Imágenes de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos en tejidos humanos y de ratón

Las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) fueron visualizadas por primera vez por Brinkmann et al. como una vía de muerte celular diferente de la apoptosis y la necrosis en 2004¹. En esta vía, los neutrófilos liberan su cromatina descondensada en el espacio extracelular para formar grandes estructuras en forma de red cubiertas de proteínas antimicrobianas que antes se almacenaban en los gránulos o en el citosol. Estas proteínas antimicrobianas incluyen la elastasa de neutrófilos (NE), la mieloperoxidasa (MPO) y la histona citrulinada H3 (H3cit), que se utilizan comúnmente para la detección indirecta por inmunofluorescencia de los TNE². Este método no solo identifica la presencia cuantitativa de estas proteínas; de hecho, tiene la ventaja de detectar específicamente estructuras similares a NET. En los NETs, las proteínas mencionadas se colocalizan con el ADN extracelular, que puede ser detectado por una superposición de las señales de fluorescencia de cada proteína teñida y el ADN extracelular. A diferencia de las señales superpuestas debidas a la colocalización extracelular de ADN y proteínas en los TNE, los neutrófilos intactos no muestran colocalización. Aquí, los componentes del NET generalmente se almacenan por separado en los gránulos, los núcleos y el citosol³.

Desde su primer descubrimiento, se ha demostrado que los TNE desempeñan un papel central en numerosas enfermedades, especialmente en las que implican inflamación. Los TNE muestran funciones antimicrobianas durante la infección al atrapar y matar patógenos extracelulares en sangre y tejidos ^4,5. Sin embargo, los TNE también se han relacionado con enfermedades autoinmunes y respuestas hiperinflamatorias, como el lupus eritematoso sistémico, la artritis reumática y el asma alérgica ^6,7,8. Los TNE promueven la vaso-oclusión y la inflamación en la aterosclerosis, la adhesión plaquetaria y se especula que desempeñan un papel en el cáncer metastásico 9,10,11. Sin embargo, se cree que tienen propiedades antiinflamatorias al reducir los niveles de citoquinas proinflamatorias¹². Si bien los NET están ganando más interés en un campo de investigación más amplio, un método robusto de detección de NET es fundamental para futuras investigaciones.

A pesar de que la visualización de los TNE en diferentes tejidos mediante imágenes de inmunofluorescencia es compleja y requiere personalización, además de la microscopía electrónica, actualmente es uno de los métodos más reconocidos para visualizar las interacciones entre los TNE y las células y se utiliza predominantemente en tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE)^13,14. Sin embargo, la comparación de las imágenes NET es difícil, ya que los diferentes laboratorios utilizan sus propios protocolos personalizados. Estos protocolos difieren en el uso de anticuerpos, la recuperación de antígenos o el método de permeabilización y, a menudo, están optimizados para un tipo específico de tejido 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ^,27.

Después de que Brinkmann et al. publicaran el primer estudio metódico utilizando la visualización inmunofluorescente de NETs en tejido FFPE, quisimos optimizar este protocolo para una variedad más amplia de tejidos y especies¹⁵. Además, para establecer un protocolo de inmunofluorescencia ampliamente aplicable, probamos diferentes protocolos modificados de estudios que utilizaron métodos de inmunofluorescencia en tejido FFPE para detectar NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. Además, probamos un nuevo anticuerpo H3cit para una tinción extracelular más específica²⁸. Nuestra hipótesis es que mediante la adaptación sistemática de los protocolos de tinción actuales a diferentes especies y tejidos, se pueden mejorar las imágenes in vitro, lo que resulta en una mejor representación de la interacción entre los neutrófilos y los NET tanto a nivel local como sistémico.

Este estudio incluyó tejidos de ratón derivados de experimentos aprobados por la Administración Estatal de Investigación Animal de Hamburgo, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburgo, Alemania (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Los tejidos utilizados fueron pulmón y colon de ratón de un modelo séptico y piel quemada. Se utilizaron ratones machos y hembras de 8 semanas de edad. En todos los experimentos se siguió la Directiva Europea 2010/63/UE relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos. Las muestras humanas anonimizadas incluyeron tejidos de enterocolitis neonatal, piel quemada, atresia biliar, espondilodiscitis y miocardio. Según el Comité de Ética de la Investigación Médica de Hamburgo, las muestras no necesitaron consentimiento informado, pero el estudio fue aprobado por el comité (WF-026/21).

