Imágenes de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos en tejidos humanos y de ratón

Resumen

Las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) se asocian con diversas enfermedades, y la inmunofluorescencia se utiliza a menudo para su visualización. Sin embargo, existen varios protocolos de tinción y, en muchos casos, solo se examina un tipo de tejido. Aquí, establecemos un protocolo de aplicación general para la tinción de NET en tejido de ratón y humano.

Resumen

Las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) son liberadas por los neutrófilos como respuesta a una infección bacteriana o daño tisular traumático, pero también desempeñan un papel en las enfermedades autoinmunes y la inflamación estéril. Son estructuras en forma de red compuestas por filamentos de ADN bicatenarios, histonas y proteínas antimicrobianas. Una vez liberados, los TNE pueden atrapar y matar patógenos extracelulares en la sangre y los tejidos. Además, los TNE participan en la regulación homeostática estimulando la adhesión plaquetaria y la coagulación. Sin embargo, la producción desregulada de TNE también se ha asociado con diversas enfermedades, como la sepsis o los trastornos autoinmunes, lo que los convierte en una diana prometedora para la intervención terapéutica. Aparte de la microscopía electrónica, la visualización de los NET mediante imágenes de inmunofluorescencia es actualmente uno de los únicos métodos conocidos para demostrar las interacciones de los NET en los tejidos. Por lo tanto, se han utilizado varios métodos de tinción para visualizar los NET. En la literatura, se describen diferentes protocolos de tinción, e identificamos cuatro componentes clave que muestran una alta variabilidad entre los protocolos: (1) los tipos de anticuerpos utilizados, (2) el uso de agentes reductores de autofluorescencia, (3) los métodos de recuperación de antígenos y (4) la permeabilización. Por lo tanto, los protocolos de tinción de inmunofluorescencia in vitro se adaptaron y mejoraron sistémicamente en este trabajo para hacerlos aplicables a diferentes especies (ratón, humano) y tejidos (piel, intestino, pulmón, hígado, corazón, disco espinal). Después de la fijación y la inclusión en parafina, se montaron secciones de 3 μm de espesor en portaobjetos. Estas muestras se tiñeron con anticuerpos primarios para mieloperoxidasa (MPO), histona citrulinada H3 (H3cit) y elastasa de neutrófilos (NE) de acuerdo con un protocolo de tinción modificado. Los portaobjetos se tiñeron con anticuerpos secundarios y se examinaron con un microscopio de fluorescencia de campo amplio. Los resultados se analizaron de acuerdo con una hoja de evaluación y las diferencias se registraron de forma semicuantitativa.

Aquí, presentamos un protocolo de tinción NET optimizado adecuado para diferentes tejidos. Utilizamos un nuevo anticuerpo primario para teñir H3cit y redujimos la tinción inespecífica con un agente reductor de autofluorescencia. Además, demostramos que la tinción con NET requiere una temperatura alta constante y un manejo cuidadoso de las muestras.

Introducción

Las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) fueron visualizadas por primera vez por Brinkmann et al. como una vía de muerte celular diferente de la apoptosis y la necrosis en 2004¹. En esta vía, los neutrófilos liberan su cromatina descondensada en el espacio extracelular para formar grandes estructuras en forma de red cubiertas de proteínas antimicrobianas que antes se almacenaban en los gránulos o en el citosol. Estas proteínas antimicrobianas incluyen la elastasa de neutrófilos (NE), la mieloperoxidasa (MPO) y la histona citrulinada H3 (H3cit), que se utilizan comúnmente para la detección indirecta por inmunofluorescencia de los TNE

Protocolo

Este estudio incluyó tejidos de ratón derivados de experimentos aprobados por la Administración Estatal de Investigación Animal de Hamburgo, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburgo, Alemania (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Los tejidos utilizados fueron pulmón y colon de ratón de un modelo séptico y piel quemada. Se utilizaron ratones machos y hembras de 8 semanas de edad. En todos los experimentos se siguió la Directiva Europea 2010/63/UE relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos. Las muestras humanas anonimizadas incluyeron tejidos de enterocolitis neonatal, piel quemada, atresia biliar, espondilodiscitis y miocard....

