Un método preciso y cuantificable para recolectar hemolinfa de artrópodos pequeños

Tanto los virus animales como los vegetales pueden ser transmitidos por artrópodos, y estos virus representan una grave amenaza para la salud humana y causan enormes pérdidas económicas en la agricultura ^1,2,3. Es importante destacar que la hemolinfa artrópodo, que sirve como sistema circulatorio y un elemento vital del sistema inmunológico en los artrópodos, juega un papel importante en la regulación de la transmisión arboviral. Los virus adquiridos a través de los intestinos de los artrópodos son transportados a otros tejidos sólo después de escapar con éxito del ambiente hemolinfático adverso 4,5,6,7. El ciclo de vida de los virus en la hemolinfa del artrópodo implica la supervivencia del virus en el plasma fluido, la entrada en el hemocito y el transporte a otros tejidos, y varios mecanismos de interacción virus-vector ocurren en la hemolinfa 8,9,10,11,12. Por ejemplo, la transmisión vertical del VRS por el SBPH depende de una interacción molecular entre la proteína vitelogenina SBPH y la proteína de la cápside^13,14 del VSR (virus de la raya de arroz). Algunos virus pueden escapar de la respuesta inmune de la hemolinfa al unirse a factores vectoriales específicos^15,16,17,18. Por lo tanto, investigar las interacciones vector-virus en la hemolinfa de los artrópodos es importante para desarrollar una mejor comprensión de la transmisión del arbovirus.

La hemolinfa de algunos insectos pequeños, como saltamontes, saltahojas y algunos mosquitos, es difícil de recolectar debido a su tamaño. Para abordar este problema, se han desarrollado varios métodos para recolectar hemolinfa, incluida la inserción de una aguja de jeringa directamente en el cuerpo del insecto para extraer un microvolumen de la hemolinfa, la recolección de exudado del sitio de la herida con pinzas de punta fina y la centrifugación directa. Estos métodos han permitido la medición de los niveles relativos de expresión génica y títulos virales dentro de la hemolinfa 19,20,21. Sin embargo, actualmente no se dispone de un método eficaz para cuantificar el volumen de hemolinfa, que es necesario para el recuento de hemocitos, la cuantificación de proteínas y el análisis de la actividad enzimática, para estos pequeños insectos.

El SBPH (pequeño saltaplantas marrón) es un tipo de pequeño insecto vector con una longitud corporal de aproximadamente 2-4 mm. El SBPH es capaz de transmitir una variedad de virus de plantas, incluyendo el VSR, el virus enano áspero del maíz y el virus enano rayado negro del arroz^22,23,24. La interacción entre el SBPH y el VSR se ha estudiado en profundidad durante la última década. Para facilitar el trabajo con SBPH, desarrollamos un método novedoso y simple de recolección de hemolinfa. Este método, que se basa en el principio de las fuerzas capilares, utiliza un capilar con una marca de escala para adquirir la hemolinfa del insecto de una manera precisa y cuantificable. Esto nos permite recolectar un volumen específico de hemolinfa de pequeños insectos de manera eficiente y estudiar el entorno hemolinfático de pequeños vectores con más detalle.

1. Cría de insectos

1. Elevar los SBPHs utilizados en este experimento en plántulas de arroz (Oryza sativa cv. Nipponbare). Plantar 20 plántulas de arroz en una incubadora (65 mm x 200 mm) y crecer a 25 °C bajo un fotoperiodo de 16 h claro/8 h oscuro.

2. Disección de los SPSP para la recolección de hemolinfa

1. Coloque los SBPH en un tubo de centrífuga y colóquelos en un baño de hielo durante 10-30 minutos.
   NOTA: No coloque los SBPH en el baño de hielo durante menos de 10 minutos, o los insectos pueden revivir.
2. Coloque un SBPH congelado en un portaobjetos de vidrio (consulte la Tabla de materiales) bajo un microscopio estereoscópico (consulte la Tabla de materiales) con el abdomen hacia arriba. Ajusta el enfoque en las seis patas del insecto.
3. Prepare dos pinzas de alta precisión (consulte la Tabla de materiales) con puntas ultrafinas. Use una pinza para presionar el cuerpo del insecto para mantenerlo en su lugar, y use la otra para sacar con cuidado una de las patas del insecto.
   NOTA: Para insectos con una cáscara dura, se puede usar un bisturí oftálmico para cortar una de las patas.
4. Presione suavemente el pecho del insecto con una pinza para hacer que la hemolinfa fluya a través de la herida.
   NOTA: La hemolinfa se presenta como gotitas transparentes sin ningún flóculo blanco visible. Deseche el lípido si hay algún flóculo blanco, que representa la contaminación del cuerpo graso.

