Optimización del procedimiento de cría de avispas libres de gérmenes

Resumen

Los embriones de avispa Nasonia se diseccionaron de pupas de Lucillia sericata después de la parasitación durante 12-24 h y se lavaron con alcohol y solución de hipoclorito de sodio al 10% para obtener embriones libres de gérmenes. Después de criar los embriones libres de gérmenes y suministrarles el medio de cría Nasonia para crecer y desarrollarse in vitro, se obtuvieron adultos de Nasonia libres de gérmenes.

Resumen

La tecnología de cría aséptica es un método de cultivo de insectos en condiciones estériles o casi estériles, que puede eliminar eficazmente la influencia de microorganismos externos en la microbiota de los insectos y, por lo tanto, promover el rápido desarrollo de la investigación de la microbiota de los insectos. Nasonia (género de avispas) es un insecto avispa parásito que tiene muchas ventajas, como una vida útil corta, alta variación genética, fácil operación, etc., y es ampliamente utilizado como un sistema modelo de insectos. A diferencia del tratamiento antibiótico, que solo puede reducir el número de microorganismos en animales, las técnicas de cría aséptica pueden controlar tanto la composición como la cantidad de microorganismos en animales, facilitando aún más el estudio de las interacciones huésped-microbio. Sin embargo, las versiones anteriores del medio de cría Nasonia (NRM) tienen algunos defectos y problemas, como un proceso de preparación complejo y lento, fácil contaminación por bacterias u hongos y corto tiempo de almacenamiento. Por lo tanto, este estudio resuelve estos problemas optimizando las herramientas utilizadas en el proceso de preparación de MRN, las condiciones de almacenamiento y las proporciones de componentes. El medio optimizado podría permitir el almacenamiento a -20 °C durante al menos 3 meses y eliminar la posibilidad de contaminación por MRN durante la alimentación de avispas estériles. Esto mejora aún más la tasa de supervivencia y el nivel de salud de la Nasonia aséptica, que es importante para usar Nasonia como modelo para la investigación microbiana.

Introducción

Los animales libres de gérmenes son animales que no tienen microorganismos vivos detectables ni parásitos¹. Los embriones libres de gérmenes pueden obtenerse diseccionando a la madre en condiciones asépticas y posteriormente criados en sistemas de barrera². Estos animales pueden utilizarse para estudiar los efectos de los microorganismos en los animales, como la microbiota intestinal, el sistema inmunitario y el metabolismo¹. Con ciertos medios técnicos, muchos insectos e incluso mamíferos pueden volverse estériles ^3,4. Los animales libres de gérmenes tienen un papel único y han sido ampliamente utilizados en diversos aspectos de la investigación microbiológica⁵. Por ejemplo, el uso de avispas Nasonia libres de gérmenes ha revelado que los microorganismos pueden ayudar a los huéspedes a adaptarse a nuevos ambientes bajo estrés ambiental exógeno a largo plazo ^6,7.

Los parasitoides de Nasonia son pequeñas avispas parásitas que inyectan sus huevos en las pupas de las moscas⁴. Hay cuatro especies conocidas de Nasonia, incluyendo Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti y Nasonia oneida⁸. N. vitripennis se puede encontrar en todo el mundo, mientras que las otras tres especies tienen rangos limitados en América del Norte⁴. Las avispas parasitoides Nasonia son consideradas como insectos modelo ideales debido a sus características, como fácil cultivo, ciclo de reproducción corto, genoma secuenciado y diapausa a largo plazo ^8,9. Se pueden utilizar para estudiar diversos aspectos de la evolución, la genética, el desarrollo, el comportamiento y la simbiosis de los insectos¹⁰. Además, las avispas parasitoides Nasonia también pueden ayudar a controlar las moscas dañinas en la agricultura y las enfermedades¹¹. El establecimiento exitoso de un sistema de insectos estériles implica dos pasos principales: (1) esterilización de los embriones y (2) provisión de alimentos estériles a las larvas in vitro. Para obtener alimentos estériles, Brucker y Bordenstein 12 desarrollaron el medio de cría Nasonia (NRMv1) en 2012 mediante el uso de productos químicos como antibióticos, lejía y suero bovino fetal para matar bacterias¹². Sin embargo, el método de esterilización química resultó en bajas tasas de supervivencia y eclosión de N. vitripennis¹³. Luego, en 2016, Shropshire et al. desarrollaron NRMv2 utilizando un método de esterilización por filtro en lugar de un método de esterilización química para eliminar los peligros de los antibióticos y otras sustancias, y optimizaron el proceso de reproducción¹³. Desafortunadamente, este método todavía tiene algunas desventajas, como los desafíos asociados con la preparación y el uso del medio, así como los riesgos de ahogamiento, subalimentación o deshidratación para los embriones, larvas y pupas cerradas¹⁴. Wang y Brucker¹⁴ mejoraron recientemente los protocolos de medios de cría Nasonia versión 3 (NRMv3) y la versión 2 de cría libre de gérmenes (GFRv2). Estas mejoras redujeron el costo y el consumo de medios. Sin embargo, el NRMv3 tiene un tiempo de almacenamiento muy corto y es altamente susceptible a la contaminación.