1. Fijación de la muestra

1. Utilice el siguiente protocolo derivado de Abu Abed y Brinkmann para la fijación de muestras, la deshidratación, la inclusión en parafina, el seccionamiento y el montaje ^3,15.
   1. Prepare una solución de formaldehído al 4% disolviendo 40 g de paraformaldehído (PFA) en 800 ml de solución salina tamponada con Tris, pH 7,4 (TBS).
   2. Agitar la mezcla a 60 °C bajo una campana extractora hasta que el PFA se haya disuelto. Lleve la solución a temperatura ambiente (RT) y ajuste el volumen con TBS a 1.000 ml.
   3. Ajusta el pH a 7,4. Conservar a 4 °C durante 2-3 semanas o a -20 °C durante un máximo de 1 año.
2. Para la fijación de la muestra, coloque el tejido fresco en tampón TBS y diseccione en trozos de menos de 20 mm x 30 mm x 3 mm. Sumerja las secciones de tejido en una solución de paraformaldehído al 4% durante 12-24 h.
   NOTA: El protocolo original utilizaba una solución de PFA al 2% y un tiempo de fijación de 8-20 h. Con este método, algunas secciones de tejido no se fijaron completamente después de 20 h, por lo que la concentración de PFA se incrementó al 4% de PFA.
3. Transfiera las muestras a casetes de procesamiento de tejidos etiquetados. Use marcadores o lápices resistentes a solventes para etiquetar.
4. Inicie la deshidratación de la muestra sumergiendo los casetes en etanol al 70% durante 1 h. Luego, sumérjalo en etanol al 80%, etanol al 90%, etanol al 96% y dos veces en etanol al 100%, con una duración de 1 h en cada paso.
5. Sumergir dos veces en xileno al 100% (dimetilbenceno) y luego dos veces en parafina a 60 °C durante 1 h cada vez.
6. Use moldes de inclusión para el montaje y deje que la parafina se solidifique antes de quitar el molde.
7. Utilice un micrótomo para cortar secciones de tejido de 3 μm de grosor.
8. Utilice unas pinzas para colocar las secciones cortadas en un baño de agua a 37 °C y déjelas flotar en la superficie para estirar los cortes de tejido.
9. Coloque las secciones en portaobjetos de vidrio adhesivo (Tabla de materiales) y déjelas secar durante la noche en una cámara de calor a 40 ° C.

2. Rehidratación de la muestra

1. Para la desparafinación, apile los portaobjetos en una rejilla de portaobjetos y sumérjalos dos veces durante 5 minutos cada uno en el medio de reemplazo de xileno limoneno (Tabla de materiales) y una vez durante 5 minutos en una mezcla 1:1 de limoneno / etanol.
   PRECAUCIÓN: El limoneno es inflamable a 50 °C y puede causar reacciones alérgicas. Úselo debajo de una campana extractora con protección para los ojos y guantes. Manténgase alejado del fuego abierto.
2. Rehidrate las muestras en una serie descendente de etanol sumergiendo la rejilla de portaobjetos dos veces en etanol al 100 % y una vez en etanol al 96 %, al 90 % de etanol, al 80 % de etanol y al 70 % de etanol durante 5 minutos cada una.
3. Sumerja la rejilla de portaobjetos durante 5 minutos en agua desionizada (agua desionizada) para limpiar cualquier resto de etanol.

