Aislamiento de dos pasos sin etiquetas de las mitocondrias para mejorar el descubrimiento y la cuantificación de proteínas

Las mitocondrias son orgánulos complejos y dinámicos capaces de detectar y adaptarse a las necesidades metabólicas de la célula. Central a la complejidad del metabolismo celular, las mitocondrias actúan como centros metabólicos donde convergen las reacciones de carbohidratos, proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y metabolismo de cofactores¹. También sirven como orgánulos de señalización para las vías de la respuesta inmune innata y en respuesta a los cambios en los iones y las especies reactivas de oxígeno ^2,3. Hasta la fecha, alrededor de 1.100 proteínas han sido mapeadas a las mitocondrias ^4,5,6, sin embargo, podemos suponer que muchas más aún no se han descubierto^, especialmente aquellas expresadas solo en ciertos tipos de células o transitoriamente bajo condiciones ambientales específicas. El desarrollo de nuevos enfoques para cuantificar los cambios en la composición mitocondrial en los estados metabólicos de interés aumentará nuestro conocimiento de estos orgánulos y destacará nuevas vías terapéuticas para los trastornos caracterizados por la disfunción mitocondrial⁷.

Actualmente, se dispone de diferentes protocolos de aislamiento de mitocondrias, con diferentes rendimientos y niveles de pureza⁸. Los enfoques basados en la centrifugación son los más populares, debido a su simplicidad y bajo costo. Aunque es adecuada para la mayoría de las aplicaciones, la centrifugación diferencial tiene la desventaja de obtener una menor pureza mitocondrial y requerir grandes cantidades de material de partida cuando se utilizan aplicaciones más complejas basadas en gradiente de densidad. En los últimos años, han surgido nuevos métodos para el aislamiento de mitocondrias, como la captura inmune basada en etiquetas ("MITO-IP")⁹ y la clasificación de orgánulos activados por fluorescencia¹⁰. Aunque ambos procedimientos pueden generar muestras con alta pureza, el primero requiere ingeniería genética para etiquetar las mitocondrias para la purificación de afinidad, lo que hace que los protocolos sean incompatibles con el material primario de organismos no modificados o donantes humanos. Mientras tanto, este último depende del acceso a la citometría de flujo y los instrumentos de clasificación. La combinación de diferentes métodos de aislamiento ofrece la promesa de generar protocolos más robustos y una mayor pureza.

Aquí, presentamos un nuevo protocolo para el aislamiento de mitocondrias basado en la combinación de dos métodos existentes: (1) centrifugación diferencial para aislar una fracción mitocondrial cruda, y (2) captura inmune libre de etiquetas de mitocondrias con perlas superparamagnéticas unidas covalentemente a anticuerpos contra la translocasa de la membrana mitocondrial externa 22 (Tomm22)¹¹, una proteína ubicua de la membrana externa mitocondrial (Figura 1). El procedimiento que describimos es compatible con la espectrometría cuantitativa de masas de proteínas, y debido a que no tiene etiquetas y no requiere manipulación genética, se puede aplicar a una amplia gama de modelos de investigación, desde líneas celulares hasta fluidos corporales y tejidos animales completos. Además, el uso de dos pasos en el protocolo permite el uso de la proteómica sustractiva ^6,12 para el descubrimiento de nuevas proteínas mitocondriales y el estudio de su expresión.

Se deben usar guantes en todo momento y los pasos de cultivo celular deben realizarse bajo una campana de flujo laminar. Las células se mantienen en una incubadora a 37 °C con un 5% de_CO2. La investigación presentada en este protocolo fue aprobada y realizada de acuerdo con las directrices de la Universidad de Lausana y Suiza para el uso de animales.

