Aislamiento de dos pasos sin etiquetas de las mitocondrias para mejorar el descubrimiento y la cuantificación de proteínas

Resumen

Presentamos un protocolo de dos pasos para el aislamiento de mitocondrias de alta calidad que es compatible con el descubrimiento y cuantificación de proteínas a escala de proteoma. Nuestro protocolo no requiere ingeniería genética y, por lo tanto, es adecuado para estudiar las mitocondrias de cualquier célula y tejido primario.

Resumen

La mayoría de los procesos fisiológicos y de enfermedad, desde el metabolismo central hasta la respuesta inmune a la neurodegeneración, involucran mitocondrias. El proteoma mitocondrial está compuesto por más de 1.000 proteínas, y la abundancia de cada una puede variar dinámicamente en respuesta a estímulos externos o durante la progresión de la enfermedad. Aquí, describimos un protocolo para aislar mitocondrias de alta calidad de células y tejidos primarios. El procedimiento de dos pasos comprende (1) homogeneización mecánica y centrifugación diferencial para aislar las mitocondrias crudas, y (2) captura inmune sin etiquetas de las mitocondrias para aislar orgánulos puros y eliminar contaminantes. Las proteínas mitocondriales de cada etapa de purificación se analizan mediante espectrometría cuantitativa de masas y se calculan los rendimientos de enriquecimiento, lo que permite el descubrimiento de nuevas proteínas mitocondriales mediante proteómica sustractiva. Nuestro protocolo proporciona un enfoque sensible e integral para estudiar el contenido mitocondrial en líneas celulares, células primarias y tejidos.

Introducción

Las mitocondrias son orgánulos complejos y dinámicos capaces de detectar y adaptarse a las necesidades metabólicas de la célula. Central a la complejidad del metabolismo celular, las mitocondrias actúan como centros metabólicos donde convergen las reacciones de carbohidratos, proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y metabolismo de cofactores¹. También sirven como orgánulos de señalización para las vías de la respuesta inmune innata y en respuesta a los cambios en los iones y las especies reactivas de oxígeno ^2,3. Hasta la fecha, alrededor de 1.100 proteínas han sido mapeadas a las mitocondrias ^4,5,6, sin embargo, podemos suponer que muchas más aún no se han descubierto^, especialmente aquellas expresadas solo en ciertos tipos de células o transitoriamente bajo condiciones ambientales específicas. El desarrollo de nuevos enfoques para cuantificar los cambios en la composición mitocondrial en los estados metabólicos de interés aumentará nuestro conocimiento de estos orgánulos y destacará nuevas vías terapéuticas para los trastornos caracterizados por la disfunción mitocondrial⁷.

Actualmente, se dispone de diferentes protocolos de aislamiento de mitocondrias, con diferentes rendimientos y niveles de pureza⁸. Los enfoques basados en la centrifugación son los más populares, debido a su simplicidad y bajo costo. Aunque es adecuada para la mayoría de las aplicaciones, la centrifugación diferencial tiene la desventaja de obtener una menor pureza mitocondrial y requerir grandes cantidades de material de partida cuando se utilizan aplicaciones más complejas basadas en gradiente de densidad. En los últimos años, han surgido nuevos métodos para el aislamiento de mitocondrias, como la captura inmune basada en etiquetas ("MITO-IP")⁹ y la clasificación de orgánulos activados por fluorescencia¹⁰. Aunque ambos procedimientos pueden generar muestras con alta pureza, el primero requiere ingeniería genética para etiquetar las mitocondrias para la purificación de afinidad, lo que hace que los protocolos sean incompatibles con el material primario de organismos no modificados o donantes humanos. Mientras tanto, este último depende del acceso a la citometría de flujo y los instrumentos de clasificación. La combinación de diferentes métodos de aislamiento ofrece la promesa de generar protocolos más robustos y una mayor pureza.

