Aquí se presenta un método para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos del cerebro de ratas vivas en detalle experimental. Permite múltiples colecciones de estas células de los mismos animales sin comprometer su bienestar.
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Artículo de método
El método de "ordeño cerebral" para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos de ratas vivas
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células madre neurales (NSC) específicas de tejido permanecen activas en el cerebro postnatal de los mamíferos. Residen en nichos especializados, donde generan nuevas neuronas y glía. Uno de estos nichos es la zona subependimaria (ZEE; también llamada zona ventricular-subventricular), que se encuentra a lo largo de las paredes laterales de los ventrículos laterales, adyacente a la capa de células ependimarias. Las células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) están abundantemente distribuidas por todo el sistema nervioso central, constituyendo un conjunto de células progenitoras proliferativas que pueden generar oligodendrocitos.
Tanto los NSC como los OPC exhiben potencial de autorrenovación y ciclos de inactividad/activación. Debido a su localización, el aislamiento y la investigación experimental de estas células se realiza post mortem. Aquí, describimos en detalle el "ordeño cerebral", un método para el aislamiento de NSCs y OPCs, entre otras células, de animales vivos. Este es un protocolo de dos pasos diseñado para su uso en roedores y probado en ratas. En primer lugar, las células se "liberan" del tejido a través de una inyección estereotáxica intracerebroventricular (i.c.v.) de un "cóctel de liberación". Los componentes principales son la neuraminidasa, que se dirige a las células ependimarias e induce la denudación de la pared ventricular, un anticuerpo bloqueante de la integrina-β1, y el factor de crecimiento de fibroblastos-2. En una segunda etapa de "recolección", se realizan biopsias líquidas de líquido cefalorraquídeo de la cisterna magna, en ratas anestesiadas sin necesidad de incisión.
Los resultados presentados aquí muestran que las células aisladas conservan su perfil endógeno y que las NSC de la ZEE conservan su quiescencia. La denudación de la capa ependimaria se restringe al nivel anatómico de la inyección y el protocolo (liberación y recolección) es bien tolerado por los animales. Este novedoso enfoque allana el camino para realizar estudios longitudinales de neurogénesis endógena y gliogénesis en animales de experimentación.
Introducción
Las células madre específicas de tejido son células parcialmente comprometidas que pueden dar lugar a todas las poblaciones celulares que constituyen los tejidos respectivos. Además de ser multipotentes, son células que se autorrenuevan y son cruciales para mantener la homeostasis y la capacidad regenerativa de los tejidos1. Algunas células madre específicas de tejido permanecen en un estado activo y fuertemente proliferativo, como las células madre intestinales o hematopoyéticas. Otras, como las células madre cerebrales, permanecen en gran medida inactivas o inactivas2. En el cerebro adulto, las células madre neurales (NSC, por sus siglas en inglés) se pueden encontrar en áreas especializadas, a menudo llamadas nichos. Existen dos áreas bien descritas en la zona subependimaria (ZEE) de los ventrículos laterales y en la circunvolución dentada del hipocampo. El nicho de la ZEE genera el mayor número de células, principalmente neuroblastos que migran hacia los bulbos olfatorios y contribuyen a la población local de interneuronas; por el contrario, los oligodendroblastos generados migran al cuerpo calloso adyacente (CC)3. Las células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) son células mitóticamente activas, ampliamente distribuidas por todo el sistema nervioso central, que: i) están comprometidas con el linaje oligodendroglial, ii) pueden migrar a sitios de desmielinización, y iii) pueden diferenciarse en oligodendrocitos mielinizantes. Las OPC también exhiben potencial de autorrenovación y quietud4.