1. Cultivo de la línea celular de macrófagos RAW264.7

1. Cultive las células macrófagas RAW264.7 de ratones en el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco con alta glucosa y glutamina suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 5% (HI-FBS) y 100 UI / ml de penicilina y 100 μg / ml de estreptomicina (P / S).
   NOTA: Para aislar las mitocondrias, una sola placa confluente de 15 cm (aproximadamente 70 x 10 7 células RAW264.7) es suficiente.
2. Mantener las células RAW264.7 en placas de cultivo de tejidos. Una densidad de siembra inicial de 1 x 10⁵ células/ml conduce a una placa confluente en 3 días. Use 25 ml de suspensión celular en medios para una placa de 15 cm. Las células RAW264.7 tienen una alta tasa de división celular y deben dividirse con más frecuencia que la mayoría de las líneas celulares.
3. Separación de celdas RAW264.7
   1. Aspire el medio y lave las células una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   2. Para una placa de 15 cm, añadir 8 ml de tampón de disociación RAW caliente (270 mM de cloruro de potasio, 30 mM de citrato de sodio dihidratado en_H2O, estéril filtrado) e incubar las células a 37 °C durante 5 min.
   3. Añadir un volumen equivalente de medios a las placas (dilución 1:1 del tampón de disociación) y pipetear para separar y homogeneizar las células.
   4. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico y centrifugue el tubo a 300 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
   5. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en un volumen adecuado de medio (descrito en el paso 1.1) para el recuento celular.
      NOTA: Se pueden usar otros métodos para separar las células RAW264.7, como tripsina o un raspador celular. Sin embargo, estos métodos son más duros para las células y pueden conducir a su polarización en macrófagos similares a M1 en los días posteriores al desprendimiento.

2. Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea (DMO)

NOTA: El protocolo descrito aquí es para un solo mouse y se puede escalar verticalmente para varios ratones. Los protocolos detallados para el aislamiento y cultivo de BMDM se han descrito en otra parte^13,14.

1. Sacrificar un ratón C57BL/6 de 8-12 semanas de edad con una dosis alta de_CO2.
   NOTA: Se pueden usar ratones machos o hembras.
2. Rocíe el ratón con etanol al 75% para esterilizarlo.
3. Diseccionar y recoger las caderas, fémures y tibias del ratón¹⁵.
4. Para recoger la médula ósea de los fémures y las tibias, retire el extremo de la articulación de la rodilla de ambos huesos¹⁵. Recuperar la médula ósea de las caderas mediante la eliminación del acetábulo.
5. Transfiera los huesos a un tubo cónico de 50 ml con 4 ml de medios BMDM mantenidos en hielo (DMEM con glucosa alta y glutamina suplementado con 5% de HI-FBS, P / S y 10 mM de HEPES).
   NOTA: Es importante mantener los huesos en los medios para evitar el secado de la médula ósea durante la disección.
6. Agregue 4 ml de PBS y 4 ml de medios BMDM calientes en dos pocillos diferentes de una placa de 6 pocillos.
7. Transfiera los huesos y los medios del tubo cónico de 50 ml a un pocillo vacío de la placa de 6 pocillos.
8. Usando un par de fórceps, transfiera bien los huesos al PBS para lavarlos.
9. Transfiera los huesos al pocillo que contiene medios calientes de BMDM.
10. Haga un orificio de 1-2 mm de diámetro en el fondo de dos tubos de 0,5 ml con las pinzas y colóquelos en un tubo de 1,5 ml.
    NOTA: No es necesario agregar medios al tubo para este paso rápido.
11. En cada tubo de 0.5 ml, coloque un fémur, tibia y cadera de tal manera que la médula ósea de los huesos expuestos mire hacia la parte inferior de los tubos.
12. Centrifugar los tubos a 13,000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente para recoger la médula ósea y los medios sobrantes a través del orificio del tubo de 0.5 ml y en el tubo de 1.5 ml. Deseche los tubos de 0,5 ml con los huesos.
13. Resuspender los gránulos de médula ósea en medios BMDM y transferir a un tubo cónico de 15 ml.
14. Agregue medios BMDM de hasta 10 ml.
15. Coloque un filtro de células de 40 μm en un tubo cónico de 50 ml y filtre la suspensión de médula ósea a través de él.
16. Centrifugar la suspensión filtrada a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente para recuperar las células intactas y eliminar pequeños residuos de la suspensión celular.
17. Preparar 70 ml de medios BMDM suplementados con 50 ng/mL de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF).
18. Resuspender el pellet en 10 ml de medios BMDM suplementados con M-CSF.
19. Agregue 9 ml de medios BMDM suplementados con M-CSF a cada una de las siete placas de Petri de 10 cm.
20. Placa 1 ml de células (alrededor de 1 x 10⁷ células) en cada una de las siete placas de Petri de 10 cm.
21. Homogeneice la suspensión celular en cada placa pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo en la placa y transfiera las placas a la incubadora.
22. Después de 3 días, agregue 5 ml de medios BMDM calientes suplementados con 50 ng / mL M-CSF a cada placa.
23. Después de 3 días (día 6, después del aislamiento de la médula ósea), verificar la adhesión y diferenciación de la DMO mediante microscopía.
    NOTA: En este punto, es posible proceder directamente al aislamiento de las mitocondrias (paso 3). Alternativamente, se puede repetir el BMDM, lo que permite tratarlos con citoquinas y moléculas pequeñas.
24. Desconexión de los BMDM
    1. Aspirar el medio de cada placa y añadir 7 ml de PBS frío suplementado con 5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
    2. Incubar las células a 4 °C durante 7-8 min.
    3. Separe los BMDM pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 10 ml.
    4. Agrupar los BMDM resuspendidos de las siete placas en un solo tubo cónico de 50 ml y centrifugar a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
    5. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 40 ml de medios CMO calientes para el recuento celular.
       NOTA: Entre 7-9 x 10⁷ BMDMs se obtienen por ratón. Se recomienda un mínimo de 6 x 10⁷ DMO para el aislamiento de mitocondrias para la proteómica.
    6. Si lo desea, emplaca y trate los BMDM de acuerdo con el objetivo experimental. Si no es así, vaya directamente al paso 3.3.

