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Artículo de método

Un modelo de infección por Candida albicans en una articulación periprotésica en ratones

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DOI:

10.3791/65263

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2 de febrero de 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Health Science Center, Xi’an Jiaotong University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases in Northeast China, Ministry of Education, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University

En este artículo

Resumen

La infección de la articulación periprotésica (PJI) causada por patógenos peligrosos es común en la ortopedia clínica. Los modelos animales existentes no pueden simular con precisión la situación real de la PJI. Aquí, establecimos un modelo de ratón PJI asociado a la biopelícula de Candida albicans para investigar y desarrollar nuevas terapias para la PJI.

Resumen

La infección articular periprotésica (PJI) es una de las infecciones comunes causadas por Candida albicans (C. albicans), que preocupa cada vez más a cirujanos y científicos. Por lo general, en el sitio de la infección se forman biopelículas que pueden proteger a C. albicans de los antibióticos y la eliminación inmunitaria. La cirugía que implica la extracción del implante infectado, el desbridamiento, el tratamiento antimicrobiano y el reimplante es el estándar de oro para el tratamiento de la PJI. Por lo tanto, el establecimiento de modelos animales de PJI es de gran importancia para la investigación y el desarrollo de nuevos fármacos o terapias para la PJI. En este estudio, se insertó un alambre liso de aleación de níquel-titanio, un implante ampliamente utilizado en clínicas ortopédicas, en la articulación femoral de un ratón C57BL/6 antes de que C. albicans fuera inoculado en la cavidad articular a lo largo del alambre. Después de 14 días, se observaron biopelículas maduras y gruesas en la superficie de los implantes bajo un microscopio electrónico de barrido (SEM). Se encontró una trabécula ósea significativamente reducida en la tinción de H&E de las muestras articulares infectadas. En resumen, se estableció un modelo de PJI de ratón con las ventajas de fácil operación, alta tasa de éxito, alta repetibilidad y alta correlación clínica. Se espera que este sea un modelo importante para los estudios clínicos de la prevención de la PJI relacionada con la biopelícula de C. albicans.

Introducción

Candida albicans (C. albicans) reside comensalmente en muchas partes del cuerpo humano1, que también es el patógeno oportunista más común que causa infecciones fúngicas invasivas potencialmente mortales, especialmente en pacientes inmunocomprometidos 2,3. C. albicans puede transformarse entre los estados de levadura y micelio como un hongo polimórfico. El estado de micelio exhibe mayor virulencia, mayor adhesión e invasión de células y tejidos 4,5. Además, C. albicans puede formar biopelículas en las superficies de materiales biomédicos como dentaduras postizas, catéteres y stents 1,6,7. La densa estructura tridimensional de las biopelículas restringe la infiltración de fármacos antifúngicos, expresa genes resistentes a los fármacos y regula a la baja el metabolismo de las células fúngicas para resistir la eliminación del sistema inmunitario 6,7. Por lo tanto, las infecciones relacionadas con biopelículas son bastante desafiantes en las clínicas8.

Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulasa negativo y enterobacter son los principales patógenos causantes de la PJI9. Aunque la incidencia de la ICP fúngica es relativamente baja (alrededor del 1%)10, el costo del tratamiento de la ICP fúngica es mayor11, el ciclo de tratamiento es más largo11 y la tasa de éxito del tratamiento es menor10 que la ICP bacteriana. En los últimos años, la incidencia de PJI fúngica ha ido aumentando año tras año10. La PJI de Candida representa el 77%-84% de la PJIfúngica 10,12, y C. albicans es la más común en Candida (54%). Por lo tanto, es necesario estudiar la PJI fúngica.

Actualmente, la PJI se trata mediante cirugía de revisión mediante (1) la extracción del implante infectado, (2) el desbridamiento, (3) el tratamiento antimicrobiano y (4) el reimplante. Después de un desbridamiento completo, se coloca un antibiótico que contiene cemento óseo y el paciente es tratado con antibióticos sistémicamente durante más de 6 semanas para controlar eficazmente la infección antes de que se coloque un nuevo implante13. Sin embargo, este método no puede eliminar completamente los patógenos en los tejidos, y es muy probable que se desarrollen infecciones recurrentes tratadas con terapia antimicrobiana a largo plazo en cepas resistentes a los medicamentos 14,15,16.

El establecimiento de modelos animales de PJI es importante para la investigación y el desarrollo de nuevos fármacos o terapias para la PJI. En el desarrollo de la ICP, se forman grandes espacios muertos alrededor de la prótesis, lo que lleva a la formación de hematomas, que bloquean aún más el suministro de sangre a los tejidos circundantes y perjudican el efecto de los antibióticos11,15. Debido a la dificultad de imitar el entorno circundante de la prótesis, los modelos animales tradicionales no pueden simular con precisión la situación real de la PJI17,18.