3. Recolección de hemolinfa mediante micropipetas

1. Prepara una micropipeta. Coloque un tubo capilar (ver Tabla de materiales) con un volumen de 1 μL en el bulbo de pipeta (ver Tabla de materiales). Para mediciones precisas, asegúrese de que la línea de escala sea visible.
   NOTA: Es necesario un pequeño orificio presente en la parte superior de la bombilla de pipeta.
2. Al recoger la hemolinfa, sostenga el bulbo de pipeta de la micropipeta y coloque el tubo capilar cerca de la herida del insecto. Recoge la hemolinfa que exuda de la herida simplemente tocando la punta del capilar con la hemolinfa.
3. Bloquee ligeramente el pequeño orificio en la parte superior del bulbo de pipeta con el dedo para detener el proceso de absorción cuando el líquido dentro del tubo capilar alcance la línea de escala deseada.
   NOTA: Recoja una muestra de 1 μL de hemolinfa incesante y rápidamente para evitar la contaminación lipídica y la obstrucción del tubo.
4. Presione el bulbo de pipeta para descargar la hemolinfa recolectada en 100 μL de tampón PBS (137 mmol/L NaCI, 2.7 mmol/L KCI, 4.3 mmol/L Na 2 HPO 4, 1.4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7.2-7.4).
   NOTA: El tubo capilar se inserta en el tampón PBS.
5. Cambie a un nuevo tubo capilar cuando recoja otra muestra de 1 μL de hemolinfa.

4. Tinción azul de Coomassie

1. Recolectar 3 muestras de hemolinfa con el mismo volumen (1 μL) de larvas en tercera etapa de acuerdo con los protocolos descritos en el paso 3, y descargar la hemolinfa recolectada en el tampón PBS para hacer un volumen total de 100 μL.
2. Agregue 25 μL de tampón de carga de proteína 5x (250 mmol / L Tris-HCI [pH 6.8], 10% W / V SDS, 0.05% W / V Bromophenol Blue, 50% W / V glicerol, 5% W / V β-mercaptoetanol) en 100 μL de las muestras diluidas de hemolinfa y calor para desnaturalizar las proteínas.
3. Cargue 20 μL de las muestras hervidas en un gel de proteína SDS-PAGE al 10% (consulte la Tabla de materiales) para separar las proteínas.
4. Manchar el gel en una solución de Coomassie Blue (mezclar 1 g de Coomassie Brilliant Blue R-250 con 250 ml de isopropanol, 100 ml de ácido acético glacial y 650 ml de_ddH2O, y filtrar cualquier partícula con papel de filtro) durante 1 h a temperatura ambiente, y luego decolorar el gel durante 1 h con solución decolorante (100 ml de ácido acético, 400 mL de metanol, 500 mL de_ddH2O).

5. Determinación de la concentración de proteínas

1. Diluir 10 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) a 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml y 0,3125 mg/ml con tampón PBS utilizando el método de dilución doble.
2. Aspirar 5 μL de tampón PBS y cada concentración de soluciones de BSA en el paso 5.1, añadir 1 ml de 1x reactivo de colorante Bradford (ver Tabla de materiales) e incubar durante 5 min a temperatura ambiente. Utilice tampón PBS en el reactivo de colorante Bradford como control, y cero en OD = 595 nm. Mida los valores de absorbancia de cada una de las concentraciones de proteína restantes y haga una curva estándar.
3. Agregue 1 μL de hemolinfa de SBPH larvales, femeninos o masculinos en 100 μL de tampón PBS, y luego centrifugar las muestras a 1,000 x g durante 10 minutos a 4 ° C para eliminar los hemocitos.
4. Aspirar 90 μL de sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga y medir los valores de absorbancia del sobrenadante de acuerdo con las instrucciones del paso 5.2.
5. Calcular las concentraciones proteicas de las muestras de hemolinfa según la ecuación de regresión de la curva estándar. Incluir tres réplicas biológicas con tres réplicas técnicas en los experimentos.