3. Preparación de una fracción mitocondrial bruta por centrifugación diferencial

NOTA: Realice todos los pasos de centrifugación a 4 °C. Se requieren dos centrífugas, una con rotor basculante y adaptadores para tubos cónicos con una fuerza centrífuga relativa de al menos 300 x g, la otra con una fuerza centrífuga relativa de al menos 21.000 x g adecuada para tubos de 1,5 ml. Cuando use células adherentes, use un raspador celular.

1. Para las células adherentes, aspirar el medio y añadir 10 ml de PBS por placa de 15 cm.
   NOTA: El raspado de celdas en PBS permite lavarlas al mismo tiempo. Si las celdas ya están en suspensión, continúe directamente con el paso 3.3.
2. Separe las células con un raspador de células y agrúyelas en un solo tubo cónico de 50 ml. Homogeneizar la suspensión celular pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
   NOTA: Las células se pueden separar usando un raspador de células, ya que esto es más rápido y se lisarán poco después.
3. Para cada condición experimental, transfiera el 5% del volumen de suspensión celular a un tubo de 1,5 ml y centrifugarlo a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: Cuando use celdas de suspensión, asegúrese de lavar las celdas una vez con PBS antes, para eliminar posibles contaminantes de los medios como FBS.
4. Deseche el sobrenadante y mantenga el pellet en hielo.
   NOTA: Esto representará la fracción de "célula total" para la proteómica.
5. Centrifugar el resto de las muestras del paso 3.1 o 3.2 a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
6. Realice todos los pasos siguientes con hielo y utilizando tampones helados.
7. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 5 ml de tampón mitocondrial (MB) helado (210 mM manitol, 70 mM de sacarosa, 10 mM de HEPES/NaOH [pH 7.4] y 1 mM EDTA).
8. Recuperar las células por centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
9. Resuspender el pellet celular en 0,5 ml de MB frío y transferirlo a un tubo de 1,5 ml.
   NOTA: Este procedimiento produce una concentración celular aproximada de 1,5 x 10 8 células BMDM/ml o 3 x 10⁸ células RAW264,7/ml.
10. Con una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 25 G, homogeneice la suspensión celular en 30 pasajes a través de la aguja (Figura 1A).
11. Añadir 1 ml de MB frío al tubo y mezclar por inversión. Centrifugar la suspensión de celda homogeneizada a 2.000 x g durante 5 min a 4 °C.
12. Transfiera 1 ml del sobrenadante a un tubo fresco de 1,5 ml en hielo sin alterar el pellet celular. Vuelva a suspender el pellet celular y homogeneícelo de nuevo, como en el paso 3.7.
13. Agrupar el pellet de celda homogeneizada y el sobrenadante de los dos pasos anteriores en un solo tubo de 1,5 ml y centrifugarlo a 2.000 x g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: En este punto, el pellet contiene principalmente núcleos y células intactas y se descarta. El sobrenadante contiene restos celulares, citosol y orgánulos, incluidas las mitocondrias (Figura 1B).
14. Divida el sobrenadante entre cuatro tubos de 1,5 ml.
    NOTA: Dividir el sobrenadante entre varios tubos en esta etapa mejora la eliminación de contaminantes en los siguientes pasos.
15. Agregue MB para hacer un volumen final de 1 ml en cada uno de los cuatro tubos. Mezclar por inversión y centrifugar los tubos a 13.000 x g durante 10 min a 4 °C.
    NOTA: Después de este paso, un pellet con dos capas es visible. El pellet marrón firme y inferior contiene mitocondrias y se mantiene para su posterior purificación (Figura 1C). El pellet superior, suelto y blanco contiene otras estructuras celulares y puede ser desechado.
16. Realice este paso con cuidado. Retire el sobrenadante con la mayor cantidad posible del pellet superior blanco. Al pipetear suavemente sobre él, es posible resuspender el pellet blanco y luego desecharlo, dejando intacto el pellet mitocondrial marrón.
17. Mantenga uno de los cuatro tubos con el pellet mitocondrial en hielo. Esto representa la fracción de "mitocondrias crudas" para la proteómica.
18. Agrupar los otros tres gránulos en un tubo de 1,5 ml en un volumen final de 1 ml de MB.