Aquí, presentamos un nuevo protocolo para el aislamiento de mitocondrias basado en la combinación de dos métodos existentes: (1) centrifugación diferencial para aislar una fracción mitocondrial cruda, y (2) captura inmune libre de etiquetas de mitocondrias con perlas superparamagnéticas unidas covalentemente a anticuerpos contra la translocasa de la membrana mitocondrial externa 22 (Tomm22)¹¹, una proteína ubicua de la membrana externa mitocondrial (Figura 1). El procedimiento que describimos es compatible con la espectrometría cuantitativa de masas de proteínas, y debido a que no tiene etiquetas y no requiere manipulación genética, se puede aplicar a una amplia gama de modelos de investigación, desde líneas celulares hasta fluidos corporales y tejidos animales completos. Además, el uso de dos pasos en el protocolo permite el uso de la proteómica sustractiva ^6,12 para el descubrimiento de nuevas proteínas mitocondriales y el estudio de su expresión.

Protocolo

Se deben usar guantes en todo momento y los pasos de cultivo celular deben realizarse bajo una campana de flujo laminar. Las células se mantienen en una incubadora a 37 °C con un 5% de_CO2. La investigación presentada en este protocolo fue aprobada y realizada de acuerdo con las directrices de la Universidad de Lausana y Suiza para el uso de animales.

1. Cultivo de la línea celular de macrófagos RAW264.7

1. Cultive las células macrófagas RAW264.7 de ratones en el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco con alta glucosa y glutamina suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 5% (HI-FBS) y 100 UI / ml de penicilina y 100 μg / ml de estreptomicina (P / S).
   NOTA: Para aislar las mitocondrias, una sola placa confluente de 15 cm (aproximadamente 70 x 10 7 células RAW264.7) es suficiente.
2. Mantener las células RAW264.7 en placas de cultivo de tejidos. Una densidad de siembra inicial de 1 x 10⁵ células/ml conduce a una placa confluente en 3 días. Use 25 ml de suspensión celular en medios para una placa de 15 cm. Las células RAW264.7 tienen una alta tasa de división celular y deben dividirse con más frecuencia que la mayoría de las líneas celulares.
3. Separación de celdas RAW264.7
   1. Aspire el medio y lave las células una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   2. Para una placa de 15 cm, añadir 8 ml de tampón de disociación RAW caliente (270 mM de cloruro de potasio, 30 mM de citrato de sodio dihidratado en_H2O, estéril filtrado) e incubar las células a 37 °C durante 5 min.
   3. Añadir un volumen equivalente de medios a las placas (dilución 1:1 del tampón de disociación) y pipetear para separar y homogeneizar las células.
   4. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico y centrifugue el tubo a 300 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
   5. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en un volumen adecuado de medio (descrito en el paso 1.1) para el recuento celular.
      NOTA: Se pueden usar otros métodos para separar las células RAW264.7, como tripsina o un raspador celular. Sin embargo, estos métodos son más duros para las células y pueden conducir a su polarización en macrófagos similares a M1 en los días posteriores al desprendimiento.

2. Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea (DMO)

NOTA: El protocolo descrito aquí es para un solo mouse y se puede escalar verticalmente para varios ratones. Los protocolos detallados para el aislamiento y cultivo de BMDM se han descrito en otra parte^13,14.

