El método de "ordeño cerebral" para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos de ratas vivas

Summary

Aquí se presenta un método para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras de oligodendrocitos del cerebro de ratas vivas en detalle experimental. Permite múltiples colecciones de estas células de los mismos animales sin comprometer su bienestar.

Abstract

Las células madre neurales (NSC) específicas de tejido permanecen activas en el cerebro postnatal de los mamíferos. Residen en nichos especializados, donde generan nuevas neuronas y glía. Uno de estos nichos es la zona subependimaria (ZEE; también llamada zona ventricular-subventricular), que se encuentra a lo largo de las paredes laterales de los ventrículos laterales, adyacente a la capa de células ependimarias. Las células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) están abundantemente distribuidas por todo el sistema nervioso central, constituyendo un conjunto de células progenitoras proliferativas que pueden generar oligodendrocitos.

Tanto los NSC como los OPC exhiben potencial de autorrenovación y ciclos de inactividad/activación. Debido a su localización, el aislamiento y la investigación experimental de estas células se realiza post mortem. Aquí, describimos en detalle el "ordeño cerebral", un método para el aislamiento de NSCs y OPCs, entre otras células, de animales vivos. Este es un protocolo de dos pasos diseñado para su uso en roedores y probado en ratas. En primer lugar, las células se "liberan" del tejido a través de una inyección estereotáxica intracerebroventricular (i.c.v.) de un "cóctel de liberación". Los componentes principales son la neuraminidasa, que se dirige a las células ependimarias e induce la denudación de la pared ventricular, un anticuerpo bloqueante de la integrina-β1, y el factor de crecimiento de fibroblastos-2. En una segunda etapa de "recolección", se realizan biopsias líquidas de líquido cefalorraquídeo de la cisterna magna, en ratas anestesiadas sin necesidad de incisión.

Los resultados presentados aquí muestran que las células aisladas conservan su perfil endógeno y que las NSC de la ZEE conservan su quiescencia. La denudación de la capa ependimaria se restringe al nivel anatómico de la inyección y el protocolo (liberación y recolección) es bien tolerado por los animales. Este novedoso enfoque allana el camino para realizar estudios longitudinales de neurogénesis endógena y gliogénesis en animales de experimentación.

Introduction

Las células madre específicas de tejido son células parcialmente comprometidas que pueden dar lugar a todas las poblaciones celulares que constituyen los tejidos respectivos. Además de ser multipotentes, son células que se autorrenuevan y son cruciales para mantener la homeostasis y la capacidad regenerativa de los tejidos¹. Algunas células madre específicas de tejido permanecen en un estado activo y fuertemente proliferativo, como las células madre intestinales o hematopoyéticas. Otras, como las células madre cerebrales, permanecen en gran medida inactivas o inactivas². En el cerebro adulto, las células madre neurales (NSC, por sus siglas en inglés) se pueden encontrar en áreas especializadas, a menudo llamadas nichos. Existen dos áreas bien descritas en la zona subependimaria (ZEE) de los ventrículos laterales y en la circunvolución dentada del hipocampo. El nicho de la ZEE genera el mayor número de células, principalmente neuroblastos que migran hacia los bulbos olfatorios y contribuyen a la población local de interneuronas; por el contrario, los oligodendroblastos generados migran al cuerpo calloso adyacente (CC)³. Las células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) son células mitóticamente activas, ampliamente distribuidas por todo el sistema nervioso central, que: i) están comprometidas con el linaje oligodendroglial, ii) pueden migrar a sitios de desmielinización, y iii) pueden diferenciarse en oligodendrocitos mielinizantes. Las OPC también exhiben potencial de autorrenovación y quietud⁴.