En este trabajo, se construyó un modelo de PJI asociado a la biopelícula de C. albicans en ratones mediante el uso de un alambre de titanio-níquel clínicamente ampliamente utilizado para simular implantes articulares19,20. Este modelo PJI exhibe las ventajas de fácil operación, alta tasa de éxito, alta repetibilidad y alta correlación clínica. Se espera que sea un modelo importante para el estudio de la prevención y el tratamiento de la PJI relacionada con la biopelícula de C. albicans.

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Protocolo

Los animales fueron comprados a la Universidad Jiaotong de Xi'an. Todos los procedimientos de experimentación con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Ética Animal de la Universidad Xi'an Jiaotong (número de aprobación: SCXK [Shaanxi] 2021-103). Los ratones se mantuvieron durante una semana con 5 ratones por jaula. Se les permitió el libre acceso a alimentos y agua. Los animales se mantuvieron a temperatura ambiente (RT; 24 °C ± 1 °C) y ciclo luz/oscuridad (12 h/12 h) antes de realizar el estudio.

1. Preparación del tampón y del equipo

  1. Cultivo celular de C. albicans
    1. Inocular una colonia monoclonal de C. albicans (SC5314) a partir de un medio placa de peptona dextrosa (YPD) de extracto de levadura con un asa de inoculación en 5 ml de medio líquido YPD (YPD + 50 μg/mL de carbenicilina).
    2. A continuación, agite las células de C. albicans a una velocidad de 220 rpm a 30 °C durante la noche.
    3. Centrifugar la suspensión a 400 x g durante 5 min a RT. Resuspender las células de C. albicans en solución salina normal y diluir la concentración de células a 1 x 106 células/mL ajustando visualmente la turbidez para que sea la misma que la de un McFarland de 0,5.
  2. Preparación de solución salina normal
    1. Pesar 0,9 g de cloruro de sodio y disolver en 100 mL de agua desionizada para preparar solución salina normal al 0,9%.
  3. Preparación de instrumentos quirúrgicos
    1. Autoclave (121 °C, 30 min) el instrumental quirúrgico (tijeras, pinzas, pinzas hemostáticas, portaagujas, agujas de sutura) y alambre de aleación de titanio-níquel (aproximadamente 0,5 mm de diámetro) antes de su uso.

2. Establecimiento del modelo PJI de ratón

  1. Divida aleatoriamente 30 ratones C57BL/6 (machos, 15-20 g) en 3 grupos (10 ratones/grupo), a saber, grupo de control, grupo de implante en blanco (implantación de alambre de titanio-níquel sin infección por C. albicans ) y grupo PJI (implante de alambre de titanio-níquel con infección por C. albicans ).
  2. Anestesiar a los ratones con inhalación de isoflurano al 1-4% antes de quitar el pelo de la extremidad posterior izquierda y desinfectarlo con yodo. La pérdida del reflejo de enderezamiento y la falta de respuesta a la estimulación del dedo del pie confirman la profundidad de la anestesia. Mientras anestesia, aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para prevenir la sequedad de la córnea y para reponer el calor durante la cirugía y la recuperación.
  3. En el caso de los ratones del grupo de control, no proporcione ningún tratamiento. Bríndeles acceso gratuito a agua y alimentos.
  4. Para los ratones en el grupo de implantes en blanco y el grupo de PJI, haga una incisión longitudinal de 5 mm en la rodilla de cada extremidad posterior izquierda con una cuchilla # 10 o una navaja de afeitar estéril para exponer las articulaciones.
  5. Realice un orificio de 5 mm de longitud en el canal intramedular femoral insertando una aguja de jeringa estéril (26 G).
  6. Inserte un alambre liso de aleación de níquel-titanio (0,5 mm de diámetro, 5 mm de longitud) en el orificio antes de cortarlo con unas tijeras (Figura 1).
  7. Para los ratones en el grupo de implantes en blanco, agregue 2 μL de medio YPD a lo largo del alambre de aleación de níquel-titanio gota a gota antes de cerrar la herida capa por capa con una sutura de nailon (0,15 mm de diámetro).
  8. En el caso de los ratones del grupo PJI, inocular 2 μL de células de C. albicans (1 × 106 células/mL) en el espacio articular de los ratones a lo largo del alambre de aleación de níquel-titanio gota a gota antes de cerrar la herida capa por capa con una sutura de nylon.
  9. Aloja a los ratones con libre acceso a agua y comida durante 14 días. Administrar meloxicam por inyección subcutánea (4 mg/kg) cada 24 h durante un máximo de 3 días.
  10. Después de 14 días, anestesiar a los ratones con isoflurano al 3% antes de sacrificar a los ratones por luxación cervical.