Hasta ahora, el aislamiento y estudio de las NSC y OPC requería la disociación postmortem del tejido cerebral y de la médula espinal disecado. Para sortear esta limitación experimental, establecimos un método que permite, por primera vez, aislar las NSC y OPC cerebrales de animales vivos. Llamamos a este método "ordeño", porque permite múltiples colecciones de células, ya que sus reservas no se agotan. El protocolo se desarrolló en ratas, debido a su gran tamaño cerebral, dirigido principalmente a la ZEE, o CC, e incluye dos pasos principales. En primer lugar, las NSC u OPC se "eliminan" del tejido mediante la inyección intravenosa de un "cóctel de liberación" que contiene neuraminidasa, una toxina que induce la denudación de la pared ventricular, un anticuerpo que bloquea la integrina-β1 y el factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2). El cóctel se inyecta estereotáxicamente bilateralmente dentro de los ventrículos laterales. Si el uso previsto es el aislamiento de las NSC, se dirigen a las áreas rostrales de los ventrículos laterales. Si el objetivo es aislar las OPC de forma más pura, el cóctel se inyecta caudalmente en la zona de la fimbría del hipocampo. En un segundo paso de "recolección", se realizan biopsias líquidas de líquido cefalorraquídeo (LCR) de la cisterna magna de ratas anestesiadas, sin necesidad de incisión. La biopsia líquida se mezcla con un medio de cultivo NSC y se puede mantener a 4 °C hasta la siembra.
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Protocolo
Los procedimientos de cría, mantenimiento y experimentación de animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido de 1986, autorizada por el Ministerio del Interior, y con el Decreto Presidencial 56/2013 de la República Helénica, examinada por los Órganos de Revisión Ética y de Bienestar Animal de las Universidades de Cambridge y Patras, así como aprobada y examinada por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Prefectura local (Número de protocolo: 5675/39/18-01-2021). Se utilizaron ratas macho y hembra Sprague-Dawley, Wistar y Long-Evans, con edades que variaban entre 2 y 4 meses y con pesos corporales entre 150 g y 250 g. El protocolo se resume gráficamente en la Figura 1.
1. Preparación del cóctel de liberación
NOTA: Prepárese fresco el día del procedimiento y manténgalo en hielo. Las cantidades se administran por 2 μL que se inyectan i.c.v. en cada ventrículo lateral. Prepare 1 μl adicional por cada inyección prevista.
- Preparar 0,5 μL de 500 mU de neuraminidasa de Clostridium perfringens (Clostridium welchii).
NOTA: Consérvelo como un caldo de 1 U/μL diluido en agua estéril a -20 °C. No se han probado otros tipos de neuraminidasas. - Prepare 1 μL que contenga 1 μg de anticuerpo bloqueador de integrina-β1.
NOTA: Guárdelo a 4 °C. - Preparar 0,5 μL que contiene 0,5 μg de factor de crecimiento básico de fibroblastos (FGF-básico humano recombinante).
NOTA: Consérvelo en forma de 1 μg/μL diluido en agua estéril a -20 °C.
2. Inyección de cóctel de liberación
NOTA: Todo el proceso se puede realizar en 20 minutos. Tenga cuidado de realizar la cirugía en condiciones asépticas. Limpie todas las superficies con antiséptico (por ejemplo, peróxido de hidrógeno al 3% o al 6%). Use herramientas, guantes, batas y paños esterilizados en autoclave o fácilmente estériles.
- Anestesiar al animal de experimentación por inhalación de isoflurano (2,5% para inducción y 2% para mantenimiento). Confirme la profundidad de la anestesia comprobando el reflejo corneal, la reacción a los estímulos (prueba de pellizco de la extremidad posterior y la cola) y el modo de respiración.
NOTA: Los procedimientos quirúrgicos se pueden realizar bajo anestesia general inducida por anestesia inyectable intraperitoneal (p. ej., ketamina [40 mg/kg] y xilacina [10 mg/kg]). La anestesia profunda se confirmó mediante la comprobación del reflejo corneal, la reacción a los estímulos (prueba de pellizco de la extremidad posterior y la cola) y el modo de respiración. - Administrar analgesia por vía subcutánea (p. ej., 0,3 mg/ml de buprenorfina) tras la inducción de la anestesia.
- Monta la rata en el marco estereotáxico.