Hasta ahora, el aislamiento y estudio de las NSC y OPC requería la disociación postmortem del tejido cerebral y de la médula espinal disecado. Para sortear esta limitación experimental, establecimos un método que permite, por primera vez, aislar las NSC y OPC cerebrales de animales vivos. Llamamos a este método "ordeño", porque permite múltiples colecciones de células, ya que sus reservas no se agotan. El protocolo se desarrolló en ratas, debido a su gran tamaño cerebral, dirigido principalmente a la ZEE, o CC, e incluye dos pasos principales. En primer lugar, las NSC u OPC se "eliminan" del tejido mediante la inyección intravenosa de un "cóctel de liberación" que contiene neuraminidasa, una toxina que induce la denudación de la pared ventricular, un anticuerpo que bloquea la integrina-β1 y el factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2). El cóctel se inyecta estereotáxicamente bilateralmente dentro de los ventrículos laterales. Si el uso previsto es el aislamiento de las NSC, se dirigen a las áreas rostrales de los ventrículos laterales. Si el objetivo es aislar las OPC de forma más pura, el cóctel se inyecta caudalmente en la zona de la fimbría del hipocampo. En un segundo paso de "recolección", se realizan biopsias líquidas de líquido cefalorraquídeo (LCR) de la cisterna magna de ratas anestesiadas, sin necesidad de incisión. La biopsia líquida se mezcla con un medio de cultivo NSC y se puede mantener a 4 °C hasta la siembra.

Protocol

Los procedimientos de cría, mantenimiento y experimentación de animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido de 1986, autorizada por el Ministerio del Interior, y con el Decreto Presidencial 56/2013 de la República Helénica, examinada por los Órganos de Revisión Ética y de Bienestar Animal de las Universidades de Cambridge y Patras, así como aprobada y examinada por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Prefectura local (Número de protocolo: 5675/39/18-01-2021). Se utilizaron ratas macho y hembra Sprague-Dawley, Wistar y Long-Evans, con edades que variaban entre 2 y 4 meses y con pesos corporales entre 150 g y 250 g. El protocolo se resume gráficamente en la Figura 1.

1. Preparación del cóctel de liberación

NOTA: Prepárese fresco el día del procedimiento y manténgalo en hielo. Las cantidades se administran por 2 μL que se inyectan i.c.v. en cada ventrículo lateral. Prepare 1 μl adicional por cada inyección prevista.

1. Preparar 0,5 μL de 500 mU de neuraminidasa de Clostridium perfringens (Clostridium welchii).
   NOTA: Consérvelo como un caldo de 1 U/μL diluido en agua estéril a -20 °C. No se han probado otros tipos de neuraminidasas.
2. Prepare 1 μL que contenga 1 μg de anticuerpo bloqueador de integrina-β1.
   NOTA: Guárdelo a 4 °C.
3. Preparar 0,5 μL que contiene 0,5 μg de factor de crecimiento básico de fibroblastos (FGF-básico humano recombinante).
   NOTA: Consérvelo en forma de 1 μg/μL diluido en agua estéril a -20 °C.

2. Inyección de cóctel de liberación

NOTA: Todo el proceso se puede realizar en 20 minutos. Tenga cuidado de realizar la cirugía en condiciones asépticas. Limpie todas las superficies con antiséptico (por ejemplo, peróxido de hidrógeno al 3% o al 6%). Use herramientas, guantes, batas y paños esterilizados en autoclave o fácilmente estériles.

