Aquí, describimos en detalle el protocolo para cuantificar la longitud de los telómeros utilizando la detección quimioluminiscente no radiactiva, con un enfoque en la optimización de varios parámetros de rendimiento del kit de ensayo de longitud de telómeros TAGGG, como cantidades de tampón y concentraciones de sonda.
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Artículo de método
Optimización de los parámetros de rendimiento del ensayo de longitud de telómeros TAGGG
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Resumen
Resumen
Los telómeros son secuencias repetitivas que están presentes en los extremos cromosómicos; Su acortamiento es un rasgo característico de las células somáticas humanas. El acortamiento se produce debido a un problema con la replicación final y la ausencia de la enzima telomerasa, que es responsable de mantener la longitud de los telómeros. Curiosamente, los telómeros también se acortan en respuesta a diversos procesos fisiológicos internos, como el estrés oxidativo y la inflamación, que pueden verse afectados debido a agentes extracelulares como contaminantes, agentes infecciosos, nutrientes o radiación. Por lo tanto, la longitud de los telómeros sirve como un excelente biomarcador del envejecimiento y varios parámetros fisiológicos de salud. El kit de ensayo de longitud de telómeros TAGGG se utiliza para cuantificar longitudes promedio de telómeros utilizando el ensayo de fragmento de restricción de telómeros (TRF) y es altamente reproducible. Sin embargo, es un método costoso, y debido a esto, no se emplea rutinariamente para grandes números de muestra. Aquí, describimos un protocolo detallado para una medición optimizada y rentable de la longitud de los telómeros utilizando Southern blots o análisis TRF y detección basada en quimioluminiscencia no radiactiva.
Introducción
Los telómeros son las secuencias repetitivas de ADN presentes al final de los cromosomas. Tienen repeticiones en tándem de TTAGGG y mantienen la integridad del genoma protegiendo el cromosoma tanto del deshilachado como del problema de replicación final, lo que significa que parte del voladizo 3' no puede ser replicado por la ADN polimerasa 1,2. Los telómeros cortos conducen a anomalías cromosómicas en las células, debido a lo cual las células se detienen permanentemente en una etapa llamada senescencia replicativa3. Los telómeros cortos también causan una serie de otros problemas, como....
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Protocolo
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los reactivos utilizados en el protocolo a continuación. La Tabla 1 incluye reactivos hechos en laboratorio junto con volúmenes optimizados y la Tabla 2 muestra concentraciones de trabajo de reactivos disponibles comercialmente.
1. Cultivo celular
- Mantener las células cuya longitud de telómero se debe medir (aquí se usaron células A2780, que es una línea celular de adenocarcinoma de ovario) en el medio completo de águila modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero bovino fetal ....
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Resultados
El ADN genómico extraído (ADNg), que se ejecutó con un gel de agarosa al 1%, mostró una buena integridad, como se muestra en la Figura 1B, lo que indica que la muestra podría usarse para el procesamiento posterior de TRF. El ensayo TRF se llevó a cabo modificando los volúmenes de soluciones requeridas en cada paso (ver Tabla 1 y Tabla 2). La señal TRF era claramente visible (Figura 3). Por lo tanto, al modificar los volúmenes y .......