- Afeita el pelaje de la cabeza con una navaja de afeitar y limpia la piel con un antiséptico, como una solución de povidona yodada al 10% y luego alcohol. Aplique el antiséptico tres veces con hisopos de algodón estériles. Frote con movimientos circulares durante 3-5 segundos cada vez. Aplique ungüento para los ojos para prevenir la sequedad.
- Haga una incisión de 2 cm en la piel de la cabeza a lo largo de la línea media con un bisturí estéril.
- Limpie meticulosamente el cráneo con hisopos estériles y solución salina estéril.
- Identifique el bregma utilizando el borde de la aguja de una jeringa Hamilton de 10 μL montada en el dispositivo estereotáxico. Establezca el bregma como "punto 0,0".
NOTA: El bregma se identifica como el punto de intersección entre las suturas sagital y coronal. Se pueden encontrar más detalles en el atlas del cerebro de rata de Paxinos y Watson5. - Mueva el dispositivo a las coordenadas anterioposterior (AP) = 0,3 mm, lateral (L) = +1,2 mm (para apuntar a la ZEE) o AP = 1,5 mm, L = +2,0 mm (para apuntar al CC).
- Taladre un orificio de rebaba de 1 mm con un taladro dental.
NOTA: Al perforar a mano, tenga cuidado de no lesionar la superficie cortical. No se espera que la hemorragia sea considerable. Limpie la sangre con solución salina y aplique presión para detener el sangrado más persistente. - Cargue 4 μL del cóctel de liberación en la jeringa Hamilton de 10 μL.
- Baje la aguja (preferiblemente de borde romo o cónico) de la jeringa Hamilton para entrar en contacto con la duramadre.
- Inserte la aguja a la profundidad deseada (D = 3,5 mm).
NOTA: Vierta solución salina en la superficie de la duramadre para mantener el tejido hidratado. - Infundir 2 μL del cóctel de liberación a razón de 1 μL/min.
- Deje la aguja en su lugar durante otros 2 minutos antes de recuperarla lentamente para evitar que salga a la superficie el cóctel de liberación.
- Repita los pasos 2.8-2.14 para el otro hemisferio en las coordenadas AP = 0.3 mm, L = -1.2 mm (para apuntar a la ZEE) o AP = 1.5 mm, L = -2.0 mm (para apuntar al CC).
- Suturar la incisión con nylon 5-0 (diámetro 0,1 mm) y limpiar la zona suturada con un antiséptico.
- Retirar la mascarilla que suministra el anestésico y trasladar al animal al área de monitoreo postoperatorio.
NOTA: La recuperación de la anestesia y el mantenimiento de la decúbito deben ocurrir dentro de los 5-10 minutos, y la recuperación completa (comportamiento normal) dentro de los 25 minutos.- Vigile de cerca la recuperación (movimiento vívido e ininterrumpido, acceso frecuente al agua) en un espacio bien calentado (24-25 °C), tranquilo y sin lecho de partículas pequeñas, que pueden obstruir las vías respiratorias. Devuelva el animal a la compañía de sus compañeros de jaula (no a animales nuevos) solo después de confirmar la recuperación completa.
- Vigilar al animal en el centro de mantenimiento durante al menos 48 h después de la cirugía. Tratar los signos de dolor (ocultamiento de la cabeza, postura anormal de la cabeza o del cuerpo, hipersensibilidad e hiperexcitabilidad a la manipulación) mediante la administración de analgesia (p. ej., 0,3 mg/ml de buprenorfina, por vía subcutánea). Remita a los animales con pelaje descolorido o erizado al veterinario responsable.
3. Biopsia líquida del líquido cefalorraquídeo (LCR)
NOTA: Todo el proceso se puede realizar en 10 minutos. La biopsia líquida descrita aquí se realiza 3 días después de la inyección del cóctel de liberación, pero se puede realizar exactamente de la misma manera siempre que sea necesario. Tenga cuidado de realizar la cirugía en condiciones asépticas. Limpie todas las superficies con un antiséptico (por ejemplo, peróxido de hidrógeno al 3% o al 6%). Use herramientas, guantes, batas y paños esterilizados en autoclave o fácilmente estériles.