1. Sacrificar un ratón C57BL/6 de 8-12 semanas de edad con una dosis alta de_CO2.
   NOTA: Se pueden usar ratones machos o hembras.
2. Rocíe el ratón con etanol al 75% para esterilizarlo.
3. Diseccionar y recoger las caderas, fémures y tibias del ratón¹⁵.
4. Para recoger la médula ósea de los fémures y las tibias, retire el extremo de la articulación de la rodilla de ambos huesos¹⁵. Recuperar la médula ósea de las caderas mediante la eliminación del acetábulo.
5. Transfiera los huesos a un tubo cónico de 50 ml con 4 ml de medios BMDM mantenidos en hielo (DMEM con glucosa alta y glutamina suplementado con 5% de HI-FBS, P / S y 10 mM de HEPES).
   NOTA: Es importante mantener los huesos en los medios para evitar el secado de la médula ósea durante la disección.
6. Agregue 4 ml de PBS y 4 ml de medios BMDM calientes en dos pocillos diferentes de una placa de 6 pocillos.
7. Transfiera los huesos y los medios del tubo cónico de 50 ml a un pocillo vacío de la placa de 6 pocillos.
8. Usando un par de fórceps, transfiera bien los huesos al PBS para lavarlos.
9. Transfiera los huesos al pocillo que contiene medios calientes de BMDM.
10. Haga un orificio de 1-2 mm de diámetro en el fondo de dos tubos de 0,5 ml con las pinzas y colóquelos en un tubo de 1,5 ml.
    NOTA: No es necesario agregar medios al tubo para este paso rápido.
11. En cada tubo de 0.5 ml, coloque un fémur, tibia y cadera de tal manera que la médula ósea de los huesos expuestos mire hacia la parte inferior de los tubos.
12. Centrifugar los tubos a 13,000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente para recoger la médula ósea y los medios sobrantes a través del orificio del tubo de 0.5 ml y en el tubo de 1.5 ml. Deseche los tubos de 0,5 ml con los huesos.
13. Resuspender los gránulos de médula ósea en medios BMDM y transferir a un tubo cónico de 15 ml.
14. Agregue medios BMDM de hasta 10 ml.
15. Coloque un filtro de células de 40 μm en un tubo cónico de 50 ml y filtre la suspensión de médula ósea a través de él.
16. Centrifugar la suspensión filtrada a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente para recuperar las células intactas y eliminar pequeños residuos de la suspensión celular.
17. Preparar 70 ml de medios BMDM suplementados con 50 ng/mL de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF).
18. Resuspender el pellet en 10 ml de medios BMDM suplementados con M-CSF.
19. Agregue 9 ml de medios BMDM suplementados con M-CSF a cada una de las siete placas de Petri de 10 cm.
20. Placa 1 ml de células (alrededor de 1 x 10⁷ células) en cada una de las siete placas de Petri de 10 cm.
21. Homogeneice la suspensión celular en cada placa pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo en la placa y transfiera las placas a la incubadora.
22. Después de 3 días, agregue 5 ml de medios BMDM calientes suplementados con 50 ng / mL M-CSF a cada placa.
23. Después de 3 días (día 6, después del aislamiento de la médula ósea), verificar la adhesión y diferenciación de la DMO mediante microscopía.
    NOTA: En este punto, es posible proceder directamente al aislamiento de las mitocondrias (paso 3). Alternativamente, se puede repetir el BMDM, lo que permite tratarlos con citoquinas y moléculas pequeñas.
24. Desconexión de los BMDM
    1. Aspirar el medio de cada placa y añadir 7 ml de PBS frío suplementado con 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
    2. Incubar las células a 4 °C durante 7-8 min.
    3. Separe los BMDM pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 10 ml.
    4. Agrupar los BMDM resuspendidos de las siete placas en un solo tubo cónico de 50 ml y centrifugar a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
    5. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 40 ml de medios CMO calientes para el recuento celular.
       NOTA: Entre 7-9 x 10⁷ BMDMs se obtienen por ratón. Se recomienda un mínimo de 6 x 10⁷ DMO para el aislamiento de mitocondrias para la proteómica.
    6. Si lo desea, emplaca y trate los BMDM de acuerdo con el objetivo experimental. Si no es así, vaya directamente al paso 3.3.

3. Preparación de una fracción mitocondrial bruta por centrifugación diferencial

NOTA: Realice todos los pasos de centrifugación a 4 °C. Se requieren dos centrífugas, una con rotor basculante y adaptadores para tubos cónicos con una fuerza centrífuga relativa de al menos 300 x g, la otra con una fuerza centrífuga relativa de al menos 21.000 x g adecuada para tubos de 1,5 ml. Cuando use células adherentes, use un raspador celular.