3. Bloqueo de autofluorescencia y recuperación de antígenos

1. Prepare la solución de recuperación de citrato de pH 6 (TRS) (Tabla de materiales) de acuerdo con la hoja de datos. Este TRS se concentra 10 veces. Por lo tanto, diluya 1:10 con agua desionizada. Precalentar en un tarro de plástico a 96 °C.
   NOTA: TRS rompe los puentes de metileno formados durante la fijación de la muestra para exponer los epítopos del antígeno. Esto permite que los anticuerpos primarios se unan a su antígeno diana. Almacenar TRS concentrado a 2-8 °C durante 8 meses. Siempre prepare TRS fresco.
2. Saque los portaobjetos de la rejilla de portaobjetos y colóquelos en una cámara húmeda. Pipetear una o dos gotas de agente reductor de autofluorescencia (Tabla de materiales) en cada muestra. Incubar durante 5 min.
   NOTA: El agente reductor de autofluorescencia bloquea la autofluorescencia tisular inherente causada por fluoróforos y fijadores endógenos. Almacene el agente reductor de autofluorescencia en RT hasta por 1 año.
   NOTA: Trabaje solo con pequeñas secciones de tejidos para evitar que las muestras se sequen o excedan el tiempo de incubación.
3. Vuelva a apilar los portaobjetos en la rejilla de portaobjetos y enjuague durante 1 minuto con etanol al 60 % con un movimiento hacia arriba y hacia abajo hasta que se haya eliminado todo el reactivo reductor de autofluorescencia no utilizado.
4. Sumerja la rejilla deslizante durante 5 minutos en agua desionizada.
5. Para la recuperación de antígenos, transfiera los portaobjetos a un frasco de tinción con el TRS precalentado. Incubar durante 10 min a 96 °C en un baño maría.
   NOTA: El baño de agua a 96 °C se puede sustituir por un microondas o una cocina de vapor si el TRS se precalienta a 96 °C y se garantizan 10 minutos de tiempo de incubación a 96 °C.
6. Saque el frasco de tinción y déjelo enfriar lentamente a RT durante aproximadamente 60-90 minutos.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí hasta por 4 h, dejando las diapositivas en el TRS.
7. Retire el TRS, pero mantenga los portaobjetos en el frasco. Enjuague dos veces con solución salina tamponada con Tris con 0.05% de Tween (TBST, pH 7.4) durante 3 minutos cada una para eliminar cualquier residuo de TRS sobrante.
8. Para la permeabilización, prepare Triton al 0,2 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, y llénelo en el frasco de tinción para permeabilizar las muestras durante 10 min.
   NOTA: La permeabilización mejora la unión de los anticuerpos primarios con las proteínas diana intracelulares en las muestras fijas.
9. Enjuague los portaobjetos nuevamente dos veces en TBST durante 3 minutos cada vez.
10. Prepare la cámara húmeda y coloque los portaobjetos. Limpie el exceso de agua de los portaobjetos con pañuelos de papel. Encierre cada muestra en un círculo con una pluma de barrera hidrofóbica para evitar que la solución de anticuerpos se escurra.
    NOTA: No deje que las muestras se sequen. Lo mejor es trabajar con secciones pequeñas.

4. Bloqueo de la unión de anticuerpos inespecíficos

1. Tome una solución de bloqueo lista para usar con suero de burro (Tabla de materiales) y pipetee una gota en cada muestra. Incubar durante 30 min en RT.
   NOTA: Este paso de bloqueo minimiza la unión del anticuerpo secundario a sitios de unión no específicos en la muestra. Después de bloquear estos epítopos inespecíficos y aplicar el anticuerpo primario, el anticuerpo secundario se unirá al anticuerpo primario y no interactuará con la superficie del tejido. Este reactivo de bloqueo listo para usar se almacena a 2-8 °C durante 6 meses.
2. Retire el exceso de solución de bloqueo de los portaobjetos golpeando el borde de los portaobjetos contra una superficie dura. No los enjuague.

5. Anticuerpo primario

1. Diluir los anticuerpos primarios en el tampón de dilución de anticuerpos (Tabla de materiales). Utilice aproximadamente 100 μL de la solución final para cada muestra. Para el anticuerpo NE y H3cit (R8) y el isocontrol, diluir a una concentración de 5 μg/mL. Para MPO y el isocontrol correspondiente, utilice 10 μg/mL. Prepare un tubo para cada anticuerpo primario y uno para cada anticuerpo de isocontrol.
   NOTA: H3cit (R8)/MPO o NE/MPO y sus isocontroles pueden combinarse para la tinción de NETs. Para la combinación de H3cit (R8)/MPO, diluir hasta una concentración final de 5 μg/ml para H3cit (R8) y 10 μg/ml para MPO hasta un volumen final de 100 μl por muestra. Para NE/MPO, diluir a una concentración final de 5 μg/mL para NE y 10 μg/mL para MPO a un volumen final de 100 μL por muestra. Para el isocontrol, utilice la misma concentración que para cada anticuerpo correspondiente. Utilice siempre una nueva punta de pipeta para cada anticuerpo utilizado. Los anticuerpos primarios pueden almacenarse a 4 °C durante 1-2 semanas y a -20 °C o -80 °C durante un máximo de 1 año.
2. Con dos muestras en un portaobjetos, utilice una para los anticuerpos de isocontrol y otra para la dilución de anticuerpos MPO/H3cit o MPO/NE. Utilice aproximadamente 100 μL para cada muestra y distribuya la solución de anticuerpos de manera uniforme.
   NOTA: No deje que las muestras se sequen. Tenga cuidado de no mezclar el isocontrol y los anticuerpos primarios.
3. Conservar en una cámara húmeda durante la noche a 4 °C.
4. Al día siguiente, retira el exceso de solución de anticuerpos primarios de los portaobjetos y apila los portaobjetos en una cubeta. Enjuague tres veces durante 5 minutos cada vez con TBST para eliminar la solución de anticuerpos primarios restante.

