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Summary

Este protocolo describe un modelo porcino neonatal de bypass cardiopulmonar (CEC), con paro circulatorio y cardíaco como herramienta para el estudio del daño cerebral severo y otras complicaciones secundarias a la CEC.

Abstract

La cardiopatía congénita (EC) es la malformación congénita más prevalente, con alrededor de un millón de nacimientos afectados en todo el mundo cada año. La investigación exhaustiva de esta enfermedad requiere modelos animales apropiados y validados. Los lechones se utilizan comúnmente para la investigación traslacional debido a su anatomía y fisiología análogas. Este trabajo tuvo como objetivo describir y validar un modelo de lechón neonatal de bypass cardiopulmonar (CEC) con paro circulatorio y cardíaco (AC) como herramienta para el estudio del daño cerebral severo y otras complicaciones de la cirugía cardíaca. Además de incluir una lista de materiales, este trabajo proporciona una hoja de ruta para que otros investigadores planifiquen y ejecuten este protocolo. Después de que profesionales experimentados realizaran varios ensayos, los resultados representativos del modelo demostraron una tasa de éxito del 92%, con fracasos atribuidos al pequeño tamaño de los lechones y a la variación de la anatomía de los vasos. Además, el modelo permitió a los profesionales seleccionar entre una amplia variedad de condiciones experimentales, incluidos los tiempos variables en la AC, las alteraciones de la temperatura y las intervenciones farmacológicas. En resumen, este método utiliza materiales fácilmente disponibles en la mayoría de los entornos hospitalarios, es confiable y reproducible, y puede emplearse ampliamente para mejorar la investigación traslacional en niños sometidos a cirugía cardíaca.

Introduction

La cardiopatía congénita (EC) es la malformación congénita más prevalente, con alrededor de un millón de nacimientos afectados en todo el mundo cada año¹. A pesar de que los avances modernos en la cirugía cardiotorácica (STC) y el tratamiento de cuidados intensivos han mejorado las tasas de mortalidad, las comorbilidades siguen siendo extremadamente comunes 2,3,4,5. Las anomalías del desarrollo neurológico, incluidas las deficiencias cognitivas y motoras, así como los problemas de aprendizaje, se describen en alrededor del 25%-50% de estos pacientes^6,7,8. Se ha demostrado que la cirugía durante los primeros días de vida, especialmente aquellos que requieren parada circulatoria y cardíaca (AC), aumenta la morbilidad⁹. Las alteraciones hemodinámicas durante la cirugía pueden tener un efecto importante en el vulnerable cerebro del recién nacido en desarrollo. Los modelos experimentales son esenciales para comprender mejor el origen de estas anomalías e investigar estrategias neuroprotectoras para mejorar el pronóstico de estos pacientes.

El uso de modelos animales para el estudio de esta población ha sido ampliamente documentado 5,10,11,12,13,14. En particular, los lechones ofrecen una excelente opción, dadas las aproximaciones cercanas en anatomía cardíaca (Figura 1), genoma y fisiología, así como su tamaño relativamente mayor en comparación con otros modelos animales¹⁵ (Figura 2). El uso de modelos de lechones para estudiar los efectos tanto de la derivación cardiopulmonar (CEC) como de la AC ha sido descrito previamente. Estos modelos animales experimentales son útiles para estudiar los cambios hemodinámicos y las complicaciones asociadas a los órganos terminales 14,16,17,18,19,20. Estos modelos se desarrollaron para permitir a los investigadores estudiar las condiciones humanas en un entorno controlado, con flexibilidad para una variedad de condiciones experimentales. La mayoría de los estudios informan sobre el uso de la canulación central, una técnica que exige habilidades quirúrgicas avanzadas, requiere una mayor utilización de recursos y dificulta la supervivencia a largo plazo. Aunque estudios previos han documentado el uso de lechones en el estudio de la CPB^12,15, pocos han propuesto la técnica de canulación periférica.

