Method Article

Desarrollo de un sistema de ensayo de alimentación para evaluar el efecto insecticida de los fitoquímicos en Helicoverpa armigera

DOI:

10.3791/65278

⸱

May 26th, 2023

 ,  ,  , 
1Biochemical Sciences Division, CSIR-National Chemical Laboratory, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe el ensayo de alimentación obligada para evaluar el efecto potencialmente tóxico de un fitoquímico en las larvas de insectos lepidópteros. Este es un bioensayo de insectos altamente escalable, fácil de optimizar la dosis subletal y letal, la actividad disuasoria y el efecto fisiológico. Esto podría usarse para detectar insecticidas ecológicos.

Abstract

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Helicoverpa armigera, un insecto lepidóptero, es una plaga polífaga con una distribución mundial. Este insecto herbívoro es una amenaza para las plantas y la productividad agrícola. En respuesta, las plantas producen varios fitoquímicos que afectan negativamente el crecimiento y la supervivencia del insecto. Este protocolo demuestra un método de ensayo de alimentación obligado para evaluar el efecto de un fitoquímico (quercetina) en el crecimiento, desarrollo y supervivencia de los insectos. En condiciones controladas, los neonatos se mantuvieron hasta el segundo estadio con una dieta artificial predefinida. A estas larvas de segundo estadio se les permitió alimentarse con una dieta artificial de control y que contenía quercetina durante 10 días. El peso corporal, la etapa de desarrollo, el peso de los excrementos y la mortalidad de los insectos se registraron en días alternos. El cambio en el peso corporal, la diferencia en el patrón de alimentación y los fenotipos de desarrollo se evaluaron a lo largo del tiempo de ensayo. El ensayo de alimentación obligatoria descrito simula un modo natural de ingestión y puede ampliarse a un gran número de insectos. Permite analizar el efecto de los fitoquímicos en la dinámica de crecimiento, la transición del desarrollo y la aptitud general de H. armigera. Además, esta configuración también se puede utilizar para evaluar alteraciones en los parámetros nutricionales y los procesos de fisiología digestiva. Este artículo proporciona una metodología detallada para los sistemas de ensayo de alimentación, que puede tener aplicaciones en estudios toxicológicos, detección de moléculas insecticidas y comprensión de los efectos químicos en las interacciones planta-insecto.

Introduction

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Los factores bióticos que afectan la productividad de los cultivos son principalmente agentes patógenos y plagas. Varias plagas de insectos causan entre el 15% y el 35% de la pérdida de cultivos agrícolas y afectan las prácticas de sostenibilidad económica1. Los insectos pertenecientes a los órdenes Coleoptera, Hemiptera y Lepidoptera son los principales órdenes de plagas devastadoras. La naturaleza altamente adaptativa del medio ambiente ha beneficiado a los lepidópteros en la evolución de varios mecanismos de supervivencia. Entre los insectos lepidópteros, Helicoverpa armigera (gusano del algodón) puede alimentarse de alrededor de 180 cultivos diferentes y causar daños significativos a sus tejidos reproductivos2. A nivel mundial, la infestación por H. armigera ha provocado una pérdida de alrededor de5 mil millones de dólares. El algodón, los garbanzos, los gandules, los tomates, los girasoles y otros cultivos son huéspedes de H. armigera. Completa su ciclo de vida en diferentes partes de las plantas hospederas. Los huevos puestos por las polillas hembra eclosionan en las hojas, seguidos de su alimentación de tejidos vegetativos durante las etapas larvarias. La etapa larvaria es la más destructiva debido a su naturaleza voraz y altamente adaptable 4,5. H. armigera muestra una distribución global e invasión a nuevos territorios debido a sus notables atributos, como polifagia, excelentes capacidades migratorias, mayor fecundidad, fuerte diapausa y la aparición de resistencia a las estrategias de control de insectos existentes6.