1. Anestesiar al animal de experimentación por inhalación de isoflurano (2,5% para inducción y 2% para mantenimiento). Confirme la profundidad de la anestesia comprobando el reflejo corneal, la reacción a los estímulos (prueba de pellizco de la extremidad posterior y la cola) y el modo de respiración.
   NOTA: Los procedimientos quirúrgicos se pueden realizar bajo anestesia general inducida por anestesia inyectable intraperitoneal (p. ej., ketamina [40 mg/kg] y xilacina [10 mg/kg]). La anestesia profunda se confirmó mediante la comprobación del reflejo corneal, la reacción a los estímulos (prueba de pellizco de la extremidad posterior y la cola) y el modo de respiración.
2. Administrar analgesia por vía subcutánea (p. ej., 0,3 mg/ml de buprenorfina) tras la inducción de la anestesia.
3. Monta la rata en el marco estereotáxico.
4. Afeita el pelaje de la cabeza con una navaja de afeitar y limpia la piel con un antiséptico, como una solución de povidona yodada al 10% y luego alcohol. Aplique el antiséptico tres veces con hisopos de algodón estériles. Frote con movimientos circulares durante 3-5 segundos cada vez. Aplique ungüento para los ojos para prevenir la sequedad.
5. Haga una incisión de 2 cm en la piel de la cabeza a lo largo de la línea media con un bisturí estéril.
6. Limpie meticulosamente el cráneo con hisopos estériles y solución salina estéril.
7. Identifique el bregma utilizando el borde de la aguja de una jeringa Hamilton de 10 μL montada en el dispositivo estereotáxico. Establezca el bregma como "punto 0,0".
   NOTA: El bregma se identifica como el punto de intersección entre las suturas sagital y coronal. Se pueden encontrar más detalles en el atlas del cerebro de rata de Paxinos y Watson⁵.
8. Mueva el dispositivo a las coordenadas anterioposterior (AP) = 0,3 mm, lateral (L) = +1,2 mm (para apuntar a la ZEE) o AP = 1,5 mm, L = +2,0 mm (para apuntar al CC).
9. Taladre un orificio de rebaba de 1 mm con un taladro dental.
   NOTA: Al perforar a mano, tenga cuidado de no lesionar la superficie cortical. No se espera que la hemorragia sea considerable. Limpie la sangre con solución salina y aplique presión para detener el sangrado más persistente.
10. Cargue 4 μL del cóctel de liberación en la jeringa Hamilton de 10 μL.
11. Baje la aguja (preferiblemente de borde romo o cónico) de la jeringa Hamilton para entrar en contacto con la duramadre.
12. Inserte la aguja a la profundidad deseada (D = 3,5 mm).
    NOTA: Vierta solución salina en la superficie de la duramadre para mantener el tejido hidratado.
13. Infundir 2 μL del cóctel de liberación a razón de 1 μL/min.
14. Deje la aguja en su lugar durante otros 2 minutos antes de recuperarla lentamente para evitar que salga a la superficie el cóctel de liberación.
15. Repita los pasos 2.8-2.14 para el otro hemisferio en las coordenadas AP = 0.3 mm, L = -1.2 mm (para apuntar a la ZEE) o AP = 1.5 mm, L = -2.0 mm (para apuntar al CC).
16. Suturar la incisión con nylon 5-0 (diámetro 0,1 mm) y limpiar la zona suturada con un antiséptico.
17. Retirar la mascarilla que suministra el anestésico y trasladar al animal al área de monitoreo postoperatorio.
    NOTA: La recuperación de la anestesia y el mantenimiento de la decúbito deben ocurrir dentro de los 5-10 minutos, y la recuperación completa (comportamiento normal) dentro de los 25 minutos.
    1. Vigile de cerca la recuperación (movimiento vívido e ininterrumpido, acceso frecuente al agua) en un espacio bien calentado (24-25 °C), tranquilo y sin lecho de partículas pequeñas, que pueden obstruir las vías respiratorias. Devuelva el animal a la compañía de sus compañeros de jaula (no a animales nuevos) solo después de confirmar la recuperación completa.
    2. Vigilar al animal en el centro de mantenimiento durante al menos 48 h después de la cirugía. Tratar los signos de dolor (ocultamiento de la cabeza, postura anormal de la cabeza o del cuerpo, hipersensibilidad e hiperexcitabilidad a la manipulación) mediante la administración de analgesia (p. ej., 0,3 mg/ml de buprenorfina, por vía subcutánea). Remita a los animales con pelaje descolorido o erizado al veterinario responsable.

3. Biopsia líquida del líquido cefalorraquídeo (LCR)

NOTA: Todo el proceso se puede realizar en 10 minutos. La biopsia líquida descrita aquí se realiza 3 días después de la inyección del cóctel de liberación, pero se puede realizar exactamente de la misma manera siempre que sea necesario. Tenga cuidado de realizar la cirugía en condiciones asépticas. Limpie todas las superficies con un antiséptico (por ejemplo, peróxido de hidrógeno al 3% o al 6%). Use herramientas, guantes, batas y paños esterilizados en autoclave o fácilmente estériles.