6. Detecciones microscópicas

1. Use micropipetas para recolectar hemolinfa de 10-15 SBPH en diferentes etapas del desarrollo. Agregue la hemolinfa recolectada en un tubo que contenga 20 μL de solución de paraformaldehído al 4% (ver Tabla de materiales). Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos para fijar la hemolinfa.
2. Pipetear 20 μL de hemocitos fijos en el centro de un portaobjetos recubierto con silano (ver Tabla de materiales).
3. Seque la gota en una rejilla de secado de diapositivas.
   NOTA: Evite el secado excesivo.
4. Cubra la muestra con el reactivo antidecoloración de oro 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (consulte la Tabla de materiales) e inspeccione el portaobjetos bajo un microscopio invertido (consulte la Tabla de materiales).

7. Cuantificación celular

1. Recolectar 1 μL de hemolinfa de los SPSB con una micropipeta y disolverlo en 20 μL de tampón PBS.
2. Diluir las muestras de hemolinfa cinco veces con tampón PBS.
3. Pipetear 20 μL de solución de hemolinfa en el centro de la cámara de conteo celular (ver Tabla de materiales). Cubra la gota con un cubreobjetos (consulte la Tabla de materiales).
4. Cuente las celdas en los cinco cuadrados de la cámara de conteo de células (Figura suplementaria 1), bajo un microscopio invertido (ver Tabla de materiales). Incluye tres réplicas biológicas con tres réplicas técnicas en cada uno de los experimentos.
   Células/μL = recuento total de cinco cuadrados medios × 5 × factor de dilución × 10⁴

8. Análisis estadísticos

1. Realizar análisis estadísticos con el software correspondiente (ver Tabla de Materiales). Cree un nuevo archivo y seleccione la columna, importe los datos y genere un diagrama de dispersión con una barra.
2. Calcule la media y la SD para cada grupo de datos mediante el uso de estadísticas de columna, y use una herramienta ANOVA unidireccional para evaluar la importancia de las diferencias entre los grupos. Determinar la media y la SD a partir de tres réplicas biológicas con tres experimentos independientes.

Modelo de micropipeta y recolección de hemolinfa
Hemos desarrollado una micropipeta simple cuya acción se basa en las fuerzas capilares del tubo capilar. La micropipeta está compuesta por un tubo capilar y un bulbo de pipeta (Figura 1A). Los tubos capilares están disponibles en diferentes tamaños de volumen que van desde 1 μL a 20 μL, y los volúmenes del tubo capilar se seleccionan de acuerdo con los requisitos. No se recomiendan tubos capilares con volúmenes más pequeños porque las aberturas extra finas de los tubos de menor volumen pueden dificultar la absorción de líquidos como la hemolinfa. El bulbo de pipeta contiene un orificio en la parte superior que no se puede tapar durante la recolección de hemolinfa. Este bulbo de pipeta es conveniente para sostener la micropipeta durante la recolección de líquido (Figura 1B) y también ayuda a transferir el líquido recolectado del tubo capilar al tampón de recolección.

Para recolectar la hemolinfa fácilmente, en este trabajo, los SBPH se congelaron primero en hielo o en el refrigerador. Estos SBPH congelados se localizaron en un portaobjetos bajo un microscopio estereoscópico, y una de las patas de cada SBPH se arrancó con pinzas de punta fina (Figura 1C). Para asegurar una herida grande y una recolección óptima de hemolinfa, es mejor arrancar la pierna en la raíz (Figura 1Ca, b). Para minimizar el riesgo de contaminación por el cuerpo graso, solo se recolectaron gotas líquidas claras sin ningún flóculo blanco (Figura 1Cc). La micropipeta se utilizó para absorber los volúmenes deseados de hemolinfa (Figura 1Cd). Para recolectar 1 μL de hemolinfa, se tuvieron que diseccionar aproximadamente 30-40 SBPH larvales u 8-15 SPBH adultos.