Diversas moléculas químicas de terpenos, flavonoides, alcaloides, polifenoles, glucósidos cianogénicos y muchos otros son ampliamente utilizadas para el control de la infestación por H. armigera 7. Sin embargo, la aplicación frecuente de moléculas químicas tiene efectos adversos en el medio ambiente y la salud humana debido a la adquisición de sus residuos. Además, muestran un efecto perjudicial sobre varios depredadores de plagas, lo que resulta en un desequilibrio ecológico 8,9. Por lo tanto, existe la necesidad de investigar opciones seguras y ecológicas para las moléculas químicas de control de plagas.

Las moléculas insecticidas naturales producidas por las plantas (fitoquímicos) pueden utilizarse como una alternativa prometedora a los pesticidas químicos. Estos fitoquímicos incluyen varios metabolitos secundarios pertenecientes a las clases alcaloides, terpenoides y fenólicos 7,10. La quercetina es uno de los flavonoides (compuestos fenólicos) más abundantes presentes en diversos granos, verduras, frutas y hojas. Muestra actividad disuasoria de alimentación e insecticida contra insectos; Además, no es perjudicial para los enemigos naturales de las plagas11,12. Por lo tanto, este protocolo demuestra el ensayo de alimentación utilizando quercetina para evaluar su efecto tóxico sobre H. armigera.

Se han desarrollado varios métodos de bioensayo para evaluar el efecto de las moléculas naturales y sintéticas en los patrones de alimentación, crecimiento, desarrollo y comportamiento de un insecto13. Los métodos comúnmente utilizados incluyen el ensayo de disco foliar, el ensayo de alimentación de elección, el ensayo de alimentación por gotas, el ensayo de contacto, el ensayo de cobertura de la dieta y el ensayo de alimentación obligada13,14. Estos métodos se clasifican en función de cómo se aplican los pesticidas a los insectos. El ensayo de alimentación obligatoria es uno de los métodos más utilizados, sensibles, sencillos y adaptables para analizar los probables insecticidas y su dosis letal14. En un ensayo de alimentación obligada, la molécula de interés se mezcla con una dieta artificial. Esto proporciona consistencia y control sobre la composición de la dieta, generando resultados robustos y reproducibles. Las variables importantes que afectan a los ensayos de alimentación son la etapa de desarrollo del insecto, la elección del insecticida, los factores ambientales y el tamaño de la muestra. La duración del ensayo, el intervalo entre dos registros de datos, la frecuencia y la cantidad de dieta administrada, la salud de los insectos y la habilidad de manejo de los operadores también pueden influir en el resultado de los ensayos de alimentación14,15.

Este estudio tiene como objetivo demostrar el ensayo de alimentación obligada para evaluar el efecto de la quercetina sobre la supervivencia y aptitud física de H. armigera . La evaluación de varios parámetros, como el peso corporal de los insectos, la tasa de mortalidad y los defectos de desarrollo, proporcionará información sobre los efectos insecticidas de la quercetina. Mientras tanto, la medición de los parámetros nutricionales, incluida la eficiencia de conversión de los alimentos ingeridos (ECI), la eficiencia de conversión de los alimentos digeridos (ECD) y la digestibilidad aproximada (AD), destacará los atributos antialimentarios de la quercetina.

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Protocol

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Las larvas de H. armigera fueron adquiridas en la Oficina Nacional de Recursos de Insectos Agrícolas (NBAIR, por sus siglas en inglés) del ICAR, Bangalore, India. Para el presente estudio se utilizaron un total de 21 larvas de segundo estadio.

1. Preparación de dieta artificial a base de garbanzos

NOTA: En la Tabla 1 se menciona una lista de los ingredientes necesarios para preparar una dieta artificial.

  1. Pesar todas las fracciones por separado en un vaso de precipitados, como se indica en la Tabla 1, y preparar una mezcla homogénea con una espátula/agitador magnético.
  2. Hervir la fracción C a unos 100 °C en el microondas durante 5 min, añadir a la fracción A y mezclar bien.
  3. Después de mezclar bien, deje que la fracción mezclada se enfríe un poco antes de agregar la fracción B (la fracción B contiene componentes termolábiles).
  4. Vierta en una placa de Petri de poliestireno transparente de 150 mm x 150 mm.