Sobre la base de NRMv3, el método de almacenamiento de la herramienta de preparación de NRM y la proporción de nutrientes se optimizaron en este estudio. Este refinamiento metodológico facilita el uso de N. vitripennis como modelo para estudios de microbiomas. En comparación con el NRMv3 desarrollado por Wang et al.14, la herramienta mejorada para exprimir la pupa Sarcophaga bullata, una de las materias primas del MRN, mejora en gran medida la eficiencia de producción del fluido tisular de S. bullata pupa en comparación con la jeringa de 60 ml con un orificio inferior utilizada por Wang et ^al.14. Ajustamos la proporción de nutrientes de NRM, lo que condujo a un cierto aumento en la tasa de supervivencia de las avispas Nasonia libres de gérmenes sin afectar su tiempo de desarrollo. Además, el NRM se envasó en tubos de centrífuga de pequeña capacidad (1,5 ml) y se congeló en un refrigerador de -20 ° C para extender el tiempo de almacenamiento. Vale la pena señalar que, si bien utilizamos la mosca doméstica Lucilia sericata como huésped y fuente para la preparación de MRN, este protocolo probablemente se puede adaptar para otros huéspedes de Nasonia que están disponibles en el laboratorio.

Protocolo

1. Preparación de medio de cría deNasonia libre de gérmenes 

1. Coloque las pupas de L. sericata disponibles comercialmente (consulte la Tabla de materiales) en una superficie que pueda acomodar todas las pupas, como una bandeja o una hoja de papel. Deseche cualquier larva subdesarrollada, pupas viejas oscuras, conchas de pupa vacías, aserrín u otras impurezas. Mantenga solo pupas jóvenes que sean de color rojo parduzco y transfiéralas a un vaso de precipitados (aproximadamente 3,000-4,000 pupas).
   NOTA: Después de realizar muchos experimentos, se descubrió que el medio hecho de las pupas viejas oscuras se oscurecía fácilmente y detenía el desarrollo de avispas libres de gérmenes. Este fenómeno no ocurrió cuando se usaron las pupas jóvenes de color marrón rojizo para producir medio. La razón de esto aún no está clara y requiere más investigación para verificarlo.
2. Agregue suficiente agua desionizada al vaso de precipitados para cubrir toda la superficie de las pupas. Envuelva la boca del vaso de precipitados con papel de aluminio o gasa, agite el vaso de precipitados para limpiar las impurezas en la superficie de las pupas y luego vierta el agua. Repita de tres a cinco veces.
3. Coloque las pupas limpias de L. sericata en el tanque de filtro de una prensa de ajo, apriete con fuerza y recoja el líquido tisular de las pupas de L. sericata en un tubo de centrífuga estéril de 50 ml . Luego, vierta las heces de pupa y ponga pupas nuevas en el tanque de filtro de la prensa de ajo hasta que todas estén exprimidas.
   NOTA: En comparación con el dispositivo de extrusión de agujas utilizado por Wang et ^al.14, la prensa de ajo es más conveniente y puede separar el líquido intersticial más a fondo. Este avance sienta las bases para la producción a gran escala y el almacenamiento a largo plazo de NRM.
4. Centrifugar la mezcla a 4 °C (25.000 x g) durante 10 min. Después de la centrifugación, la mezcla se separará en tres capas de abajo hacia arriba: capa de sedimento, capa de proteína y capa de grasa (Figura 1).
5. Para evitar obstrucciones durante la filtración, aspire la capa de proteína con una aguja estéril de 18 G y transfiérala a un nuevo tubo centrífugo de polipropileno estéril cónico de 50 ml.
6. Agregue el medio líquido comercial de Drosophila (consulte la Tabla de materiales) al extracto de proteína en una proporción de 1: 1.