1. Para las células adherentes, aspirar el medio y añadir 10 ml de PBS por placa de 15 cm.
   NOTA: El raspado de celdas en PBS permite lavarlas al mismo tiempo. Si las celdas ya están en suspensión, continúe directamente con el paso 3.3.
2. Separe las células con un raspador de células y agrúyelas en un solo tubo cónico de 50 ml. Homogeneizar la suspensión celular pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
   NOTA: Las células se pueden separar usando un raspador de células, ya que esto es más rápido y se lisarán poco después.
3. Para cada condición experimental, transfiera el 5% del volumen de suspensión celular a un tubo de 1,5 ml y centrifugarlo a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: Cuando use celdas de suspensión, asegúrese de lavar las celdas una vez con PBS antes, para eliminar posibles contaminantes de los medios como FBS.
4. Deseche el sobrenadante y mantenga el pellet en hielo.
   NOTA: Esto representará la fracción de "célula total" para la proteómica.
5. Centrifugar el resto de las muestras del paso 3.1 o 3.2 a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
6. Realice todos los pasos siguientes con hielo y utilizando tampones helados.
7. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 5 ml de tampón mitocondrial (MB) helado (210 mM manitol, 70 mM de sacarosa, 10 mM de HEPES/NaOH [pH 7.4] y 1 mM EDTA).
8. Recuperar las células por centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
9. Resuspender el pellet celular en 0,5 ml de MB frío y transferirlo a un tubo de 1,5 ml.
   NOTA: Este procedimiento produce una concentración celular aproximada de 1,5 x 10 8 células BMDM/ml o 3 x 10⁸ células RAW264,7/ml.
10. Con una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 25 G, homogeneice la suspensión celular en 30 pasajes a través de la aguja (Figura 1A).
11. Añadir 1 ml de MB frío al tubo y mezclar por inversión. Centrifugar la suspensión de celda homogeneizada a 2.000 x g durante 5 min a 4 °C.
12. Transfiera 1 ml del sobrenadante a un tubo fresco de 1,5 ml en hielo sin alterar el pellet celular. Vuelva a suspender el pellet celular y homogeneícelo de nuevo, como en el paso 3.7.
13. Agrupar el pellet de celda homogeneizada y el sobrenadante de los dos pasos anteriores en un solo tubo de 1,5 ml y centrifugarlo a 2.000 x g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: En este punto, el pellet contiene principalmente núcleos y células intactas y se descarta. El sobrenadante contiene restos celulares, citosol y orgánulos, incluidas las mitocondrias (Figura 1B).
14. Divida el sobrenadante entre cuatro tubos de 1,5 ml.
    NOTA: Dividir el sobrenadante entre varios tubos en esta etapa mejora la eliminación de contaminantes en los siguientes pasos.
15. Agregue MB para hacer un volumen final de 1 ml en cada uno de los cuatro tubos. Mezclar por inversión y centrifugar los tubos a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    NOTA: Después de este paso, un pellet con dos capas es visible. El pellet marrón firme y inferior contiene mitocondrias y se mantiene para su posterior purificación (Figura 1C). El pellet superior, suelto y blanco contiene otras estructuras celulares y puede ser desechado.
16. Realice este paso con cuidado. Retire el sobrenadante con la mayor cantidad posible del pellet superior blanco. Al pipetear suavemente sobre él, es posible resuspender el pellet blanco y luego desecharlo, dejando intacto el pellet mitocondrial marrón.
17. Mantenga uno de los cuatro tubos con el pellet mitocondrial en hielo. Esto representa la fracción de "mitocondrias crudas" para la proteómica.
18. Agrupar los otros tres gránulos en un tubo de 1,5 ml en un volumen final de 1 ml de MB.

4. Purificación de mitocondrias basada en anticuerpos superparamagnéticos

NOTA: Realice todos los pasos siguientes en una cámara frigorífica a 4 °C.

1. Transfiera 1 ml de la preparación mitocondrial cruda del paso 3.18 a un tubo cónico de 15 ml y agregue 7 ml de MB suplementado con 150 mM de NaCl (MB + NaCl).
   NOTA: La adición de NaCl mejora la unión de anticuerpos y disminuye la unión no específica de los contaminantes a las perlas y a las mitocondrias.
2. Añadir 50 μL de perlas Tomm22 a la suspensión mitocondrial cruda de 8 ml (Figura 1D) e incubar el tubo durante 15 min a 4 °C en una rueda giratoria a baja velocidad.
   NOTA: Las perlas Tomm22 se unen covalentemente a anticuerpos monoclonales Tomm22 criados en ratones, acoplados a perlas superparamagnéticas.
3. Mientras tanto, coloca una columna sobre el imán.
4. Equilibre la columna con 8 mL de MB + NaCl y deseche el flujo.
5. Después de la incubación de 15 min a 4 °C de la muestra con las perlas Tomm22, transferir la muestra a la columna. Deseche el flujo continuo.
   NOTA: Las mitocondrias permanecerán unidas a las perlas magnéticas de la columna (Figura 1E).
6. Lave la columna tres veces con 8 mL de MB + NaCl.
7. Retire la columna del imán y colóquela en un tubo cónico de 15 ml.
8. Eluya las mitocondrias agregando 1,5 ml de MB + NaCl a la columna y aplique un émbolo inmediatamente para eluyer las mitocondrias purificadas en el tubo.
9. Transfiera las mitocondrias eluidas a un tubo de 1,5 ml y centrifugarlas a 21.000 x g durante 10 minutos a 4 °C.
   NOTA: Se formará una bolita marrón. Esto contiene las mitocondrias aisladas y algunas de las perlas acopladas a anticuerpos (Figura 1F).
10. Retire el sobrenadante con cuidado del pellet. El pellet representa la fracción de "mitocondrias puras" para la proteómica. Este pellet, junto con los pellets de los pasos 3.4 y 3.17, se puede almacenar a -20 °C y está listo para aplicaciones posteriores.