4. Purificación de mitocondrias basada en anticuerpos superparamagnéticos

NOTA: Realice todos los pasos siguientes en una cámara frigorífica a 4 °C.

1. Transfiera 1 ml de la preparación mitocondrial cruda del paso 3.18 a un tubo cónico de 15 ml y agregue 7 ml de MB suplementado con 150 mM de NaCl (MB + NaCl).
   NOTA: La adición de NaCl mejora la unión de anticuerpos y disminuye la unión no específica de los contaminantes a las perlas y a las mitocondrias.
2. Añadir 50 μL de perlas Tomm22 a la suspensión mitocondrial cruda de 8 ml (Figura 1D) e incubar el tubo durante 15 min a 4 °C en una rueda giratoria a baja velocidad.
   NOTA: Las perlas Tomm22 se unen covalentemente a anticuerpos monoclonales Tomm22 criados en ratones, acoplados a perlas superparamagnéticas.
3. Mientras tanto, coloca una columna sobre el imán.
4. Equilibre la columna con 8 mL de MB + NaCl y deseche el flujo.
5. Después de la incubación de 15 min a 4 °C de la muestra con las perlas Tomm22, transferir la muestra a la columna. Deseche el flujo continuo.
   NOTA: Las mitocondrias permanecerán unidas a las perlas magnéticas de la columna (Figura 1E).
6. Lave la columna tres veces con 8 mL de MB + NaCl.
7. Retire la columna del imán y colóquela en un tubo cónico de 15 ml.
8. Eluya las mitocondrias agregando 1,5 ml de MB + NaCl a la columna y aplique un émbolo inmediatamente para eluyer las mitocondrias purificadas en el tubo.
9. Transfiera las mitocondrias eluidas a un tubo de 1,5 ml y centrifugarlas a 21.000 x g durante 10 minutos a 4 °C.
   NOTA: Se formará una bolita marrón. Esto contiene las mitocondrias aisladas y algunas de las perlas acopladas a anticuerpos (Figura 1F).
10. Retire el sobrenadante con cuidado del pellet. El pellet representa la fracción de "mitocondrias puras" para la proteómica. Este pellet, junto con los pellets de los pasos 3.4 y 3.17, se puede almacenar a -20 °C y está listo para aplicaciones posteriores.