6. Anticuerpo secundario

1. Prepare la solución de anticuerpos secundarios. Utilice dos anticuerpos secundarios fluorescentes diferentes: burro-anti-cabra para MPO y burro-anti-conejo para la tinción de H3cit. Diluir cada uno a una concentración de 7,5 μg/mL con tampón de dilución de anticuerpos (Tabla de materiales).
   NOTA: Para la tinción doble, utilice dos anticuerpos fluorescentes con diferentes áreas de excitación y una superposición espectral mínima. Combinar ambos anticuerpos secundarios y diluir hasta una concentración final de 7,5 μg/ml para cada anticuerpo para obtener un volumen final de 100 μl por muestra. Protege los anticuerpos de la luz. Los anticuerpos secundarios pueden almacenarse a 2-8 °C durante 6-8 semanas o a -80 °C durante un máximo de 1 año.
2. Mantenga los portaobjetos en la cámara húmeda y agregue 100 μL de la solución de anticuerpos secundarios a cada muestra. Déjalos incubar durante 30 min a RT y protegidos de la luz.
3. Retire el exceso de solución de anticuerpos secundarios y apile los portaobjetos en la rejilla de portaobjetos. Sumergir tres veces durante 5 minutos cada una en un frasco de tinción lleno de PBS para eliminar los anticuerpos restantes no unidos.
4. Prepare la solución de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) (Tabla de materiales) y diluya a una concentración de 1 μg/ml con agua desionizada. Sumerja la rejilla de portaobjetos en un frasco de tinción con solución DAPI e incube durante 5 minutos a RT en la oscuridad.
   NOTA: DAPI se utiliza como tinción fluorescente para ADN bicatenario. La solución DAPI preparada se puede utilizar varias veces. Guarde la solución DAPI preparada en RT. El concentrado DAPI puede almacenarse a -20 °C durante un máximo de 1 año.
5. Sumerja la rejilla de portaobjetos durante 5 minutos en un frasco de tinción con PBS para lavar el exceso de solución DAPI.

7. Montaje y almacenamiento de las muestras, análisis microscópico

1. Monte las muestras con cubreobjetos y medio de montaje (Tabla de materiales).
   NOTA: Utilice solo pequeñas cantidades de medio de montaje y limpie el exceso de medio con pañuelos húmedos. Use guantes y evite limpiar accidentalmente cualquier medio de los cubreobjetos o portaobjetos. Evite la formación de burbujas y use hisopos de algodón para presionar suavemente los cubreobjetos para eliminar las burbujas de los portaobjetos.
2. Para obtener imágenes, utilice un microscopio de campo amplio o un microscopio confocal.
   NOTA: Tome primero una imagen del isocontrol. Reduzca el tiempo de exposición de los filtros de fluorescencia (excepto el filtro azul para DAPI) hasta que casi no se pueda detectar ninguna señal. A continuación, utilice esta configuración para examinar las muestras correspondientes. Busque áreas donde se pueda detectar una señal fluorescente en cada muestra individual utilizando el canal de fluorescencia. Después de tomar una imagen del área, el programa genera una imagen compuesta de todos los canales y muestra las diferentes señales de fluorescencia como una superposición de diferentes colores. A continuación, la imagen se puede analizar más a fondo para su colocalización con software de imágenes como ImageJ.
3. Guarde los portaobjetos a 4 °C durante un máximo de 6 meses.

Antes de comenzar la optimización de nuestro protocolo, identificamos los pasos clave para una tinción exitosa mediante la búsqueda en PubMed de estudios que utilizaran tejido FFPE para la inmunotinción de TNE y comparamos sus protocolos. Las diferencias de protocolo más prometedoras se identificaron como los pasos clave para la optimización del protocolo, mientras que los pasos que en su mayoría se correspondían entre sí no se modificaron (Tabla 1).

Tabla 1: Investigación en PubMed para la inmunotinción FFPE de los tumores neuroendocrinos. En esta tabla se muestran las variables del protocolo de inmunotinción en los estudios examinados. Los protocolos utilizados se dividieron en sus pasos esenciales y luego se compararon entre sí. Los pasos con las diferencias más prometedoras se tomaron como pasos clave para la optimización y se adaptaron a nuestro protocolo. Los pasos que en su mayoría se correspondían entre sí no cambiaron, como el tiempo de incubación del anticuerpo primario (durante la noche, 4 °C). Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Basándonos en nuestros hallazgos, llegamos a la conclusión de que los anticuerpos elegidos para dirigirse a los epítopos fueron el primer paso crítico. Al menos 10 protocolos diferentes utilizaron el anticuerpo triH3cit (ver Tabla 1; Columna primaria de anticuerpos). No obstante, Thålin et al. encontraron que el clon H3cit (R8) mostró una menor reactividad cruzada fuera del objetivo a las histonas no citrulinadas y mostró una variabilidad insignificante entre lotes. Por lo tanto, decidimos comparar los resultados de la tinción de triH3cit y H3cit (R8) entre sí28.