Resultados

En el presente protocolo se generan tres muestras con grados crecientes de pureza mitocondrial: células totales, mitocondrias crudas ("mito-crudas") y mitocondrias puras ("mito-puras") (Figura 1). Validamos la purificación de las mitocondrias de la línea celular de macrófagos RAW264.7 cargando cantidades iguales de proteínas de cada fracción en un gel e inmunotransferencia, y encontramos que la citrato sintasa mitocondrial (Cs) se enriqueció en cada paso de purificación; mientras tanto, las proteínas del citosol (GAPDH), la membrana plasmática (Na/K ATPasa), el núcleo (Lamin B), los lisosomas (Lamp1) y el retículo endoplásmico (ER) (Pdi) desaparecieron progresivamente (Figura 2A). Se obtuvieron resultados similares utilizando DMO. Para una mayor validación de la pureza e integridad de las mitocondrias aisladas, se realizó microscopía electrónica en la fracción mitocondrial pura. Observamos mitocondrias con forma ovalada clásica y crestas intactas rodeadas de partículas densas en electrones correspondientes a las perlas recubiertas de anticuerpos (Figura 2B). Por lo tanto, se puede concluir que nuestro protocolo enriquece las mitocondrias, agota otros componentes celulares y mantiene la integridad estructural mitocondrial.

A continuación, se realizó un análisis del proteoma de cada fracción mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC/MS). Se identificaron un total de 6.248 proteínas en el extracto de células totales, 907 de las cuales fueron previamente anotadas como mitocondriales en el inventario MitoCarta3.0⁵. Después de filtrar las proteínas con un umbral de al menos dos péptidos únicos, calculamos una puntuación de enriquecimiento para cada proteína en cada muestra en función de su intensidad en comparación con el total de células. Luego asignamos las proteínas a siete compartimentos subcelulares principales: mitocondrias, RE, lisosomas, aparato de Golgi, citoesqueleto, núcleo y citosol, utilizando Gene Ontology (GO)^16,17 y MitoCarta3.0⁵ como referencias. Es importante destacar que se observó un enriquecimiento promedio para las proteínas mitocondriales de más de 10 veces y más de 20 veces en las fracciones de mitocondrias crudas y puras, respectivamente (Figura 2C). En contraste, los componentes de los otros seis compartimentos celulares analizados se agotaron durante el procedimiento de purificación. De particular interés, en la fracción mitocondrial bruta, observamos un enriquecimiento transitorio para ER y proteínas lisosomales, dos clases de proteínas contaminantes frecuentemente presentes siguiendo protocolos de centrifugación diferencial¹⁸. Esto fue posiblemente debido a las interacciones orgánulo-orgánulo y coeficientes similares de sedimentación, especialmente para los lisosomas, que son muy abundantes en los macrófagos¹⁹. Si bien ambos se agotaron en su mayoría después de la captura inmune, detectamos una pequeña señal para las proteínas de los sitios de contacto ER-mitocondrias en la fracción mito-pura.

Luego comparamos directamente la abundancia de proteínas de las células totales y de muestras mitopuras y observamos dos poblaciones distintas, correspondientes a proteínas mitocondriales y no mitocondriales (Figura 2D). Si bien la gran mayoría de las proteínas MitoCarta se agruparon, encontramos algunas (<5%) que se agruparon con proteínas no MitoCarta. Estas proteínas pueden representar (1) proteínas citosólicas que interactúan con mitocondrias (una categoría novedosa anotada en la versión 3.0 de MitoCarta), (2) proteínas de doble localización o (3) proteínas mal anotadas. Por el contrario, encontramos algunos casos de proteínas no MitoCarta que se agrupan con proteínas mitocondriales. Si bien tales proteínas pueden representar contaminantes del procedimiento de aislamiento, también pueden representar proteínas no clasificadas previamente como presentes en las mitocondrias.