   NOTA: Se utilizó L. sericata comercializada más conveniente como materia prima huésped y NRM, en comparación con NRMv3. Por lo tanto, la relación nutricional se ajustó de 1:2 a 1:1 en base a NRMv3, que fue más adecuada para el crecimiento y desarrollo de Nasonia estéril (Figura 2).
7. Filtrar el medio mixto (medio de Drosophila y extracto proteico de L. sericata pupa) utilizando un sistema de filtración al vacío con diferentes tamaños de poro (8, 1.2, 0.8 y 0.45 μm; ver Tabla de materiales) para eliminar partículas de diferentes tamaños. Para evitar obstrucciones, cambie el papel de filtro cuando el flujo disminuya.
   NOTA: Se requiere el uso de un nuevo tubo centrífugo estéril de 50 ml para cada filtración.
8. Centrifugar de nuevo el líquido a 4 °C (15.000 x g) durante 10 min y esterilizar el medio sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm. Repita los pasos anteriores una vez.
9. Conservar el medio de cultivo a -20 °C después de la alícuota (figura 3A) para su almacenamiento a largo plazo.
   NOTA: Para evitar la contaminación y la congelación y descongelación repetidas, se recomienda abrir cada tubo de MRN solo una vez cuando se use el medio de cultivo después del envasado (Figura 3A).

2. Recolección de huevos libres de gérmenes

1. Para asegurar una proporción estable macho-hembra en la descendencia, coloque las pupas en un vial de Drosophila durante la etapa pupal en una proporción de 50 hembras a 15 machos debido a sus características genéticas haploides (los machos se desarrollan a partir de células haploides, mientras que las hembras se desarrollan a partir de células diploides que resultan de huevos fertilizados)^4,15.
   1. Después de emerger a adultos, permita que los machos y las hembras se apareen durante 1,5 días, y luego ponga aproximadamente 40 pupas de L. sericata en el vial. Dentro de las 12-24 h después de la parasitación, use una aguja de disección estéril para abrir cuidadosamente un extremo de la cáscara de la pupa bajo un microscopio estereoscópico (Figura 4).
   2. Sostenga el otro extremo con la mano y encuentre los embriones de avispa. Utilice una aguja de disección para transferir embriones de la superficie del tejido de L. sericata pupa a un colador de células estéril con solución salina tamponada con fosfato (PBS)¹⁴.
      NOTA: Las pupas más viejas de L. sericata deben usarse para el parasitismo porque el tejido seco de L. sericata pupa es más fácil de transferir embriones . Para garantizar la transferencia suave de los huevos desde la superficie del tejido de L. sericata pupa, trate de tener cuidado de no perforar el tejido cuando la aguja de disección abra la caja de la pupa para que el líquido intersticial no fluya.
2. Coloque 20-30 embriones en un filtro celular y lávelos uniformemente con 1,000 μL de solución comercial de hipoclorito de sodio al 10% (consulte la Tabla de materiales), seguido de otro lavado con 1,000 μL de PBS estéril 1x. Luego, lavar una vez con 1,000 μL de solución de etanol al 70% y lavar tres veces con 1,000 μL de 1x PBS estéril.
3. Primero, coloque una lámina de malla de polipropileno de 5 mm de diámetro (consulte la Tabla de materiales) que haya sido prehumedecida con 1x PBS en una placa de 24 pocillos. Luego, usando un cepillo pequeño esterilizado, cepille suavemente los embriones de avispa en el colador celular sobre la lámina de malla de polipropileno. Esto se puede hacer para los cuatro pozos en una columna vertical de la placa de 24 pocillos.