Cuatro estudios utilizaron el anticuerpo MPO humano/ratón. Además, otros dos protocolos aplicaron MPO (2D4) para tejido de ratón y MPO (2C7) para tejido humano (ver Tabla 1; Columna primaria de anticuerpos). Por lo tanto, comparamos por separado la MPO (2C7) con el anticuerpo MPO humano/ratón para tejidos humanos y la MPO (2D4) con el anticuerpo MPO humano/ratón para tejidos de ratón. La NE se detectó utilizando al menos cinco anticuerpos diferentes, pero solo tres de ellos mostraron buenos resultados de tinción en las imágenes proporcionadas. Sin embargo, un anticuerpo ya no estaba disponible en el mercado, por lo que comparamos el anticuerpo NE de un huésped conejo con uno de un huésped ratón para nuestra serie de pruebas en tejidos humanos. En el caso de las muestras de ratón, no parecía haber una alternativa disponible y fiable al anticuerpo NE criado en conejos huéspedes al inicio de este estudio. Dado que un NE y ambos anticuerpos H3cit se derivan del mismo huésped de conejo, no se pueden combinar para la doble tinción con este protocolo. El anticuerpo secundario es específico de la región constante del anticuerpo primario, que está determinada por el huésped en el que se crió. Si se utilizan dos anticuerpos primarios derivados del mismo huésped, el anticuerpo secundario podría unirse a ambos anticuerpos primarios y la tinción sería inespecífica. Sin embargo, se prefiere la tinción doble a la tinción simple porque se pueden detectar y colocalizar más componentes de NET. Por lo tanto, el resultado de la tinción será más específico. En consecuencia, teñimos dos veces H3cit y MPO para obtener un protocolo de detección más robusto.

A pesar de las similitudes en los anticuerpos utilizados, las diluciones de los anticuerpos variaron en casi todos los protocolos; por ejemplo, para triH3cit, el rango de concentración fue de 0,5 μg/mL a 20 μg/mL17,18. Para cada anticuerpo utilizado, probamos diferentes diluciones y obtuvimos resultados de tinción satisfactorios en todo el rango reportado en la literatura.

Además, se pueden encontrar muchas similitudes en el tiempo de incubación del anticuerpo primario (durante la noche a 4 °C) y el uso y dilución del anticuerpo secundario (ver Tabla 1; Columna primaria de anticuerpos de incubación). Por lo tanto, no cambiamos estos pasos en nuestra serie de pruebas y los realizamos de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente.

El siguiente paso crítico determinado a partir de la literatura fue la recuperación del antígeno. Este paso es esencial porque, debido a la fijación en formol, los epítopos de los anticuerpos se enmascaran a través de puentes de metileno, que pueden revertirse calentando la sección de tejido en un tampón adecuado29. El citrato TRS a pH 6 y el tampón EDTA TRS a pH 9 se utilizaron con la misma frecuencia en la bibliografía y dieron resultados similares (ver Tabla 1; Columna de búfer TRS). Por lo tanto, nos decidimos por el citrato TRS de pH 6 para nuestra serie de pruebas. Para la recuperación de antígenos, probamos dos métodos de calentamiento diferentes: un microondas (primero 1 min a 360 W y luego 9 min a 90 W) y un baño de agua (60 °C durante 90 min, 96 °C durante 10 min).

El último paso que mostró cierta variabilidad en la literatura fue la permeabilización con Triton X-100. Este paso requirió optimización porque con el tratamiento con detergente, la membrana celular se vuelve permeable a los anticuerpos y se pueden alcanzar epítopos intracelulares30. Los protocolos anteriores utilizaban diferentes concentraciones de Triton X-100 que oscilaban entre el 1% y el 0,1% (ver Tabla 1; Columna de permeabilización). Por lo tanto, probamos dos concentraciones de Triton X-100 (0,2% y 0,5%) y una serie sin permeabilización de Triton.

Después de identificar estos pasos clave, los modificamos e intentamos optimizar el protocolo. A continuación, las imágenes se examinaron de acuerdo con una hoja de evaluación, y las diferencias se registraron semicuantitativamente y se compararon (ver Tabla 2).