Esta nueva técnica de canulación periférica es más fácil, menos agresiva y más factible en comparación con otros estudios publicados¹⁹. Además, la validación de esta técnica en recién nacidos y pequeños animales es novedosa y debe ser considerada para su uso por todos los investigadores interesados en utilizar un modelo animal para estudiar la cardiopatía coronaria y sus comorbilidades asociadas. Es particularmente apropiado para personas con acceso a un laboratorio equipado con suministros, recursos y personal con experiencia en la realización de experimentos con modelos animales.

En resumen, el objetivo principal de este estudio es describir y validar un modelo de lechón neonatal de BCC con CA. El protocolo tiene como objetivo estudiar el daño cerebral severo y otras posibles complicaciones de la cirugía de CEC en un entorno controlado con diversas condiciones experimentales. Este método proporciona un modelo generalizable, fiable y de alta calidad, que puede utilizarse para una amplia variedad de protocolos experimentales.

Protocol

El presente procedimiento fue aprobado por el Comité Ético de Experimentación Animal (CEEA) del Centro de Medicina Comparada y Bioimagen de Cataluña (CEEA-CMCiB). La Generalitat de Cataluña también autorizó el protocolo experimental (nº 11652), número de identificación de expediente FUE-2022-02381434 y DNI QBXQ3RY3J. Profesionales experimentados, incluidos veterinarios certificados que brindan supervisión y asistencia, realizaron toda la experimentación. Para el presente estudio se utilizaron lechones (Sus scrofa domestica), de 4 a 6 días de edad, con un peso de 2,5 a 3,5 kg. Se intentó equilibrar la distribución de género para evitar sesgos relacionados. 1. Sedación, intubación y acceso Iniciar sedación y analgesia con ketamina intramuscular (20 mg/kg), dexmedetomidina (0,02 mg/kg) y midazolam (0,3 mg/kg). Una vez que el animal esté profundamente sedado (5 minutos después de la administración de la premedicación), oxigenar conO2 al 100% a través de una mascarilla de hocico (2 L/min). A continuación, inducir la anestesia con propofol intravenoso (0,5 mg/kg) (ver Tabla de Materiales). Coloque el lechón en decúbito dorsal. Realizar la intubación orotraqueal utilizando un tubo endotraqueal con manguito de 2,5 mm (ver Tabla de Materiales), utilizando la visualización directa de la tráquea.Confirmar la colocación adecuada del tubo endotraqueal mediante auscultación directa de las bases pulmonares. Configure la ventilación mecánica para que proporcione una frecuencia respiratoria de 30 respiraciones por minuto, un volumen corriente de 8-12 mL/kg y una presión final de la espiración de 4 cmH2O. Controle continuamente la profundidad de la anestesia durante el protocolo a través de la frecuencia cardíaca (FC), la presión arterial (PA) y la saturación de oxígeno (spO2). Ajustar los parámetros ventilatorios y de sedación según sea necesario.NOTA: Los valores ideales para los signos vitales son una HR de 130-160 lpm, una PA de 75-95/60-70 y una spO2 > 85. Mantener la sedación con sevoflurano al 1,5% y fentanilo (25-200 μg/kg/min) (ver Tabla de Materiales). Utilice la visualización directa para colocar catéteres en la arteria femoral (3 Fr) y en la vena (4 Fr) (consulte la tabla de materiales).NOTA: Estos catéteres se utilizarán para la administración de medicamentos y la adquisición de muestras. Como tal, es importante mantener el acceso. 