Un método preciso y cuantificable para recolectar hemolinfa de artrópodos pequeños

Resumen

Describimos un método para recolectar hemolinfa cuantificable de manera eficiente de artrópodos pequeños para su posterior análisis.

Resumen

Se sabe que los artrópodos transmiten una variedad de virus de importancia médica y agrícola a través de su hemolinfa, que es esencial para la transmisión del virus. La recolección de hemolinfa es la tecnología básica para estudiar las interacciones virus-vector. Aquí, describimos un método novedoso y simple para la recolección cuantitativa de hemolinfa de pequeños artrópodos utilizando Laodelphax striatellus (el pequeño saltaplantas marrón, SBPH) como modelo de investigación, ya que este artrópodo es el principal vector del virus de la raya del arroz (VSR). En este protocolo, el proceso comienza pellizcando suavemente una pierna del artrópodo congelado con pinzas de punta fina y presionando la hemolinfa fuera de la herida. Luego, se utiliza una micropipeta simple que consiste en un capilar y un bulbo de pipeta para recoger la hemolinfa transudativa de la herida de acuerdo con el principio de fuerzas capilares. Finalmente, la hemolinfa recolectada se puede disolver en un tampón específico para su posterior estudio. Este nuevo método para recolectar hemolinfa de artrópodos pequeños es una herramienta útil y eficiente para futuras investigaciones sobre arbovirus e interacciones vector-virus.

Introducción

Tanto los virus animales como los vegetales pueden ser transmitidos por artrópodos, y estos virus representan una grave amenaza para la salud humana y causan enormes pérdidas económicas en la agricultura ^1,2,3. Es importante destacar que la hemolinfa artrópodo, que sirve como sistema circulatorio y un elemento vital del sistema inmunológico en los artrópodos, juega un papel importante en la regulación de la transmisión arboviral. Los virus adquiridos a través de los intestinos de los artrópodos son transportados a otros tejidos sólo después de escapar ....

Protocolo

1. Cría de insectos

1. Elevar los SBPHs utilizados en este experimento en plántulas de arroz (Oryza sativa cv. Nipponbare). Plantar 20 plántulas de arroz en una incubadora (65 mm x 200 mm) y crecer a 25 °C bajo un fotoperiodo de 16 h claro/8 h oscuro.

2. Disección de los SPSP para la recolección de hemolinfa

1. Coloque los SBPH en un tubo de centrífuga y colóquelos en un baño de hielo durante 10-30 minutos.
   NOTA: No coloque los SBPH en el baño de hielo durante menos de 10 minutos, o los insectos pueden revivir.
2. Coloque un SBPH congelado en un portaobjetos de vidrio ....

Resultados

Modelo de micropipeta y recolección de hemolinfa
Hemos desarrollado una micropipeta simple cuya acción se basa en las fuerzas capilares del tubo capilar. La micropipeta está compuesta por un tubo capilar y un bulbo de pipeta (Figura 1A). Los tubos capilares están disponibles en diferentes tamaños de volumen que van desde 1 μL a 20 μL, y los volúmenes del tubo capilar se seleccionan de acuerdo con los requisitos. No se recomiendan tubos capilares con volúmenes más pequeños.......

Discusión

La hemolinfa es el medio del sistema circulatorio en los artrópodos, y los arbovirus solo pueden invadir otros tejidos de artrópodos si son capaces de sobrevivir al ambiente hostil de la hemolinfa. La recolección de una muestra de hemolinfa de alta calidad es el primer paso para estudiar las interacciones vector-virus que ocurren en la hemolinfa. Se ha informado que la hemolinfa del insecto se puede obtener de varios sitios en el cuerpo del insecto, incluyendo una herida en la pata delantera, una incisión menor en el áre.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Gel proteico SDS-PAGE al 10%	Bio-rad	4561035	Separación y detección de proteínas
Paraformaldehído al 4%	Solarbio	P1110	Para la fijación de las células o tejidos
Reactivo de colorante Bradford	Bio-rad 5000205 Detección de		la concentración de proteínas
Capilar	Hirschmann	9000101	Para la recolección de hemolinfa
Cámara de recuento de células	ACMEC	AYA0810	Recuento de hemocitos
Portaobjetos de vidrio	Gitoglas	10127105A	Para sujetar insectos
Portaobjetos de vidrio recubierto de silano	Sigma	S4651-72EA	Para la conservación de muestras de microscopio
Reactivo antidecoloración de oro con DAPI	Invitrogen	P36935	Tinción de núcleos
Cubreobjetos de microscopio	Gitoglas	10212424C	Para la observación microscópica
Bulbo de pipeta	Hirschmann	9000101	Para la recogida de hemolinfa
Software Prism 8.0	GraphPad Software	/	Análisis estadísticos
Microscopio estereoscópico	Motic	SMZ-168	Para la disección de insectos
Pinzas	Tianld	P5622	Para la disección
de insectos Microscopio invertido Zeiss	Observer Z1	Observación de hemocitos