En el presente protocolo se generan tres muestras con grados crecientes de pureza mitocondrial: células totales, mitocondrias crudas ("mito-crudas") y mitocondrias puras ("mito-puras") (Figura 1). Validamos la purificación de las mitocondrias de la línea celular de macrófagos RAW264.7 cargando cantidades iguales de proteínas de cada fracción en un gel e inmunotransferencia, y encontramos que la citrato sintasa mitocondrial (Cs) se enriqueció en cada paso de purificación; mientras tanto, las proteínas del citosol (GAPDH), la membrana plasmática (Na/K ATPasa), el núcleo (Lamin B), los lisosomas (Lamp1) y el retículo endoplásmico (ER) (Pdi) desaparecieron progresivamente (Figura 2A). Se obtuvieron resultados similares utilizando DMO. Para una mayor validación de la pureza e integridad de las mitocondrias aisladas, se realizó microscopía electrónica en la fracción mitocondrial pura. Observamos mitocondrias con forma ovalada clásica y crestas intactas rodeadas de partículas densas en electrones correspondientes a las perlas recubiertas de anticuerpos (Figura 2B). Por lo tanto, se puede concluir que nuestro protocolo enriquece las mitocondrias, agota otros componentes celulares y mantiene la integridad estructural mitocondrial.

A continuación, se realizó un análisis del proteoma de cada fracción mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC/MS). Se identificaron un total de 6.248 proteínas en el extracto de células totales, 907 de las cuales fueron previamente anotadas como mitocondriales en el inventario MitoCarta3.05. Después de filtrar las proteínas con un umbral de al menos dos péptidos únicos, calculamos una puntuación de enriquecimiento para cada proteína en cada muestra en función de su intensidad en comparación con el total de células. Luego asignamos las proteínas a siete compartimentos subcelulares principales: mitocondrias, RE, lisosomas, aparato de Golgi, citoesqueleto, núcleo y citosol, utilizando Gene Ontology (GO)16,17 y MitoCarta3.05 como referencias. Es importante destacar que se observó un enriquecimiento promedio para las proteínas mitocondriales de más de 10 veces y más de 20 veces en las fracciones de mitocondrias crudas y puras, respectivamente (Figura 2C). En contraste, los componentes de los otros seis compartimentos celulares analizados se agotaron durante el procedimiento de purificación. De particular interés, en la fracción mitocondrial bruta, observamos un enriquecimiento transitorio para ER y proteínas lisosomales, dos clases de proteínas contaminantes frecuentemente presentes siguiendo protocolos de centrifugación diferencial18. Esto fue posiblemente debido a las interacciones orgánulo-orgánulo y coeficientes similares de sedimentación, especialmente para los lisosomas, que son muy abundantes en los macrófagos19. Si bien ambos se agotaron en su mayoría después de la captura inmune, detectamos una pequeña señal para las proteínas de los sitios de contacto ER-mitocondrias en la fracción mito-pura.

Luego comparamos directamente la abundancia de proteínas de las células totales y de muestras mitopuras y observamos dos poblaciones distintas, correspondientes a proteínas mitocondriales y no mitocondriales (Figura 2D). Si bien la gran mayoría de las proteínas MitoCarta se agruparon, encontramos algunas (<5%) que se agruparon con proteínas no MitoCarta. Estas proteínas pueden representar (1) proteínas citosólicas que interactúan con mitocondrias (una categoría novedosa anotada en la versión 3.0 de MitoCarta), (2) proteínas de doble localización o (3) proteínas mal anotadas. Por el contrario, encontramos algunos casos de proteínas no MitoCarta que se agrupan con proteínas mitocondriales. Si bien tales proteínas pueden representar contaminantes del procedimiento de aislamiento, también pueden representar proteínas no clasificadas previamente como presentes en las mitocondrias.