Para investigar esta nueva clase de proteínas mitocondriales potenciales, se utilizó la proteómica sustractiva, un enfoque que ha demostrado ser útil para el descubrimiento de proteomas organelares, incluidas las mitocondrias ^6,12. La proteómica sustractiva asume que las mitocondrias deben enriquecerse durante los pasos de purificación, y los contaminantes deben agotarse⁶. Por ejemplo, mientras que los contaminantes pueden acumularse durante la centrifugación diferencial (por ejemplo, debido a propiedades de sedimentación similares) o durante la captura inmune (por ejemplo, debido a la unión de anticuerpos no específicos), solo las proteínas mitocondriales de buena fe deben acumularse significativamente en ambas. Por lo tanto, es posible filtrar las proteínas que se encontraron en la fracción mitocondrial pura pero mostraron patrones inconsistentes de enriquecimiento. En el presente ejemplo con células RAW264.7, al establecer un umbral para péptidos únicos de ≥1 para las muestras mitocrudas y mitopuras, y utilizando umbrales estrictos de enriquecimiento, pudimos refinar la lista de proteomas mitocondriales recuperados de 1.127 proteínas encontradas inicialmente en la fracción mitocondrial cruda después de la centrifugación diferencial, hasta 481 proteínas después de la segunda ronda de purificación utilizando la inmunoselección Tomm22. El número reducido de proteínas anotadas por MitoCarta en la fracción mitopura refleja la alta rigurosidad aplicada para la selección. Curiosamente, 70 de las proteínas presentes en la fracción mitopura no estaban presentes en el inventario MitoCarta3.0 (Figura 3A, B). Estas últimas proteínas pueden representar posibles nuevas proteínas candidatas mitocondriales, que solo pueden expresarse en la línea celular de macrófagos RAW264.7 y en células relacionadas, y que merecen una mayor investigación.

Figura 1: Ilustración del protocolo de aislamiento de mitocondrias de dos pasos y sin etiquetas . (A) Una suspensión celular se interrumpe a través de una aguja de 25 G. (B) Los núcleos y las células enteras se separan por centrifugación a 2.000 x g y se guarda el sobrenadante. (C) Las mitocondrias crudas se aíslan por centrifugación diferencial del sobrenadante a 13.000 x g (mitocrudo). (D) Las mitocondrias crudas se incuban con anticuerpos Tomm22 (Ab) unidos covalentemente a perlas superparamagnéticas. (E) Los complejos de perlas de anticuerpos mitocondrias-Tomm22 se separan de los contaminantes utilizando columnas magnéticas y se eluyen. (F) Las mitocondrias puras se recogen y concentran por centrifugación (mito-pura). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Resultados representativos del aislamiento de mitocondrias de dos fuentes de macrófagos. (A) Análisis de inmunotransferencia de proteínas de células RAW264.7 (arriba) y BMDM (abajo) utilizando anticuerpos contra citrato sintasa mitocondrial (Cs - mitocondrias), gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (Gapdh - citosol), bomba de sodio-potasio (Na/K ATPasa - membrana plasmática), Lamin B (Lamin B - núcleo), proteína de membrana asociada a lisosomas 1 (Lamp1 - lisosoma) y proteína disulfuro-isomerasa (Pdi - ER). (B) Microscopía electrónica de mitocondrias purificadas a partir de células RAW264.7. Las partículas de alta densidad que rodean las mitocondrias corresponden a las perlas Tomm22 que se transportan con muestras mitopuras después de la elución de las columnas. Barras de escala: 80 nm. (C) Puntuaciones de enriquecimiento en células totales, mito-crudas y mito-puras de siete compartimentos celulares en células RAW264.7. Se utilizaron MitoCarta3.0 y GO para la anotación de proteínas y se representan los puntajes promedio. Abreviatura: ER = retículo endoplásmico. (D) Valores de abundancia de proteínas (riBAQ) para proteínas en células totales y muestras mitopuras de células RAW264.7. Las proteínas MitoCarta3.0 se muestran en naranja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Descubrimiento de nuevas proteínas mitocondriales utilizando proteómica sustractiva. (A) Estrategia proteómica sustractiva para el descubrimiento de nuevas proteínas mitocondriales. Se aplican umbrales de selección altos (4x y 2x) para minimizar la selección de falsos positivos. (B) Rendimientos de enriquecimiento (pliegue de células totales) de nuevas proteínas candidatas mitocondriales no anotadas previamente en el inventario MitoCarta3.0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Hemos combinado la centrifugación diferencial y la inmunocaptura para lograr una pureza mejorada para el aislamiento de las mitocondrias. Nuestro procedimiento permite el acceso a material primario para la identificación y caracterización de nuevas proteínas mitocondriales. El protocolo es sencillo y robusto, y se puede aplicar a líneas celulares, células primarias y tejidos sin necesidad de modificación genética. Hemos validado nuestro protocolo mediante análisis de inmunotransferencia y proteómica en muestras tomadas en diferentes etapas a lo largo del procedimiento de purificación.