Tabla 2: Tabla de resultados para optimizar los pasos del protocolo. Esta tabla muestra los resultados para los pasos adaptados: agente reductor de autofluorescencia, recuperación de antígenos y permeabilización. Antes de comenzar esta serie de pruebas, probamos la mejor combinación y concentración de anticuerpos. Las diapositivas se evaluaron en 10 áreas diferentes, y luego se puntuó un área representativa de (-) para un resultado negativo a (++) para un resultado positivo que contenía NET. Los resultados parcialmente positivos incluyeron una mayor tinción de fondo difusa de células no neutrófilas. Abreviaturas: n/u = no se utiliza; - = resultado negativo; +/-tinción parcialmente positiva; + = tinción específica moderada; + = buena tinción de NETs y neutrófilos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Anticuerpos primarios
Antes de adaptar el protocolo, intentamos encontrar la mejor combinación de anticuerpos. Aquí, el triH3cit mostró más tinción de histonas intracelulares que el H3cit (R8). Para la detección de los tumores neuroendocrinos, decidimos utilizar el anticuerpo H3cit (R8) para la optimización de nuestro protocolo. Este anticuerpo solo se unió al H3cit extracelular y no mostró tinción de H3cit intracelular a esta concentración (ver Figura 1A, B).

Para la tinción de MPO, comparamos el anticuerpo MPO humano/ratón con el MPO (2C7) para el tejido humano (ver Figura 1C,D) y el MPO (2D4) para el tejido de ratón (ver Figura 1E,F). Los anticuerpos MPO (2D4) y MPO (2C7) no pudieron lograr una tinción consistente para múltiples tipos de tejido, mientras que la MPO humana/ratón dio lugar a una tinción buena y confiable para MPO. Por lo tanto, seleccionamos MPO humano/ratón para nuestro protocolo de tinción.

Para la NE, probamos un anticuerpo NE de un huésped de ratón en tejido humano, que mostró tinción de NE solo en una de cada cinco muestras en comparación con la tinción confiable del anticuerpo NE de un huésped conejo. Además, el anticuerpo NE de un huésped conejo es aplicable a tejidos humanos y de ratón. (ver Figura 1G,H).

Figura 1: Comparación de anticuerpos primarios en diferentes tejidos. (A) Tejido de enterocolitis neonatal humana (ECN) teñido con H3cit (R8) (rojo). Aquí, solo se puede detectar una señal extracelular. (B) Mismo tejido teñido con triH3cit (R2,8,17) (rojo). Este anticuerpo crea una señal más amplia con una intensa tinción intracelular de histonas citrulinadas (flechas amarillas). (C,E) Tejido NEC humano (C) y tejido de vólvulo de ratón (E) con buena tinción para H3cit (R8) (rojo) y MPO de ratón/humano (verde). La colocalización de la señal H3cit, MPO y DAPI (azul) indica la formación de NET (flechas blancas). (D,F) En comparación, (D) utilizando la MPO (2C7) para el tejido humano de NEC y la (F)MPO (2D4) (verde) para el tejido de vólvulo de ratón, no se pudo obtener ninguna señal de MPO. (G) Muestra de piel humana quemada con tinción muy fuerte para el anticuerpo NE de un huésped conejo (magenta) en comparación con el resultado negativo de tinción (H) para el anticuerpo NE de un huésped ratón. Para el control del isotipo, véase la Figura Suplementaria Isocontrol 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Desparafinación
Aquí, el xileno se reemplazó con limoneno, que mostró una mejor desparafinación de las muestras de tejido en comparación con el xileno, con menos autofluorescencia en el fondo (ver Figura 2A, B).

Agente reductor de autofluorescencia
El agente reductor de autofluorescencia listo para usar a base de Sudan Black se puede aplicar durante 2-20 minutos. Aquí, lo aplicamos durante 0 min, 5 min y 10 min. Cuando no se utilizó ningún bloqueo, algunas muestras de ratón mostraron más tinción inespecífica, y se pudo alcanzar una tinción positiva parcial (véase la Figura 2C). El tiempo de bloqueo de 5 min mostró buenos resultados en todos los tipos de tejido, excepto en H3cit y MPO en tejido pulmonar y cutáneo de ratón (ver Tabla 2). A los 10 minutos de tiempo de bloqueo en algunas muestras, la tinción comenzó a ser menos brillante, por lo que el marco de tiempo de 5 minutos es la mejor opción para bloquear la autofluorescencia (ver Figura 2D, E).