- Anestesiar al animal por inhalación de isoflurano (2,5% para inducción y 2% para mantenimiento). Confirme la profundidad de la anestesia revisando la córnea
el reflejo, la reacción a los estímulos (prueba de pellizco de la extremidad trasera y la cola) y el modo de respiración.
NOTA: Los procedimientos quirúrgicos se pueden realizar bajo anestesia general inducida por anestesia inyectable intraperitoneal (p. ej., ketamina [40 mg/kg] y xilacina [10 mg/kg]). Sin embargo, esto no es recomendable ya que el procedimiento es corto, especialmente si las biopsias se realizarán varias veces en días consecutivos. - Administrar analgesia por vía subcutánea (p. ej., 0,3 mg/ml de buprenorfina) tras la inducción de la anestesia.
- Monta el animal de experimentación en el marco estereotáxico. Use barras para las orejas para fijar la cabeza sin obstruir el movimiento de rotación hacia adelante y hacia atrás.
- Estabilice la cabeza en un ángulo de 40° hacia abajo para que se pueda lograr una buena extensión de la parte posterior del cuello.
NOTA: Una forma de hacerlo es utilizando la barra bucal del dispositivo6. - Afeita el pelaje en el área del cuello con una navaja de afeitar y limpia la piel con un antiséptico, como una solución de povidona yodada al 10% y luego alcohol. Aplique el antiséptico tres veces con hisopos de algodón estériles. Frote con movimientos circulares durante 3-5 segundos cada vez.
- Con la yema del dedo, encuentre el área depresible en forma de rombo, colocada entre la protuberancia occipital y la columna vertebral del atlas6.
- Dibuje una marca de punto (por ejemplo, usando un marcador).
- Fije una jeringa de 1 ml o 0,5 ml en el marco estereotáxico.
NOTA: Es recomendable utilizar jeringas con agujas no desmontables ya que producen una mejor succión y tienen menos volumen muerto. - Lleve la aguja al punto de contacto con la piel en la marca del punto.
- Con un par de fórceps, levante la piel mientras baja la jeringa a través de las capas de la piel.
- Recupere ligeramente el émbolo para generar presión negativa en la jeringa.
- Vuelva a empezar a sumergir la aguja muy lentamente hasta que aparezca líquido (LCR) en la jeringa.
- Coloque la aguja en esta posición y permita el flujo lento del líquido cefalorraquídeo.
NOTA: La aguja se puede bajar o elevar ligeramente si el flujo de líquido cefalorraquídeo es muy lento. - Comience a retirar el líquido cefalorraquídeo lentamente (en pasos de 40 μL/min) hasta 120 μL.
- Recupere lentamente la jeringa.
- Administrar por vía intraperitoneal 1 ml de suero normal para apoyar la reposición de líquidos del animal de experimentación.
- Mezcle la biopsia líquida (LCR) con 400 μL de medio NSC y mantenga el tubo de microcentrífuga a 4 °C hasta su uso posterior.
NOTA: Las biopsias líquidas deben procesarse dentro de las 3 horas si no se congelan. - Retirar la mascarilla que suministra el anestésico y trasladar al animal al área de monitoreo post operación.
NOTA: La recuperación de la anestesia y el mantenimiento de la decúbito deben ocurrir dentro de los 5-10 minutos, y la recuperación completa (comportamiento normal) dentro de los 25 minutos.- Vigile de cerca la recuperación (movimiento vívido e ininterrumpido, acceso frecuente al agua) en un espacio bien calentado (24-25 °C), tranquilo y sin lecho de partículas pequeñas, que pueden obstruir las vías respiratorias. Devuelva el animal a la compañía de sus compañeros de jaula (no a animales nuevos) solo después de que se haya confirmado la recuperación completa.