Resultados

Antes de comenzar la optimización de nuestro protocolo, identificamos los pasos clave para una tinción exitosa mediante la búsqueda en PubMed de estudios que utilizaran tejido FFPE para la inmunotinción de TNE y comparamos sus protocolos. Las diferencias de protocolo más prometedoras se identificaron como los pasos clave para la optimización del protocolo, mientras que los pasos que en su mayoría se correspondían entre sí no se modificaron (Tabla 1).

Tabla 1: Investiga.......

Discusión

En este trabajo, nuestro objetivo era adaptar y optimizar los protocolos existentes para la obtención de imágenes de TNE a más tipos de tejidos, comenzando con el proceso de tinción real. El primer paso crítico para este método es la selección de los anticuerpos más adecuados. Para la NE, probamos un anticuerpo de NE de un huésped de ratón en tejido humano, que no mostró una tinción confiable en comparación con la NE de un huésped de conejo. Además, Thålin et al. propusieron H3cit (R8) como un anticuerpo más específico p.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
			Dilución
Anticuerpo anti-elastasa de neutrófilos 100µ g	abcam	ab 68672	1:100
Anticuerpo anti-histona H3 (citrulina R2 + R8 + R17)  100µ g	abcam	Ab 5103	1:50
Anticuerpo anti-mieloperoxidasa [2C7] anti-humano 100 µ g	abcam	Ab 25989	1:50
Anticuerpo anti-mieloperoxidasa [2D4] anti-ratón 50 y micro; g	abcam	Ab 90810	1:50
Software de microscopía Axiovision	Zeiss	4.8.2.
Solución bloqueante con suero de burro (LISTO PARA USAR) 50ml	GeneTex
Cubreobjetos	Marienfeld	0101202
Dako Solución de Recuperación de Objetivos Citrato pH6 (x10)	Dako	S2369
DAPI 25 mg	Roth	6335.1	1:25000
Dilución de anticuerpos DCS 500 mL	Diagnóstico DCS	DCS AL120R500
Burro hormiga cabra Cy3	JacksonImmunoResearch	705-165-147	1:200
Burro anti conejo AF647	JacksonImmunoResearch	711-605-152	1:200
Burro anti conejo Cy3	JacksonImmunoResearch	711-165-152	1:200
Fluoromount-G Medio de montaje	Invitrogen	00-4958-02
Estante de portaobjetos de vidrio	Roth	H552.1
Humano/Ratón MPO Anticuerpo	R& D Sistemas	AF 3667	1:20
Bolígrafo Hidrofóbico	KISKER	MKP-1
Isokontrolle Conejo IgG Policlonal 5mg	abcam	Ab 37415	1:2000 y 1:250
MaxBlock Kit de Reactivos Reductores de Autofluorescencia (RUO) 100 ml	Maxvision	MB-L
	Zeiss	AxioCamHR3
Microondas	Bosch	HMT84M421
Ratón IgG1 control negativo	Dako	X0931 Aglient	1:50 y 1:5
Cabra Normal IgG Control	R& D Sistemas	AB-108-C	1:100
PBS Solución salina tamponada con fosfato (10x)	Sigma-Aldrich	P-3813
Frasco de tinción PMP	Roth	2292.2
Anticuerpo recombinante Anti-histona H3 (citrulina R8) 100µ g	abcam	Ab 219406	1:100
IgG recombinante de conejo, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µ g	abcam	Ab 172730	1:300
ROTI Histol	Roth	6640
Portaobjetos SuperFrost Plus	R. Langenbrinck	03-0060
TBS Tris solución salina tamponada (x10)	Sigma-Aldrich	T1503
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Baño de agua	Memmert	830476
Olla arrocera	al baño de aguareishunger	RCP-30
Cámara húmeda	Weckert Labortechnik	600016
Zeiss Microscopio de campo amplio	Zeiss	Axiovert 200M

GTX30972 Cámara de Microscopía