En comparación con los métodos de aislamiento único, la combinación de pasos de enriquecimiento de diferentes naturalezas, en este caso, centrifugación y etiquetado inmune, genera un protocolo más robusto para aislar las mitocondrias. Esto se debe a que, si bien las proteínas mitocondriales se enriquecerán en ambas purificaciones, es poco probable que los contaminantes también se enriquezcan después de ambos pasos de enriquecimiento. Aunque también se puede lograr una alta pureza mitocondrial mediante ultracentrifugación por gradiente de densidad, este enfoque requiere una gran cantidad de material de partida y acceso a una ultracentrífuga. Por último, a diferencia de los métodos recientes basados en el aislamiento mitocondrial basado en etiquetas²⁰, nuestro enfoque no requiere la modificación genética de la muestra, por lo que es adecuada para material primario de cualquier fuente.

Algunas consideraciones técnicas y biológicas deben tenerse en cuenta en el diseño experimental al aplicar nuestro protocolo. (1) La cantidad de material de partida es crítica para obtener suficiente material. Inevitablemente, se perderá un pequeño número de mitocondrias durante la homogeneización (paso 3.10), ya que no todas las células se lisan, o durante los lavados de tres columnas (paso 4.6). Si bien nuestro protocolo se centra en la pureza sobre el rendimiento, la eficiencia del aislamiento de las mitocondrias y, por lo tanto, su rendimiento, no se ha medido ni optimizado. Se espera que el uso de más perlas Tomm22 y más columnas aumente el rendimiento de la recuperación de las mitocondrias. Al mismo tiempo, una optimización exhaustiva de la etapa de homogeneización también puede conducir a un mejor rendimiento mitocondrial. Este protocolo y los números de células iniciales que informamos aquí para las células RAW264.7 y BMDM son adecuados para la proteómica y se pueden ajustar para otras aplicaciones. En el caso de los BMDM primarios, encontramos que un solo ratón era suficiente para una réplica. Cuando sea necesario, el procedimiento se puede ampliar para aislar BMDM de múltiples animales, que luego se pueden agrupar para obtener suficiente material. El número de células se puede optimizar dependiendo del tipo de célula, su tamaño y su contenido mitocondrial. (2) Tomm22 se expresa en las mitocondrias de todos los tipos de células y tejidos²¹, pero su nivel de expresión puede variar. Por lo tanto, al diseñar un experimento para comparar diferentes condiciones, es importante asegurarse de que los niveles de expresión de Tomm22 sean comparables. Además, debido a la expresión ubicua de Tomm22, no es posible estudiar proteínas mitocondriales específicas de tipo celular dentro de tejidos complejos. (3) El tiempo necesario para generar mitocondrias puras (alrededor de 2,5 h) es incompatible con un estudio de eventos transitorios, como cambios en los perfiles metabólicos. En este caso, recomendamos la captura inmune directa basada en etiquetas.⁹, que también permite estudiar mitocondrias específicas del tipo celular in vivo²⁰. (4) Aunque los estudios sobre mitocondrias aisladas obtenidas utilizando solo perlas marcadas con anticuerpos Tomm22 han mostrado actividad en ensayos funcionales.¹¹, queda por determinar si las mitocondrias generadas con nuestro protocolo son compatibles con los ensayos basados en la actividad aguas abajo. La tinción de MitoTracker o perclorato de éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM), o las mediciones de respirometría, son enfoques potenciales para cuantificar la funcionalidad de las mitocondrias aisladas.²². (5) Después de eluyer la muestra "mito-pura" de la columna, algunas perlas Tomm22 estarán presentes en la fracción mitocondrial pura (Figura 2B). Si bien no hemos observado interferencia con la digestión de tripsinas y la espectrometría de masas de proteínas, la presencia de estas perlas y las inmunoglobulinas debe tenerse en cuenta en otras aplicaciones posteriores. El anticuerpo Tomm22 es un anticuerpo monoclonal producido en ratones²³, y por ello es importante tener en cuenta que, al utilizar anticuerpos secundarios contra ratones en immunoblotting, generará bandas inespecíficas del tamaño de las cadenas de inmunoglobulina. (6) La homogeneización completa de la suspensión celular es clave para el aislamiento exitoso de las mitocondrias. Aquí, usamos una jeringa con una aguja de 25 G para lisar tanto las células RAW264.7 como las BMDM. Sin embargo, dependiendo del tipo de célula y su tamaño, otros métodos de homogeneización mecánica, como el uso de un homogeneizador Dounce, o enfoques más controlados como dispositivos homogeneizadores celulares, pueden ser más adecuados. También se pueden considerar métodos de homogeneización no mecánicos, como la sonicación suave. Los enfoques de homogeneización tisular se discuten más a fondo en otros estudios^24,25. (7) Aunque la validación por immunoblotting es el método más sencillo y barato, sus resultados no siempre se correlacionan con los cambios en todo el nivel del orgánulo. Es por eso que recomendamos usar proteómica para validar completamente el enriquecimiento o agotamiento de las mitocondrias y otros orgánulos, respectivamente.