Figura 2: Métodos de desparafinación y uso de un agente reductor de autofluorescencia. (A) Tejido de espondilodiscitis humana desparafinado con limoneno y teñido para H3cit (rojo) y MPO (verde). La formación trenzada de las señales y la colocalización parcial indican la presencia de NETs (flecha blanca). (B) La misma muestra de tejido se desparafinó con xileno, lo que dio como resultado resultados de tinción similares, lo que indica que el xileno ampliamente utilizado puede sustituirse por un medio de reemplazo. (C-E) Tejido pulmonar de ratón después de una sepsis inducida que muestra diferentes patrones de tinción de NE (magenta) cuando se utilizan diferentes tiempos de incubación para el agente reductor de autofluorescencia. Sin el uso de un reductor de autofluorescencia, la imagen C todavía muestra una ligera tinción de fondo de eritrocitos (flecha roja). Por el contrario, la imagen D muestra que después de 5 minutos de incubación con un agente reductor de autofluorescencia, se emite una señal clara. Después de 10 minutos, la calidad de la tinción en la imagen E disminuye y la señal se vuelve menos brillante. Para el control del isotipo, véase la Figura Suplementaria Isocontrol 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Métodos de recuperación de antígenos
Para la tinción de NE, calentamos las muestras en tampón de citrato de pH 6 durante 10 min en el microondas (primero durante 1 min a 360 W y luego durante 9 min a 90 W), durante 10 min en un baño de agua a 96 °C, o durante 90 min en un baño de agua a 60 °C. Aquí, las temperaturas más altas en el microondas y el baño de agua mostraron consistentemente una recuperación de antígeno de moderada a buena (ver Figura 3A). No se encontraron diferencias significativas entre el microondas y el baño de agua a 96 °C (ver Tabla 2). Además, se demostró que en un baño de agua a 60 °C, solo hubo tinción parcialmente positiva o nula (ver Figura 3B). Solo el íleon humano y el miocardio humano mostraron buenos resultados específicos. Como no se pudo lograr una tinción adecuada para NE con el baño de agua a 60 °C, se descartó la serie de pruebas de baño de agua a 60 °C para H3cit y MPO.

Para la tinción doble con MPO y H3cit, calentamos las muestras en tampón de citrato pH 6 en el microondas durante 10 min (primero durante 1 min a 360 W y luego durante 9 min a 90 W) o en un baño de agua a 96 °C durante 10 min. Aquí, ambos métodos mostraron buenos resultados específicos, con resultados ligeramente más favorables para el baño de agua a 96 °C (ver Figura 3C). Solo el pulmón y el tejido cutáneo del ratón pudieron lograr una clasificación general moderada (ver Tabla 2).

Sin embargo, si se superaba el tiempo de incubación de 40 min a 96 °C, se produjo una tinción de anticuerpos menos intensa, mientras que se observó una tinción de fondo sustancialmente mayor (véase la figura 3D).

Figura 3: Métodos de recuperación de antígenos. (A) El tejido de vólvulo de ratón teñido para NE (magenta) utilizando un tiempo de incubación de 10 minutos a 96 °C para la recuperación de calor muestra una señal significativamente más fuerte que (B) cuando se incuba la muestra durante 90 minutos en un baño de agua a 60 °C. (C) Además, la incubación de 10 minutos en la recuperación de antígenos a 96 °C también da como resultado una fuerte señal de H3cit (rojo) y MPO (verde) con tinción NET combinada (flechas blancas). D: Sin embargo, hervir las muestras durante más de 40 minutos da como resultado una tinción extracelular de H3cit menos específica y ninguna tinción de MPO. Para el control del isotipo, véase la figura complementaria Isocontrol 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Permeabilización
Intentamos permeabilizar las muestras con Triton X-100 en dos diluciones (0,2% y 0,5%) durante 10 min y lo comparamos con 10 min en agua desionizada. Aquí, 10 min con Triton 0,2% lograron buenos resultados en todos los tipos de tejido, aunque las diferencias fueron pequeñas en comparación con las condiciones de Triton 0,5% y agua desionizada (ver Tabla 2).

