05 mm x 0,66 mm para HPFBeijing Wulundes Biotech Ltd.
D-penicilaminaTCIP0147
Dulbecco' s Águila modificada medioGBICOC11965500BT
Suero fetal bovinoGBICO10099-141C
Cápsula de inclusión de fondo planoTedpella inc
Cryobox
Resina Formvar 15/95Microscopía electrónica Sciences15800
HAuCl4Sigma4022-1G
HEPESsigma H3375-500G
Wohlwend HPF compact01
Methonal Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company12397
NaBH4Sigma480886-25G
OsO4Ciencias de la microscopía electrónica19110
TampónDisuelva NaH2PO4 (1.125 mM), Na2HPO4 (3.867 mM), NaCl (100 mM) en 1 L de ddH2O, ajustar a pH 7.4
Papel de filtro cualitativo (velocidad media)Beyotime BiotechnologyFFT08
Discos de zafiroBeijing Wulundes Biotech Ltd., o Oficina de ingeniería de M. Wohlwend
Bolígrafo resistente a solventesCiencias de la microscopía electrónica62053-B
Resina SPI-Pon 812SPI Inc02659-AB
Transmisión electrónica microscopíaFEITecnai G2 spirit
Tripsin-EDTAGBICOC25200-056
PinzasDumont
UltramictotomeLeicaFC7
Acetato de uraniloCiencias de la Microscopía Electrónica22400
HEPES de 0,2 M 430165de espumaMáquina HPF PBS-A

Referencias

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