Para investigar esta nueva clase de proteínas mitocondriales potenciales, se utilizó la proteómica sustractiva, un enfoque que ha demostrado ser útil para el descubrimiento de proteomas organelares, incluidas las mitocondrias 6,12. La proteómica sustractiva asume que las mitocondrias deben enriquecerse durante los pasos de purificación, y los contaminantes deben agotarse6. Por ejemplo, mientras que los contaminantes pueden acumularse durante la centrifugación diferencial (por ejemplo, debido a propiedades de sedimentación similares) o durante la captura inmune (por ejemplo, debido a la unión de anticuerpos no específicos), solo las proteínas mitocondriales de buena fe deben acumularse significativamente en ambas. Por lo tanto, es posible filtrar las proteínas que se encontraron en la fracción mitocondrial pura pero mostraron patrones inconsistentes de enriquecimiento. En el presente ejemplo con células RAW264.7, al establecer un umbral para péptidos únicos de ≥1 para las muestras mitocrudas y mitopuras, y utilizando umbrales estrictos de enriquecimiento, pudimos refinar la lista de proteomas mitocondriales recuperados de 1.127 proteínas encontradas inicialmente en la fracción mitocondrial cruda después de la centrifugación diferencial, hasta 481 proteínas después de la segunda ronda de purificación utilizando la inmunoselección Tomm22. El número reducido de proteínas anotadas por MitoCarta en la fracción mitopura refleja la alta rigurosidad aplicada para la selección. Curiosamente, 70 de las proteínas presentes en la fracción mitopura no estaban presentes en el inventario MitoCarta3.0 (Figura 3A, B). Estas últimas proteínas pueden representar posibles nuevas proteínas candidatas mitocondriales, que solo pueden expresarse en la línea celular de macrófagos RAW264.7 y en células relacionadas, y que merecen una mayor investigación.

Figura 1: Ilustración del protocolo de aislamiento de mitocondrias de dos pasos y sin etiquetas . (A) Una suspensión celular se interrumpe a través de una aguja de 25 G. (B) Los núcleos y las células enteras se separan por centrifugación a 2.000 x g y se guarda el sobrenadante. (C) Las mitocondrias crudas se aíslan por centrifugación diferencial del sobrenadante a 13.000 x g (mitocrudo). (D) Las mitocondrias crudas se incuban con anticuerpos Tomm22 (Ab) unidos covalentemente a perlas superparamagnéticas. (E) Los complejos de perlas de anticuerpos mitocondrias-Tomm22 se separan de los contaminantes utilizando columnas magnéticas y se eluyen. (F) Las mitocondrias puras se recogen y concentran por centrifugación (mito-pura). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Resultados representativos del aislamiento de mitocondrias de dos fuentes de macrófagos. (A) Análisis de inmunotransferencia de proteínas de células RAW264.7 (arriba) y BMDM (abajo) utilizando anticuerpos contra citrato sintasa mitocondrial (Cs - mitocondrias), gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (Gapdh - citosol), bomba de sodio-potasio (Na/K ATPasa - membrana plasmática), Lamin B (Lamin B - núcleo), proteína de membrana asociada a lisosomas 1 (Lamp1 - lisosoma) y proteína disulfuro-isomerasa (Pdi - ER). (B) Microscopía electrónica de mitocondrias purificadas a partir de células RAW264.7. Las partículas de alta densidad que rodean las mitocondrias corresponden a las perlas Tomm22 que se transportan con muestras mitopuras después de la elución de las columnas. Barras de escala: 80 nm. (C) Puntuaciones de enriquecimiento en células totales, mito-crudas y mito-puras de siete compartimentos celulares en células RAW264.7. Se utilizaron MitoCarta3.0 y GO para la anotación de proteínas y se representan los puntajes promedio. Abreviatura: ER = retículo endoplásmico. (D) Valores de abundancia de proteínas (riBAQ) para proteínas en células totales y muestras mitopuras de células RAW264.7. Las proteínas MitoCarta3.0 se muestran en naranja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Descubrimiento de nuevas proteínas mitocondriales utilizando proteómica sustractiva. (A) Estrategia proteómica sustractiva para el descubrimiento de nuevas proteínas mitocondriales. Se aplican umbrales de selección altos (4x y 2x) para minimizar la selección de falsos positivos. (B) Rendimientos de enriquecimiento (pliegue de células totales) de nuevas proteínas candidatas mitocondriales no anotadas previamente en el inventario MitoCarta3.0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.