2. Preparación de una dieta artificial que contenga quercetina

  1. Pesar la cantidad adecuada (1.000 ppm) de hidrato de quercetina (ver Tabla de materiales) y disolverla adecuadamente en el volumen mínimo de disolventes orgánicos, como etanol (2 mg/mL), dimetilsulfóxido (DMSO; 30 mg/mL) o dimetilformamida (DMF). Aquí, el DMSO se utiliza para disolver la quercetina.
  2. Agregue quercetina disuelta a la fracción B, seguida de la adición a la mezcla de fracciones A y C (el volumen de agua reducido de la fracción B es igual al volumen de DMSO agregado).
  3. Agregue un volumen igual de solvente orgánico utilizado para disolver la quercetina en la dieta de control.
    NOTA: La Figura 1 muestra la representación esquemática de la preparación de dietas artificiales y que contienen quercetina.

3. Cría y mantenimiento del cultivo de H. armigera

NOTA: Utilice materiales debidamente limpios y esterilizados para la cría y el mantenimiento de insectos. Manipule los insectos con cuidado siguiendo todas las prácticas operativas estándar relacionadas con la esterilidad y la seguridad 16,17,18.

  1. Mantener los huevos de H. armigera en la cámara de cría (frasco de plástico cubierto con tela de muselina) en condiciones mantenidas, como se describe en el paso 3.3. Luego, transfiera suavemente a los recién salidos con un pincel fino sobre una dieta artificial a base de garbanzos recién preparada.
  2. Use una dieta artificial para criar las larvas y una solución de sacarosa al 20% (p/v) con multivitamínico al 1% (p/v) (ver Tabla de Materiales) para polillas adultas19,20.
    NOTA: Como las larvas de H . armigera en el tercer estadio y más antiguas muestran una tendencia caníbal, es necesario criar cada larva en un vial separado.
  3. Mantener la temperatura a 25 ± 1 °C y la humedad relativa al 70% en la sala de cultivo de insectos, con un fotoperiodo de 16 h luz:8 h oscuro21.
  4. Cría una generación de insectos en el laboratorio para obtener homogeneidad y luego utilícela para el ensayo de alimentación.
  5. Opcionalmente, aumente la temperatura de la sala de cultivo de insectos a 28 °C para acelerar el crecimiento de larvas y pupas22.

4. Configuración para el ensayo de alimentación

  1. Recolectar 21 larvas de segundo estadio para cada serie (control y tratamiento) y mantenerlas alejadas de la dieta, durante aproximadamente 1-3 h.
  2. Corte la dieta de control y la que contiene quercetina en trozos pequeños, registre el peso de la dieta administrada y el cuerpo del insecto, y transfiera cuidadosamente los insectos a viales de cultivo. Permita que los insectos se alimenten de la dieta respectiva.
    NOTA: Esto debe considerarse como el día 0 del ensayo de alimentación.
  3. Registre el peso del cuerpo del insecto, la dieta dada, la dieta no consumida y los excrementos en días alternos (días 2, 4, 6, 8 y 10) hasta el décimo día de ensayo.
  4. Después del día 10, manténgalos alimentándose de su respectiva dieta para observar más cambios morfológicos y de desarrollo.
    NOTA: El desarrollo cambia por medio de: (1) intermediarios larval-pupa, como la mitad posterior del cuerpo de las pupas con parches de cutícula larvaria, una cápsula en la cabeza y patas torácicas; (2) prepupas con el cuerpo completamente ennegrecido; (3) pupas de tamaño insuficiente con encogimiento del cuerpo; (4) polilla de la pupa polilla intermedia con la piel de la pupa vieja. Los cambios morfológicos incluyen polillas adultas malformadas con cuerpos anormales, alas retorcidas y patas articuladas. Estos cambios se comparan con los insectos alimentados con la dieta de control.
  5. Congelar los insectos el día 10 si no se requiere el estudio de defectos de desarrollo y morfológicos.
    NOTA: Antes de congelar las larvas, deben mantenerse privadas de la dieta durante al menos 3 h para eliminar la dieta residual del tracto digestivo.