2. Configuración y cebado del circuito CPB Personalice y configure el circuito CPB siguiendo los pasos a continuación (Figura 3):Acorte el tubo tanto como sea posible, dejando suficiente distancia para llegar al animal desde la máquina. Cree y conecte un puente de tubería que conecte el flujo de salida del oxigenador de membrana (consulte la Tabla de materiales) con el flujo de entrada a la bomba.NOTA: El puente es vital para permitir que la sangre continúe circulando a través de la máquina mientras se realizan las AC del animal. Una vez que todos los puntos de conexión estén sellados, cebe el circuito con 300 mL de una solución salina de heparina (1,000 UI de heparina mezclada en 1 L de solución salina) y 300 mL de sangre fresca de cerdo donante, seguidos de 3.5 mEq de bicarbonato de sodio, 350 UI de heparina y 450 mg de gluconato de calcio (ver Tabla de Materiales).”Barrer” el circuito haciendo pasar la mezcla de sangre, heparina-solución salina, bicarbonato de sodio y gluconato de calcio a través de todo el circuito durante 2 minutos a una velocidad de 0,3 L/min. 3. Cirugía e iniciación a la CEC NOTA: La Figura 1 complementaria muestra los materiales quirúrgicos necesarios para la colocación de cánulas. Exponga la vena yugular interna izquierda y la arteria carótida derecha para prepararse para la canulación (Figura 4). Para la canulación, utilice la técnica de Seldinger o “over-the-wire”21.Primero, inserte un catéter de aguja en la vena yugular interna izquierda. Una vez que se visualice un destello de sangre, inserte con cuidado un alambre guía en el vaso y retire la aguja, asegurándose de que el alambre permanezca en su lugar. Pase un dilatador sobre el alambre y dentro del vaso, luego retire el dilatador. Con el alambre aún en su lugar, enrosque una cánula venosa de 8 Fr y avancela lentamente ~ 4 cm en el vaso. Retire con cuidado el alambre, asegurándose de que la cánula permanezca en su lugar. Repita la técnica de alambre de Seldinger con dilatación para colocar una cánula arterial pediátrica de 6 Fr (ver Tabla de materiales) en la arteria carótida derecha. En el momento de la canulación arterial, administrar un bolo de heparina intravenosa (50 UI/kg) a través de la cánula arterial recién colocada. Una vez logrado el acceso, fije firmemente ambas cánulas al animal utilizando suturas y cinta adhesiva 3-0 poly absorbibles para evitar que se retiren inadvertidamente (Figura 5). Conecte las cánulas al circuito CPB, asegurándose de que se agregue solución salina con heparina a los puntos de conexión para evitar que entre aire en el circuito. Ajuste el caudal inicial a 80-85 mL/kg/min y auméntelo lentamente hasta un caudal final de 150 mL/kg/min.NOTA: El animal puede permanecer en el CPB durante el tiempo que requieran los experimentos. En la Figura complementaria 2 se muestra un esquema de los pasos 1 a 3. 4. Paro circulatorio y cardíaco (AC) Para inducir la AC, administre 9 mEq de KCl. Utilice los signos vitales para evaluar el paro completo y confirme con ecocardiografía. Administre KCl adicional según sea necesario. Una vez que el corazón se detiene, aísle al animal del circuito para inducir un paro circulatorio. Mantenga el flujo del circuito CPB utilizando el puente descrito anteriormente (paso 3.5) circulando a 1,500 rpm. 5. Reanimación cardiopulmonar extracorpórea (eCPR) Una vez que se haya alcanzado la condición de CA adecuada (0 min, 30 min o 60 min), comience la reanimación con eCPR. Vuelva a conectar el lechón al circuito CPB. Administrar 3 mL de gluconato de calcio (2,25 mmol/10 mL, diluido 1:2) y 6 mL de bicarbonato de sodio (1 M, diluido 1:2) a través del acceso arterial periférico, añadiendo las dosis necesarias.NOTA: Se puede utilizar cardioversión o fármacos inotrópicos (adrenalina o dopamina) si es necesario. 6. Cuidados postoperatorios Una vez resucitado, controle los signos vitales durante 15 minutos para garantizar la estabilidad.NOTA: Los parámetros ideales en el período de la unidad de cuidados intensivos son: FC de 100-150 lpm, PA de 75-95/60-70 y spO2 > 85. Traslado de los animales para la resonancia magnética (RMN).NOTA: Después de las imágenes, los animales nunca se recuperaron y fueron sacrificados bajo anestesia mediante la administración intravenosa de pentobarbital sódico para obtener muestras de cerebro para el análisis histológico. En la Figura complementaria 3 se puede ver una línea de tiempo de la parte experimental del procedimiento, incluida la estrategia de recolección de muestras.