3. Cría de avispas libres de gérmenes

1. Agregue 50 μL de NRM a cada pocillo en una campana de flujo laminar. Para mantener un ambiente húmedo para el crecimiento, agregue 1 ml de agua estéril entre cada pozo en la placa de 24 pocillos. También se puede colocar un vaso pequeño que contiene 30 ml de agua estéril en la caja de plástico estéril de 5 L con la placa de 24 pocillos.
   1. Durante todo el experimento, mantenga la caja de plástico estéril y la placa de 24 pocillos en una cámara climática a una temperatura constante de 25 ± 2 °C y bajo luz constante.
2. Antes de transferir y agregar NRM todos los días, descongele el NRM congelado en un banco de flujo laminar. En un ambiente estéril, use pinzas desinfectadas con alcohol para transferir la malla de polipropileno con larvas de un pozo a otro. Por último, agregue 50 μL de MRN que se haya equilibrado a temperatura ambiente (Figura 3B). Repita las operaciones anteriores todos los días hasta que se observen las pupas.
   NOTA: Con el desarrollo de avispas, la cantidad de MRN debe aumentarse adecuadamente para garantizar que las avispas libres de gérmenes tengan suficiente nutrición. Por ejemplo, las larvas del cuarto estadio recibieron de 60 a 70 μL de NRM. Dado que diferentes etapas de desarrollo pueden coexistir en el mismo pozo, use un cepillo esterilizado para transferir las pupas. Agregue una pequeña cantidad de MRN a las larvas restantes. Utilizar técnicas asépticas para evitar la invasión microbiana y la contaminación.
3. Después de alimentarse durante 9 a 11 días, más del 80% de las larvas se convierten en pupas blancas o amarillas. En este momento, mueva el filtro a una placa de pozo limpio y deje de agregar medio de cultivo para esperar la eclosión.

Resultados

La eficiencia de preparación de NRM se mejoró enormemente al mejorar las herramientas de preparación. Además, se eliminó el problema de la contaminación por MRN en el proceso de alimentación optimizando la estrategia y el método de preservación. Al mismo tiempo, el MRN ajustado tenía una proporción nutricional más adecuada para el crecimiento y desarrollo de avispas libres de gérmenes con L. sericata como huéspedes. La tasa de supervivencia de las avispas libres de gérmenes desde larvas hasta pupas mejoró signif...

Discusión

Con la aplicación de tecnologías de detección de alto rendimiento como la genómica y la metabolómica, los investigadores se han dado cuenta gradualmente de que existe una enorme diversidad genética y complejidad metabólica en la microbiota intestinal¹⁶. Estas bacterias simbióticas están estrechamente relacionadas con diversos estados fisiológicos o patológicos, como el metabolismo nutricional del huésped, los tumores, la inmunidad y el envejecimiento a través de interacciones complejas con el hués...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.22 Filtro de vacío estéril	NEST	331011
10% SodioHipoclorito	LIRCON	XB-84BS-1
1x solución PBS	Solarbio	P1020
200 malla red de nylon	BIOBYING	BY-378Z
24 placa de pocillo	NEST	702001
8, 1.2, 0.8 y 0.45 µ	Filtros M Shanghái Xingya Fábrica de material de purificación	HN-AA-JT-10079
Alcohol etílico absoluto	Macklin	E809057-500ml
Colador de células	BIOLOGIX	15-1100
Comercial Drosophila Medio Boer		B645446-500ml
Aguja de disección	Bioroyee	17-9140
Prensa	de ajoTaobao	No hay números de catálogo	Comprar en Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No hay números de catálogo	Comprar en Taobao
Pincel de escritura pequeño	Cestidur	BL0508
Estereoscopio	SOPTOP	RX50
Pinzas	SALMART	A109001-56