1. Anestesiar al animal por inhalación de isoflurano (2,5% para inducción y 2% para mantenimiento). Confirme la profundidad de la anestesia revisando la córnea
   el reflejo, la reacción a los estímulos (prueba de pellizco de la extremidad trasera y la cola) y el modo de respiración.
   NOTA: Los procedimientos quirúrgicos se pueden realizar bajo anestesia general inducida por anestesia inyectable intraperitoneal (p. ej., ketamina [40 mg/kg] y xilacina [10 mg/kg]). Sin embargo, esto no es recomendable ya que el procedimiento es corto, especialmente si las biopsias se realizarán varias veces en días consecutivos.
2. Administrar analgesia por vía subcutánea (p. ej., 0,3 mg/ml de buprenorfina) tras la inducción de la anestesia.
3. Monta el animal de experimentación en el marco estereotáxico. Use barras para las orejas para fijar la cabeza sin obstruir el movimiento de rotación hacia adelante y hacia atrás.
4. Estabilice la cabeza en un ángulo de 40° hacia abajo para que se pueda lograr una buena extensión de la parte posterior del cuello.
   NOTA: Una forma de hacerlo es utilizando la barra bucal del dispositivo⁶.
5. Afeita el pelaje en el área del cuello con una navaja de afeitar y limpia la piel con un antiséptico, como una solución de povidona yodada al 10% y luego alcohol. Aplique el antiséptico tres veces con hisopos de algodón estériles. Frote con movimientos circulares durante 3-5 segundos cada vez.
6. Con la yema del dedo, encuentre el área depresible en forma de rombo, colocada entre la protuberancia occipital y la columna vertebral del atlas⁶.
7. Dibuje una marca de punto (por ejemplo, usando un marcador).
8. Fije una jeringa de 1 ml o 0,5 ml en el marco estereotáxico.
   NOTA: Es recomendable utilizar jeringas con agujas no desmontables ya que producen una mejor succión y tienen menos volumen muerto.
9. Lleve la aguja al punto de contacto con la piel en la marca del punto.
10. Con un par de fórceps, levante la piel mientras baja la jeringa a través de las capas de la piel.
11. Recupere ligeramente el émbolo para generar presión negativa en la jeringa.
12. Vuelva a empezar a sumergir la aguja muy lentamente hasta que aparezca líquido (LCR) en la jeringa.
13. Coloque la aguja en esta posición y permita el flujo lento del líquido cefalorraquídeo.
    NOTA: La aguja se puede bajar o elevar ligeramente si el flujo de líquido cefalorraquídeo es muy lento.
14. Comience a retirar el líquido cefalorraquídeo lentamente (en pasos de 40 μL/min) hasta 120 μL.
15. Recupere lentamente la jeringa.
16. Administrar por vía intraperitoneal 1 ml de suero normal para apoyar la reposición de líquidos del animal de experimentación.
17. Mezcle la biopsia líquida (LCR) con 400 μL de medio NSC y mantenga el tubo de microcentrífuga a 4 °C hasta su uso posterior.
    NOTA: Las biopsias líquidas deben procesarse dentro de las 3 horas si no se congelan.
18. Retirar la mascarilla que suministra el anestésico y trasladar al animal al área de monitoreo post operación.
    NOTA: La recuperación de la anestesia y el mantenimiento de la decúbito deben ocurrir dentro de los 5-10 minutos, y la recuperación completa (comportamiento normal) dentro de los 25 minutos.
    1. Vigile de cerca la recuperación (movimiento vívido e ininterrumpido, acceso frecuente al agua) en un espacio bien calentado (24-25 °C), tranquilo y sin lecho de partículas pequeñas, que pueden obstruir las vías respiratorias. Devuelva el animal a la compañía de sus compañeros de jaula (no a animales nuevos) solo después de que se haya confirmado la recuperación completa.
    2. Vigilar al animal en el centro de mantenimiento durante al menos 48 h después de la cirugía. Si se observan signos de dolor (ocultamiento de la cabeza, postura anormal de la cabeza o del cuerpo, hipersensibilidad e hiperexcitabilidad a la manipulación), administrar analgesia (p. ej., 0,3 mg/ml de buprenorfina por vía subcutánea). Remita a los animales con pelaje descolorido o erizado al veterinario responsable.