3. Evaluación del modelo PJI

  1. Evaluación de infecciones en órganos principales
    1. Recolectar los riñones, el hígado y el bazo de los ratones después de la eutanasia.
    2. Añadir 500 μL de suero fisiológico normal estéril en cada órgano y triturar los tejidos en un homogeneizador a 4 °C.
    3. Añadir 100 μL del homogeneizado preparado en el paso 3.1.2 a una placa YPD antes de extenderlo uniformemente con una varilla doblada.
    4. Coloque las placas YPD invertidas en una incubadora a 37 °C durante 48 h.
    5. Observa y cuenta visualmente el número de colonias.
  2. Observación de C. albicans y biofilms en los implantes
    1. Cortar cuidadosamente la piel sobre la articulación de los ratones con unas tijeras antes de recoger el implante con unas pinzas.
    2. Mantener los implantes sumergidos en una solución de glutaraldehído al 2,5% para su fijación a 4 °C durante 48 h.
    3. Enjuague los implantes con PBS estéril tres veces antes de sumergirlos en una solución de ácido de osmio al 1% durante 3 h.
    4. Enjuague los implantes con PBS estéril tres veces antes de sumergirlos en soluciones de etanol al 50%, 70%, 80%, 90% y 100% durante 15 minutos para la deshidratación.
    5. Mantenga los implantes sumergidos en terc-butanol durante 30 minutos tres veces antes de liofilizar los implantes.
    6. Fije las muestras de implante a la etapa de muestra, recubra el implante con oro (recubrimiento de 10 nm) y obsérvelo bajo un microscopio electrónico de barrido (SEM) a alto vacío y 1,5 kV.
  3. Análisis anatomopatológico de los tejidos del fémur
    1. Recoja los tejidos femorales con unas tijeras después de la eutanasia de los ratones.
    2. Sumergir los tejidos del fémur en una solución de paraformaldehído al 4% para su fijación a 4 °C durante 48 h.
    3. Coloque los tejidos del fémur en formol al 10% durante 1 semana.
    4. Deshidratar los tejidos del fémur sumergiéndolos en soluciones de etanol al 50%, 70%, 80%, 90% y 100% durante 15 min, respectivamente.
    5. Incrustar los tejidos deshidratados del fémur en parafina antes de seccionar los tejidos en muestras de 4 μm utilizando un micrótomo.
    6. Tinturar las secciones del fémur con hematoxilina y eosina siguiendo un protocolo estándar antes del análisis anatomopatológico21.

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Resultados

La transferencia de las muestras a un medio en placa y el conteo de las colonias después de la incubación durante la noche se utiliza comúnmente para evaluar la carga patógena local cerca de la lesión22,23. En nuestro estudio, el cultivo microbiano de muestras de hígado, riñón y bazo fue negativo, lo que indica que el modelo de este estudio solo condujo a una infección local en lugar de una infección sistémica en los ratones23.

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Discusión

La infección causada por la contaminación de los instrumentos quirúrgicos o del ambiente quirúrgico durante la cirugía es la principal causa de la mayoría de las infecciones por implantes 24,25,26,27. Por lo tanto, en este estudio se construyó un modelo de PJI relacionado con la biopelícula de C. albicans de ratón. En comparación con el modelo tradicional de PJI en el que se utilizaron...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales que puedan haber influido en el trabajo reportado en este artículo.

Agradecimientos

Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Shaanxi (número de subvención 2021SF-118) y de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de subvención 81973409, 82204631).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.5 Mactutrius turbidibrisShanghai Lujing Technology Co., Ltd5106063
4 ° C refrigeradorElectrolux (China) Electric Co., LtdESE6539TA
AgarBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-023
Balanzas analíticasShimadzuATX124
Autoclaves EsterilizadorSANYOMLS-3750
CarbenicillinaAmrescoC0885
Eclipse Ci Nikon Microscopio óptico vertical NikonEclipse TS2-FL
GlucosaMacklin 
Anillo de inoculaciónThermo Scientific251586
IsofluranoRWD 20210103
NaClXi'an Jingxi Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd20180108
ParaformaldehídoBeyotime BiotechnologyP0099
PeptonaBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-001
Máquina de anestesia multicanal para animales pequeños RWD R550 RWDR550
SEMHitachiTM-1000
Incubadora de temperaturaShanghai Zhichu Instrument Co., LtdZQTY-50N
Generador de agua de agua ultrapuraHeal ForceNW20VF
Máquina de ultrasonidoDo-ChromDS10260D
Extracto de levaduraThermo Scientific  OxoidLP0021B
D823520

Referencias

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