Figura complementaria Isocontrol 1: Controles de isotipo para la Figura 1. Todas las imágenes muestran una buena tinción de DAPI (azul), pero no hay señal para el anticuerpo fluorescente. Esto confirma que la unión de los anticuerpos primarios en la Figura 1 es específica del antígeno diana y no es el resultado de interacciones proteicas o de unión no específicas. (A) Tejido de enterocolitis neonatal humana (ECN) teñido con el anticuerpo isocontrol para H3cit (R8) (rojo). (B) Tejido NEC teñido con el anticuerpo isocontrol para H3cit (R2,8,17) (rojo). (C) Tejido de NEC (E) y tejido de vólvulo de ratón teñidos con los anticuerpos de isocontrol para H3cit (R8) (rojo) y MPO de ratón/humano (verde). (D) Tejido de NEC teñido con los anticuerpos isocontrol para H3cit (R8) (rojo) y MPO (2C7) (verde). (F) Tejido de vólvulo de ratón teñido con los anticuerpos de isocontrol para H3cit (R8) (rojo) y MPO 2D4 (verde). G: Muestra de piel humana quemada teñida con el anticuerpo isocontrol para el anticuerpo NE de un huésped conejo (magenta). (H) Mismo tejido teñido con el anticuerpo isocontrol para el anticuerpo NE de un huésped de ratón (magenta). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria Isocontrol 2: Controles de isotipo para la Figura 2. Todas las imágenes muestran una buena tinción de DAPI (azul), pero no hay señal para el anticuerpo fluorescente. Esto confirma la unión específica de los anticuerpos primarios en la Figura 2. Las imágenes C-E todavía muestran algunas manchas de fondo en magenta debido a los largos tiempos de exposición. Sin embargo, la señal NE de la Figura 2 se distingue de la tinción de fondo. (A) Tejido de la espondilodiscitis humana desparafinado con limoneno y teñido con anticuerpos isocontrol para H3cit (R8) (rojo) y MPO de ratón/humano (verde). (B) Misma muestra de tejido desparafinada con xileno y teñida con los anticuerpos isocontrol para H3cit (rojo) y MPO (verde). (C) Tejido pulmonar de ratón teñido con el anticuerpo isocontrol para NE (magenta), sin utilizar agente reductor de autofluorescencia. (D) El mismo tejido se tiñó con el anticuerpo isocontrol para NE (magenta) y 5 min de incubación con un agente reductor de autofluorescencia. (E) El mismo tejido teñido con el anticuerpo isocontrol para NE (magenta) y 10 min de incubación con un agente reductor de autofluorescencia. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria Isocontrol 3: Controles de isotipo para la Figura 3. Todas las imágenes muestran una buena tinción de DAPI (azul), pero no hay una señal específica para el anticuerpo fluorescente. Esto confirma la unión específica de los anticuerpos primarios en la Figura 3. (A) Tejido de vólvulo de ratón teñido con el anticuerpo isocontrol para NE (magenta) utilizando un tiempo de incubación de 10 min a 96 °C para la recuperación de calor. (B) El mismo tejido teñido con el anticuerpo isocontrol para NE (magenta) y recuperación de calor durante 90 min en un baño de agua a 60 °C. (C) El mismo tejido teñido con el anticuerpo de isocontrol para H3cit (rojo) y MPO (verde) y con idénticas condiciones de recuperación de calor que en A. El punto verde muestra un artefacto de tinción de anticuerpos secundarios agregados. (D) El mismo tejido teñido con el anticuerpo isocontrol para H3cit (rojo) y MPO (verde) y utilizando un tiempo de incubación de 40 min a 96 °C para la recuperación del calor. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria Isocontrol 4: Controles de isotipo para la Figura 4. Todos los isocontroles siguientes son de la misma diapositiva que el experimento "fallido" correspondiente. Los intentos fallidos no se hicieron intencionalmente, por lo que algunos isocontroles parecen utilizables, mientras que la muestra no lo fue. (A) Tejido NEC teñido con el anticuerpo isocontrol para H3cit (rojo) y MPO (verde). Esta muestra se procesó más rápido sin secarse. Por lo tanto, no se aprecian manchas de fondo excesivas. Las estructuras verde y roja son agregados secundarios de anticuerpos. (B) Tejido de la espondilodiscitis teñido con el anticuerpo isocontrol para NE (magenta). Aquí, la desparafinación fue exitosa, por lo que no se pueden ver restos de parafina. (C) Tejido de NEC teñido con el anticuerpo isocontrol para H3cit (rojo) y MPO (verde). A pesar de que se utilizaron los mismos anticuerpos secundarios almacenados incorrectamente, no se esperaría tinción para esta imagen de isocontrol. Por lo tanto, esta imagen no se puede utilizar para evaluar el enlace específico de la imagen correspondiente. (D) Piel humana quemada teñida con el anticuerpo isocontrol para H3cit (rojo) y MPO (verde). Aquí, el montaje se realizó con más cuidado y no se puede ver la luz que se dispersa a través de las burbujas de aire. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen nada que revelar.