4. Procesamiento de tejidos para inmunofluorescencia

1. Sacrificar al animal mediante infusión intracardíaca de 20 mL de solución salina helada, seguida de 50 mL de paraformaldehído helado al 4% (PFA; en solución salina tamponada con fosfato [PBS] de pH = 7,4).
2. Disecciona el tejido cerebral.
   1. Separa la cabeza del cuerpo con unas tijeras para hacer un corte en la zona cervical. Use las tijeras para quitar la piel y luego corte el hueso del cráneo a lo largo de la línea media sagital, con las puntas de las tijeras apuntando hacia arriba para no dañar el tejido cerebral. Trate de continuar cortando tanto como sea posible, pasando la línea media coronal.
   2. Utilizar fórceps para extraer los huesos, empezando por los huesos supraoccipital y parietal y finalmente los huesos frontales.
   3. Una vez que se revela el tejido cerebral, use las pinzas o una espátula para sacarlo del cráneo. Para facilitar esto, corte los nervios en la base del cerebro y los bulbos olfatorios, si no lo desea.
3. Fijar el tejido durante la noche en PFA al 2% a 4 °C.
4. Crioproteger el tejido en sacarosa al 30% (en PBS) durante al menos 48 h a 4 °C hasta que el tejido se hunda hasta el fondo.
5. Congelar el tejido a -80 °C.
6. Cortar el tejido cerebral en secciones coronales de 14 μm de grosor con un criostato.
7. Realizar tinción de inmunofluorescencia utilizando protocolos estándar ^3,7
   1. Incubar las secciones con tampón de bloqueo (3% de albúmina sérica bovina [BSA], 0,1% Triton X-100, en PBS) durante 2 h a temperatura ambiente.
   2. Realizar la recuperación de antígenos (ebullición durante 15 min en tampón citrato 10 mM, pH = 6,0, utilizando frascos de vidrio).
      NOTA: Este paso es opcional, pero necesario para los antígenos nucleares.
   3. Llevar a temperatura ambiente e incubar con anticuerpos primarios contra la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), la doble cortina (Dcx), S100β y β-catenina (ver la Tabla de Materiales) en tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C.
   4. Incubar durante 2 h con anticuerpos secundarios en PBS con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para contratinción nuclear a temperatura ambiente (ver Tabla de Materiales).
   5. Monta los cubreobjetos.

5. Procesamiento de células aisladas para inmunofluorescencia

1. Coloque las células en placas de 96 pocillos compatibles con microscopía, recubiertas con poli-D-lisina (100 μg/mL).
2. Fije las células en PFA al 2% helado durante 10 minutos y lávelas 3 veces con PBS.
3. Realice inmunofluorescencia utilizando los procedimientos estándar^3,7 para PDGFRα, GFAP^, Dcx, SOX2 e ID3 (consulte la Tabla de materiales).
4. Mantenga las celdas en PBS + NaN₃ (0,1%) a 4 °C en la oscuridad.

6. Microscopía y análisis de imágenes

1. Tome imágenes con epifluorescencia o microscopía confocal y realice recuentos celulares utilizando herramientas de software estándar de análisis de imágenes, como contadores de células.