- Vigilar al animal en el centro de mantenimiento durante al menos 48 h después de la cirugía. Si se observan signos de dolor (ocultamiento de la cabeza, postura anormal de la cabeza o del cuerpo, hipersensibilidad e hiperexcitabilidad a la manipulación), administrar analgesia (p. ej., 0,3 mg/ml de buprenorfina por vía subcutánea). Remita a los animales con pelaje descolorido o erizado al veterinario responsable.
4. Procesamiento de tejidos para inmunofluorescencia
- Sacrificar al animal mediante infusión intracardíaca de 20 mL de solución salina helada, seguida de 50 mL de paraformaldehído helado al 4% (PFA; en solución salina tamponada con fosfato [PBS] de pH = 7,4).
- Disecciona el tejido cerebral.
- Separa la cabeza del cuerpo con unas tijeras para hacer un corte en la zona cervical. Use las tijeras para quitar la piel y luego corte el hueso del cráneo a lo largo de la línea media sagital, con las puntas de las tijeras apuntando hacia arriba para no dañar el tejido cerebral. Trate de continuar cortando tanto como sea posible, pasando la línea media coronal.
- Utilizar fórceps para extraer los huesos, empezando por los huesos supraoccipital y parietal y finalmente los huesos frontales.
- Una vez que se revela el tejido cerebral, use las pinzas o una espátula para sacarlo del cráneo. Para facilitar esto, corte los nervios en la base del cerebro y los bulbos olfatorios, si no lo desea.
- Fijar el tejido durante la noche en PFA al 2% a 4 °C.
- Crioproteger el tejido en sacarosa al 30% (en PBS) durante al menos 48 h a 4 °C hasta que el tejido se hunda hasta el fondo.
- Congelar el tejido a -80 °C.
- Cortar el tejido cerebral en secciones coronales de 14 μm de grosor con un criostato.
- Realizar tinción de inmunofluorescencia utilizando protocolos estándar 3,7
- Incubar las secciones con tampón de bloqueo (3% de albúmina sérica bovina [BSA], 0,1% Triton X-100, en PBS) durante 2 h a temperatura ambiente.
- Realizar la recuperación de antígenos (ebullición durante 15 min en tampón citrato 10 mM, pH = 6,0, utilizando frascos de vidrio).
NOTA: Este paso es opcional, pero necesario para los antígenos nucleares. - Llevar a temperatura ambiente e incubar con anticuerpos primarios contra la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), la doble cortina (Dcx), S100β y β-catenina (ver la Tabla de Materiales) en tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C.
- Incubar durante 2 h con anticuerpos secundarios en PBS con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para contratinción nuclear a temperatura ambiente (ver Tabla de Materiales).
- Monta los cubreobjetos.
5. Procesamiento de células aisladas para inmunofluorescencia
- Coloque las células en placas de 96 pocillos compatibles con microscopía, recubiertas con poli-D-lisina (100 μg/mL).
- Fije las células en PFA al 2% helado durante 10 minutos y lávelas 3 veces con PBS.
- Realice inmunofluorescencia utilizando los procedimientos estándar3,7 para PDGFRα, GFAP, Dcx, SOX2 e ID3 (consulte la Tabla de materiales).
- Mantenga las celdas en PBS + NaN3 (0,1%) a 4 °C en la oscuridad.
6. Microscopía y análisis de imágenes
- Tome imágenes con epifluorescencia o microscopía confocal y realice recuentos celulares utilizando herramientas de software estándar de análisis de imágenes, como contadores de células.
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Resultados
Liberación y recopilación de NSC
Las NSC de la ZEE están separadas del LCR solamente por la monocapa de células ependimarias, aunque permanecen en contacto directo con el contenido ventricular a través de procesos monociliados intercalados 8,9. La neuraminidasa actúa específicamente sobre las células ependimarias a través de la escisión de los residuos de ácido siálico y puede inducir la denudación de la pared ventricular. Es...
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Discusión
Las células madre y progenitoras son relativamente escasas en el tejido cerebral de los mamíferos. Además, las NSC se encuentran en áreas inaccesibles para realizar biopsias fáciles y seguras (paredes ventriculares, hipocampo). Por lo tanto, la única forma de trabajar experimentalmente con este tipo de células, hasta ahora, ha sido su aislamiento postmortem. A continuación se describe paso a paso un método que permite la recolección única o repetida de NSC y OPC de ratas vivas, llamado ordeño. El método se basa en dos ca...