El protocolo de purificación de mitocondrias de dos pasos descrito aquí nos ha permitido generar muestras secuenciales con una pureza mitocondrial creciente, y esto nos ha permitido descubrir nuevos candidatos a proteínas mitocondriales a través de la proteómica sustractiva¹². Para nuestro análisis, utilizamos umbrales estrictos para seleccionar proteínas mitocondriales significativamente enriquecidas, y aunque esto puede no identificar algunas proteínas mitocondriales conocidas (Figura 3A), la tasa de falsos positivos para el descubrimiento de nuevas proteínas mitocondriales disminuye. Sin embargo, es importante destacar que cualquier proteína candidata revelada por nuestro protocolo debe ser validada a través de enfoques ortogonales. Recomendamos el marcado de GFP carboxiterminal o el uso de anticuerpos contra la proteína endógena para validar la asociación con las mitocondrias, ya sea microscópicamente o mediante ensayos de protección contra la proteasa.

La aplicación directa de nuestro método en el caso de células y tejidos no modificados ofrece una poderosa herramienta para investigar cómo las mitocondrias cambian y se adaptan a su entorno en condiciones saludables y de enfermedad. La aplicación de nuestro protocolo a líneas celulares, modelos de enfermedades animales, fluidos humanos e incluso biopsias de cirugía puede resultar particularmente útil para mejorar nuestra comprensión de las mitocondrias y sus trastornos asociados.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de 1 mL	BD Plastipal	309628
25 G Aguja	BD Microlance	300400
40 µ M filtro de células	Corning	352340
Anti-TOM22 Microperlas, ratón	Miltenyi Biotec	130-127-693
Raspador de células	FisherScientific	11577692
DMEM, alto en glucosa, GlutaMAX	ThermoFisher	31966
Ácido etilendiaminotetraacético	FisherScientific	BP-120-1
Suero fetal bovino	Gibco	10270
HEPES	BioConcept	5-31F00-H
LS Columnas y émbolos	Miltenyi Biotec	130-042-401
Factor estimulante de colonias de macrófagos	Immunotools	12343115
Manitol	Sigma	M4125
Cloruro de sodio	Sigma	71380
Sacarosa	Sigma	S1888
Penicilina/Estreptomicina	BioConcept	4-01F00-H Placas
Petri	Corning	BH93B-102
Solución salina tamponada con fosfato 10X	Eurobio Scientific	CS3PBS01-01
Separador QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976
Vi-CELL BLU Analizador de viabilidad celular	Beckman Coulter	C19196