5. Registro y análisis de datos

  1. En el software GraphPad Prism (consulte Tabla de materiales), elija una tabla de datos XY del cuadro de diálogo "Bienvenida o Nueva tabla" y, en ella, introduzca el número de insectos que replican los valores uno al lado del otro en las subcolumnas. A continuación, asigne el nombre del título al eje X como número de días y, en los grupos A y B, asigne el nombre del título como control y tratamiento con quercetina, respectivamente. Poner bajo control y tratamiento el peso corporal de cada insecto para generar la gráfica de peso corporal.
    NOTA: El análisis en GraphPad puede variar según el tamaño de la muestra y el número de tratamientos.
  2. Compare el peso corporal del insecto entre los grupos de control y tratamiento mediante una prueba t de Student (α = 0,05).
  3. Cuente las larvas y pupas vivas y muertas en el día 10 para trazar una curva de Kaplan-Meier para el porcentaje de supervivencia utilizando el software de gráficos.
  4. Cuente el número de pupas y calcule el porcentaje de pupas usando la fórmula dada:
  5. Porcentaje de pupación (%) = (número de pupas formadas/número total de larvas) x 100
  6. Compare el desarrollo larvario en términos de índices nutricionales23 utilizando las siguientes fórmulas, ECI (%) = (ganancia de peso de las larvas/peso del alimento consumido) x 100
    ECD (%) = (aumento de peso de las larvas/[peso del alimento consumido - peso de los excrementos]) x 100
    AD (%) = ([peso del alimento consumido - peso de los excrementos]/peso del alimento consumido) x 100

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Results

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Las larvas de insectos alimentadas con una dieta que contenía 1.000 ppm de quercetina mostraron una disminución significativa en el peso corporal de ~57% en comparación con el grupo de control (Figura 2A). La reducción del peso corporal dio lugar a una reducción del tamaño corporal de las larvas tratadas con quercetina (Figura 2B). Se observó una reducción notable en la tasa de alimentación de las larvas alimentadas con quercetina en comparación con el control (...

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Discussion

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Los bioensayos de laboratorio son útiles para predecir los resultados y producir datos comparativos de toxicidad de varios compuestos en un corto período de tiempo a un costo razonable. El bioensayo de alimentación ayuda a interpretar las interacciones entre insectos-insecticidas e insectos-plantas-insecticidas. Es un método eficiente para medir la toxicidad de una variedad de sustancias que simplifica significativamente el proceso de establecer la dosis letal 50 (DL50), la concentración letal 50 (LC50

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Disclosures

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Los autores declararon no tener conflicto de intereses.

Acknowledgements

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SM, YP y VN reconocen la beca otorgada por la Comisión de Becas Universitarias del Gobierno de la India, Nueva Delhi. RJ agradece al Consejo de Investigación Científica e Industrial (CSIR) de la India y al Laboratorio Químico Nacional del CSIR, Pune (India), por su apoyo financiero en virtud de los códigos de proyecto MLP036626, MLP101526 y YSA000826.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agar AgarHimediaRM666Agente solidificante
Ácido ascórbicoHimediaCMS1014 Fuente de vitamina C
Bengala GramNANA Fuenteproteínas y carbohidratos
CaseínaSigmaC-5890 Fuente deproteínas
ColesterolSisco Research Laboratories34811Fuente
Cloruro de colinaHimediaGRM6824Sal de amonio
DMSOSigma67-68-5Disolvente
GraphPad Prisma v8.0
https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm MetilparabenoHimediaGRM1291Agente antifúngico
Cápsula multivitamínicaGalaxoSmithKlineNAFuente vitamínica
QuercetinaSigmaQ4951-10GFitoquímico
Ácido Sórbico HimediaM1880Agente antimicrobio
EstreptomicinaHimediaCMS220
Antibiótico Cápsula de vitamina ENukind HealthcareNAFuente de vitamina E
Extracto de levaduraHimediaRM027Fuente de aminoácidos
de de ácidos grasos

References

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