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos ni otros conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca de Action Medical Research (Reino Unido) (GN2291) a R.J.M.F. e I.K. El trabajo de investigación también fue parcialmente financiado (costos de animales y apoyo a D.D.) por la Fundación Helénica para la Investigación y la Innovación (H.F.R.I.) en el marco de la "Primera Convocatoria de Proyectos de Investigación H.F.R.I. para apoyar a los miembros de la Facultad e Investigadores y la adquisición de subvenciones para equipos de investigación de alto costo" (Número de proyecto: 3395).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| lanzamiento | |||
| y beta; Anticuerpo bloqueante de 1 integrina | BD Biosciences | #555002 | clon NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Ha2/5, 1 mg/mL. Cualquier cuerpo abntibody con actividad de bloqueo debe ser apropiado. |
| Neuraminidasa de Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Las neuraminidasas de otras fuentes (por ejemplo, de Vibrio cholerae) no han sido probadas. |
| FGF humano recombinante básico (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | mantenido como un 1 μ g/μ L de caldo, diluido en agua estéril a -20 °C; C |
| Procedimientos quirúrgicos | |||
| 10 y micro; L Jeringa | Hamilton | #80330 | Modelo 701 RN, Aguja Pequeña Removible, Calibre 26s, 2 pulg., estilo de punta 2 |
| BD Jeringas de insulina microfinas de 1 mL | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT. SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenofina 0,3 mg/mL) |
| Digital Nuevo Estándar Estereotáxico, Ratas y Ratón | Stoelting | 51500D | |
| Sistema de Monitorización Homeotérmica | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1.000 mg/g vapor de inhalación, líquido | Vetpharma Salud Animal | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: | Ketamina 100 mg/mL |
| Sutura de nylon, Ethilon | Ethicon | D9635 | Transparente, tamaño 5-0 |
| Recortadoras quirúrgicas inalámbricas recargables | Stoelting | Artículo:51472 | |
| Hojas de bisturí, estériles | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. Hisopos de 8 pulgadas | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Taladro estereotáxico de alta velocidad | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting' s Kit de Instrumento Estereotáxico Almacenamiento | Artículo | : 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xilacina, 25 |
| mLManipulación de tejidos y células e inmunotinciones | |||
| placas de 96 pocillos apropiadas para microscopía | Greiner | #655866 | Suplemento de microplaca de estrella de pantalla |
| B27 | ThermoFisher Scientific A1486701 | ||
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fracción V, |
| térmico Merck | 71497 | Citrato de sodio monobásico | |
| Criostato | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Tinción nuclear, dilución: 1/1.000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | Alto contenido de glucosa, piruvato |
| anti-cabra | Biotium | 20016 o 20106 o 20048 | Dilución: 1/1.000 |
| burro anti-ratón | Biotium | 20014 o 20105 o 20046 | Dilución: 1/1.000 |
| burro anti-conejo | Biotium | 20015 o 20098 o 20047 | Dilución: 1/1.000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (o bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| cabra anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilución: 1/500 |
| cabra anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilución: 1/200 |
| ratón anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilución: 1/200 |
| ratón anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilución: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 Medio de montaje | |
| N2 suplemento | ThermoFisher Scientific | ||
| Parafolmadehído | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lisina | Merck, Millipore | A-003-E | Solución, 1,0 mg/mL |
| anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilución: 1/500 |
| conejo anti-PDGFR&alfa; | Abcam | ab51875 | Dilución: 1/200 |
| conejo anti-β- catenina | Abcam | ab16051 | Dilución: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopía y análisis de imágenes | |||
| Microscopio confocal | Leica | SP6 y SP8 | |
| Análisis de imágenes | NIH, EE. UU. | ImageJ | |
| Análisis de imagen | Leica | LasX |
Referencias
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