Representative Results

Durante un período de 6 meses, un equipo interdisciplinario de médicos de cuidados intensivos pediátricos, cardiólogos pediátricos, veterinarios y técnicos realizaron el protocolo completo 12 veces (Figura complementaria 2 y figura complementaria 3). La Figura 1 y la Figura 2 muestran la anatomía esperada de los animales utilizados en este protocolo. Los lechones incluidos tenían una media de …

Discussion

La derivación cardiopulmonar se usa comúnmente durante la cirugía cardíaca para adultos, niños y recién nacidos. Se basa en un circuito extracorpóreo motorizado y un oxigenador de membrana que trabajan juntos para oxigenar la sangre y proporcionar estabilización pulmonar y cardíaca. Estudios previos han demostrado que la CEC puede afectar negativamente a muchos sistemas de órganos (renal, cerebral, pulmonar, cardíaco, gastrointestinal) tanto en pacientes enfermos como anteriormente sanos^</sup…

Materials

1.5% sevofluorane	Zoetis	20070289
2.5 mm endotracheal tube	Henry Schein	988-1782
3 Fr catheter for peripheral arterial access	Prodimed	3872.1
4 Fr catheter for peripheral venous access	Prodimed	3872.13
6 French ECMO pediatric arterial cannula	Medtronic	77206
8 French ECMO pediatric venous cannula	Medtronic	68112
Adrenaline	B Braun	469801-1119
Adson forceps	Allgaier instruments	08-030-130	Any brand may be substituted
BP cuff	Mindray
Buprenorfine (0.01 mg/kg)	Richter Pharma	#9004114000537
Calcium gluconate (2.25 mmol/10 mL)	B Braun	570-12606194-1119
Dexmedetomidine (0.5-2.0 µg/kg/min)	Orion farma	GTN 064321000017253
Dolethol	vetoquinol	#3605870004904
Dopamine	hikma	A044098010
Fentanyl (25-200 µg/kg/min)	Kern Pharma	756650.2H
Fresh donor pig blood Type O	Any
Heat Exchanger	Maquet Gmbh & Co	MCP70107.2130
Heparin (1350 UI)	ROVI	641641.1
Irwin retractor	Aesculap	BV104R	Any brand may be substituted
Ketamine (20 mg/kg)	Richter Pharma	#9004114000452
Lubricant	Any orotracheal lubricant
Midazolam (0.3 mg/kg)	Serra Pamies	619627.4
Mosquito forceps	Aesculap	BH109R	Any brand may be substituted
Needle forceps	Aesculap	BM016R	Any brand may be substituted
Normal saline (0.9%)	B Braun Fisiovet	5/469827/0610	Any brand may be substituted
Plastic clamps for tubing	Achim Schulz-Lauterbach	DBGM	Any brand may be substituted
Potassium chloride (9 mEq)	B Braun	3545156
Propofol (0.5 mg/kg)	Zoetis	579742.7
Quadrox Membrane Oxygenator	Maquet Gmbh & Co	BE-HMOSD 300000
Rectal thermometer	Any
RotaFlow Console ECMO system	Maquet Gmbh & Co	MCP00703177	Neonatal ECMO System
Scalpel	Aesculap	BB074R	Any brand may be substituted
Sodium bicarbonate (1 M)	Fresenius Kabi	634477.4 OH
Surgical scissors	Talmed Inox	112	Any brand may be substituted
Suture (3/0 poly absorbable)	B Braun Novosyn (R)	0068030N1	Any brand may be substituted