Análisis de la hemolinfa recolectada
Para evaluar la exactitud de la micropipeta como método para evaluar el volumen de hemolinfa recolectada, probamos las concentraciones de proteínas de diferentes muestras. La hemolinfa de las larvas se recolectó utilizando una micropipeta con un volumen capilar de 1 μL, y tres muestras de proteínas se recolectaron por separado y se analizaron ejecutando un gel SDS-PAGE. Los resultados mostraron que la cantidad de proteína en los tres carriles era casi igual (Figura 2A). Para las larvas, el contenido total de proteína fue de 3.707 mg / ml ± 1.382 mg / ml. También recolectamos el mismo volumen de hemolinfa de SBPHs adultos femeninos y masculinos, y estos mostraron concentraciones de proteínas de 3.515 mg/mL ± 1.400 mg/mL y 3.621 mg/mL ± 0.860 mg/mL, respectivamente (Tabla 1). No hubo diferencias significativas en la proteína entre las tres muestras (Figura 2B).

Además, también observamos los hemocitos dentro de la hemolinfa larvaria recolectada para evaluar la calidad y pureza de las muestras de hemolinfa. Los hemocitos variaron en tamaño entre 2-20 nm, y no se detectó cuerpo graso (Figura 2C). La mayoría de las células identificadas eran plasmatocitos, que variaban de 5 a 15 nm de diámetro y a menudo aparecían en agregados25. Luego contamos las concentraciones celulares de la hemolinfa de larvas, hembras adultas y machos adultos, y las concentraciones celulares identificadas fueron 1.794 x 10 5/μL ± 0.614 x 10 5/μL, 1.256 x 10 5/μL ± 0.603 x 10 5/μL, y 1.553 x 10 5/μL ± 0.474 x 10 5/μL, respectivamente (Tabla 2). El recuento de células hemocitarias en larvas, hembras adultas y machos adultos no mostró diferencias significativas (Figura 2D). Estos resultados indican que el método de recolección de micropipetas es una forma confiable y precisa de recolectar hemolinfa de los SBPH.

Figura 1: Esquema del modelo de micropipeta y colección de hemolinfa . (A) Composición de micropipetas. La micropipeta consiste en un capilar y un bulbo de pipeta. Los volúmenes capilares varían de 1 a 20 μL. La bombilla de pipeta tiene un pequeño orificio en la parte superior e inferior. El capilar se inserta en el orificio inferior y la escala es visible. (B) Diagrama general de la colección de hemolinfa con una micropipeta. El abdomen del insecto se mantiene boca arriba mientras se separa una pierna, se induce el flujo de salida de la hemolinfa y la hemolinfa se recoge en la pipeta bajo un microscopio estereoscópico. (C) Proceso de recolección de hemolinfa con una micropipeta. Una de las patas se arranca en la raíz con pinzas de punta fina (a), y el cuerpo del insecto se presiona para hacer que la hemolinfa fluya hacia afuera (b, c). La hemolinfa de la herida se recoge en el capilar (d). Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Análisis de la hemolinfa SBPH. (A) Tinción de azul de Coomassie que muestra tres réplicas de hemolinfa larval recolectada. Hem indica hemolinfa. (B) Concentraciones totales de proteínas de la hemolinfa de SBPH larvales, femeninas y masculinas. (C) Imágenes microscópicas que muestran las células presentes en la hemolinfa en SBPH a un aumento de 20x y 60x, respectivamente. El núcleo fue teñido con DAPI (azul). Barra de escala = 50 μm. (D) Densidad de hemocitos de SBPH larvales, femeninos y masculinos. La media y el SD se calcularon a partir de tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Concentraciones de proteínas de hemolinfa de diferentes SBPHs. Los datos se obtuvieron de tres réplicas biológicas.

Tabla 2: Las concentraciones totales de hemocitos en la hemolinfa de diferentes SBPHs. Los datos se obtuvieron de tres réplicas biológicas.

Figura complementaria 1: Determinación del número de celdas. Los cuatro cuadrados de esquina (1, 2, 3 y 4) y el cuadrado central (5) se cuentan en la cámara de conteo de celdas. Para las celdas de borde, solo se cuentan los dos límites (superior e izquierdo). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.