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Discusión
Describimos un procedimiento detallado para un método no radiactivo basado en la quimioluminiscencia para la medición de la longitud de los telómeros mediante Southern blotting. El protocolo ha sido probado para permitir el uso juicioso de varios reactivos sin comprometer la calidad de los resultados. El tampón de prehibridación e hibridación se puede reutilizar hasta cinco veces. La concentración de enzimas puede variar entre 10-20 U por 1,5-2 μg de ADN genómico sin afectar los resultados. Varios otros componentes del k.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a la Sra. Prachi Shah por ayudarnos inicialmente con la optimización del protocolo. Nos gustaría agradecer al Dr. Manoj Garg por proporcionar la línea celular de cáncer de ovario A2780. EK cuenta con el apoyo de una subvención de investigación del Departamento de Biotecnología (No. BT / RLF / Reingreso / 06/2015), el Departamento de Ciencia y Tecnología (ECR / 2018 / 002117) y la Subvención Semilla NMIMS (IO 401405).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cell Line | |||
| A2780 (Línea celular de adenocarcinoma de ovario) | Recibido como regalo | ||
| Equipment | |||
| ChemiDoc XRS+ (para imágenes y reticulación UV) | Biorad | Universal hood II (721BR14277) | |
| Nanodrop (Epoch 2) | Biotek | EPOCH2 | |
| Software | |||
| TeloTool | versión 1.3 | ||
| Materiales | |||
| Ácido acético | Molychem | 64-19-7 | |
| Agarosa | MP | 180720 | |
| Anfotericina B | Gibco, ThermoFisher Scientific, EE. UU. | ||
| DMEM | HyClone, Cytiva, EE. UU | SH30243.01 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético | Molychem | 6381-92-6 | |
| HI FBS | Gibco, ThermoFisher Scientific, EE. UU. | 10270106 | |
| HCl | Molychem | 76-47-01-0 | |
| NaCl | Molychem | 7647-14-5 | |
| NaOH | Molychem | 1310-73-2 | |
| Membrana de nailon | Sigma | 11209299001 | |
| Penicilina | Gibco, ThermoFisher Scientific, EE. UU. | 15240062 | |
| Dodecil sulfato de sodio | Affymetrix | 151-21-3 | |
| Estreptomicina | Gibco, ThermoFisher Scientific, EE. UU | . 15240062 | |
| Tris | BIORAD | 77-86-1 | |
| Tris HCl | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | |
| Papel Whatman | GE Healthcare lifesciences | 1001-917 | |
| Reactivos | |||
| kb escalera | NEB | N3232S | |
| 20x SSC | Invitrogen | 15557-036 | |
| Anti DIG AP | Telo TAGGG Kit de ensayo de longitud de telómeros | 12209136001 | |
| solución de bloqueo 10x | Telo TAGGG Kit de ensayo de longitud de telómeros | 12209136001 | |
| Cutsmart Buffer | NEB | B6004 | |
| Tampón de detección 10x | Telo TAGGG Kit de ensayo de longitud de telómeros | 12209136001 | |
| Dig easy hyb | Telo TAGGG Kit de ensayo de longitud de telómeros | 12209136001 | |
| Tampón de digestión | Telo TAGGG Kit de ensayo de longitud de telómeros | 12209136001 | |
| Hinf 1 | Telo TAGGG Kit de ensayo de longitud de telómeros | 12209136001 | |
| Hinf 1 (alternativa al kit) | NEB | R0155T | |
| Colorante de carga | BIOLABS | N3231S | |
| ácido maleico 10x | Telo TAGGG Kit de ensayo de longitud de telómeros | 12209136001 | |
| Marcador molecular | Telo TAGGG Kit de ensayo de longitud de telómeros | 12209136001 | |
| Sonda | Telo TAGGG Kit de ensayo de longitud de telómeros 12209136001 | ||
| Rsa 1 | Telo TAGGG Kit de ensayo de longitud de telómeros | 12209136001 | |
| Rsa 1 (alternativa al kit) | NEB | R0167L | |
| Substrate | Telo TAGGG Kit de ensayo de longitud de telómeros | 12209136001 | |
| tampón de lavado | Telo TAGGG Kit de ensayo de longitud de telómeros 12209136001 |
Referencias
- Greider, C. W. Telomere length regulation. Annual Review of Biochemistry. 65, 337-365 (1996).
- Valdes, A. M., et al. Obesity, cigarette smoking, and telomere length in women. Lancet. 366 (9486), 662-664 (2005).
- Allsopp, R. C., et al.
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Reimpresiones y permisos
