Artículo de método

Un método preciso y cuantificable para recolectar hemolinfa de artrópodos pequeños

DOI:

10.3791/65250

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28 de abril de 2023

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1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2CAS Center for Excellence in Biotic Interactions, University of Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

En este artículo

Resumen

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Describimos un método para recolectar hemolinfa cuantificable de manera eficiente de artrópodos pequeños para su posterior análisis.

Resumen

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Se sabe que los artrópodos transmiten una variedad de virus de importancia médica y agrícola a través de su hemolinfa, que es esencial para la transmisión del virus. La recolección de hemolinfa es la tecnología básica para estudiar las interacciones virus-vector. Aquí, describimos un método novedoso y simple para la recolección cuantitativa de hemolinfa de pequeños artrópodos utilizando Laodelphax striatellus (el pequeño saltaplantas marrón, SBPH) como modelo de investigación, ya que este artrópodo es el principal vector del virus de la raya del arroz (VSR). En este protocolo, el proceso comienza pellizcando suavemente una pierna del artrópodo congelado con pinzas de punta fina y presionando la hemolinfa fuera de la herida. Luego, se utiliza una micropipeta simple que consiste en un capilar y un bulbo de pipeta para recoger la hemolinfa transudativa de la herida de acuerdo con el principio de fuerzas capilares. Finalmente, la hemolinfa recolectada se puede disolver en un tampón específico para su posterior estudio. Este nuevo método para recolectar hemolinfa de artrópodos pequeños es una herramienta útil y eficiente para futuras investigaciones sobre arbovirus e interacciones vector-virus.

Introducción

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Tanto los virus animales como los vegetales pueden ser transmitidos por artrópodos, y estos virus representan una grave amenaza para la salud humana y causan enormes pérdidas económicas en la agricultura 1,2,3. Es importante destacar que la hemolinfa artrópodo, que sirve como sistema circulatorio y un elemento vital del sistema inmunológico en los artrópodos, juega un papel importante en la regulación de la transmisión arboviral. Los virus adquiridos a través de los intestinos de los artrópodos son transportados a otros tejidos sólo después de escapar ....

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Protocolo

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1. Cría de insectos

  1. Elevar los SBPHs utilizados en este experimento en plántulas de arroz (Oryza sativa cv. Nipponbare). Plantar 20 plántulas de arroz en una incubadora (65 mm x 200 mm) y crecer a 25 °C bajo un fotoperiodo de 16 h claro/8 h oscuro.

2. Disección de los SPSP para la recolección de hemolinfa

  1. Coloque los SBPH en un tubo de centrífuga y colóquelos en un baño de hielo durante 10-30 minutos.
    NOTA: No coloque los SBPH en el baño de hielo durante menos de 10 minutos, o los insectos pueden revivir.
  2. Coloque un SBPH congelado en un portaobjetos de vidrio ....

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Resultados

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Modelo de micropipeta y recolección de hemolinfa
Hemos desarrollado una micropipeta simple cuya acción se basa en las fuerzas capilares del tubo capilar. La micropipeta está compuesta por un tubo capilar y un bulbo de pipeta (Figura 1A). Los tubos capilares están disponibles en diferentes tamaños de volumen que van desde 1 μL a 20 μL, y los volúmenes del tubo capilar se seleccionan de acuerdo con los requisitos. No se recomiendan tubos capilares con volúmenes más pequeños.......

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Discusión

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La hemolinfa es el medio del sistema circulatorio en los artrópodos, y los arbovirus solo pueden invadir otros tejidos de artrópodos si son capaces de sobrevivir al ambiente hostil de la hemolinfa. La recolección de una muestra de hemolinfa de alta calidad es el primer paso para estudiar las interacciones vector-virus que ocurren en la hemolinfa. Se ha informado que la hemolinfa del insecto se puede obtener de varios sitios en el cuerpo del insecto, incluyendo una herida en la pata delantera, una incisión menor en el áre.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (No. 2022YFD1401700) y por la Fundación Nacional de Ciencias de China (No. 32090013 y No. 32072385).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Gel proteico SDS-PAGE al 10%Bio-rad4561035Separación y detección de proteínas
Paraformaldehído al 4%SolarbioP1110Para la fijación de las células o tejidos 
Reactivo de colorante BradfordBio-rad 5000205 Detección dela concentración de proteínas
CapilarHirschmann9000101Para la recolección de hemolinfa
Cámara de recuento de célulasACMECAYA0810Recuento de hemocitos
Portaobjetos de vidrioGitoglas10127105APara sujetar insectos
Portaobjetos de vidrio recubierto de silanoSigmaS4651-72EAPara la conservación de muestras de microscopio
Reactivo antidecoloración de oro con DAPIInvitrogenP36935Tinción de núcleos
Cubreobjetos de microscopioGitoglas10212424CPara la observación microscópica
Bulbo de pipetaHirschmann9000101Para la recogida de hemolinfa
Software Prism 8.0GraphPad Software/Análisis estadísticos
Microscopio estereoscópico MoticSMZ-168Para la disección de insectos
PinzasTianldP5622Para la disección
de insectos Microscopio invertido ZeissObserver Z1Observación de hemocitos

Referencias

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  1. Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  2. Ray, S., Casteel, C. L. Effector-mediated plant-virus-vector interactions. Plant Cell. ....

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Etiquetas

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