Results

Liberación y recopilación de NSC
Las NSC de la ZEE están separadas del LCR solamente por la monocapa de células ependimarias, aunque permanecen en contacto directo con el contenido ventricular a través de procesos monociliados intercalados ^8,9. La neuraminidasa actúa específicamente sobre las células ependimarias a través de la escisión de los residuos de ácido siálico y puede inducir la denudación de la pared ventricular. Esto conduce a la agrupación de neuroblastos en la superficie del ventrículo^10,11. Además, se ha observado un flujo de neuroblastos en el LCR después de la inyección i.c.v. de un anticuerpo bloqueador de la integrina-β1, probablemente debido al aflojamiento de las uniones celulares interependimarias¹². Estas observaciones han llevado al desarrollo de un protocolo que permite el aislamiento de las células madre y progenitoras del cerebro a través de un compromiso controlado de la integridad de las paredes del ventrículo lateral. En un primer paso, se induce la liberación del parénquima y el posterior flujo de NSC u OPC dentro del LCR a través de la inyección i.c.v. del cóctel de liberación. El cóctel se inyecta estereotáxicamente a una velocidad de 1 μL/min, bilateralmente (2 μL por inyección) en los ventrículos laterales (coordenadas dirigidas a las NSC de la ZEE: AP = 0,3 mm, L = ± 1,2 mm, D = 3,5 mm; coordenadas dirigidas a las OPC CC: AP = 1,5 mm, L = ± 2 mm, D = 3,5 mm). El segundo paso ("recolección") consiste en la realización de biopsias líquidas de LCR de la cisterna magna. Las ratas necesitan ser anestesiadas y la biopsia se puede hacer con jeringas de 1 mL. El uso del dispositivo estereotáxico permite un éxito casi completo en la recuperación de aproximadamente 100 μL de LCR, sin necesidad de incisiones. La biopsia líquida se añade al medio de cultivo helado y se mantiene a 4 °C hasta la siembra durante <3 h (el medio de cultivo NSC contiene medio Eagle modificado de Dulbecco [DMEM], suplemento de B27 [2%], suplemento de N2 [1%], FGF2 [20 ng/ml] y factor de crecimiento epidérmico [EGF; 20 ng/ml]).

Evaluación histológica de la zona periventricular tras la inyección del cóctel de liberación
Una primera cohorte de experimentos reveló que cuando se inyectan más de 3 μL de líquido, los ventrículos pueden dañarse debido a una lesión mecánica inespecífica (Figura 2B,C). La inyección lenta de 2 μL de cóctel de liberación condujo a la aparición de grupos de neuroblastos inmunopositivos a Dcx en la superficie ventricular. Estos grupos permanecieron visibles incluso a los 8 meses después de la inyección (Figura 2D). Como el método estaba destinado a estudios longitudinales, con el objetivo de realizar un seguimiento a largo plazo de los animales, se evaluó el daño tisular causado por el cóctel de liberación. La inmunotinción se realizó en secciones cerebrales de criostato de 14 μm de espesor para marcadores de células ependimarias, como S100β y β-catenina¹³, y se evaluó la integridad general de la capa ependimaria. Los sitios de denudación de la capa ependimaria estuvieron presentes solo cerca del nivel rostrocaudal de las inyecciones, con una disminución gradual de las perturbaciones de la capa ependimaria detectadas en las áreas más posteriores y más anteriores de la ZEE (Figura 2E, F) y que desaparecieron después de una distancia de ±2 mm del sitio de la inyección. Los resultados mencionados anteriormente muestran que la denudación parcial de la capa ependimaria causada por la inyección i.c.v. del cóctel de liberación es focal, restringida en la proximidad del sitio de inyección, y deja intacta el resto de la capa ependimaria periventricular.

Perfil de marcadores y comportamiento in vitro de las células colectadas
Posteriormente, se evaluó el comportamiento in vitro y el perfil de marcadores de las células aisladas mediante el protocolo de ordeño. El rendimiento celular promedio de cada biopsia líquida es de aproximadamente 300 ± 45 células (por biopsia de 100 μL)⁷. Las biopsias de ordeño dieron como resultado cultivos de NSC con un promedio de 3,17 ± 0,45 de potencial de paso. Las células aisladas de ratas inyectadas con solución salina pudieron pasar en promedio 1,92 ± 0,76 veces; en contraste, los aislados vía ordeño llegaron incluso a nueve pasajes (p = 0,038, prueba t) (Figura 3A)⁷. La capacidad media de paso de los cultivos de neurosfera postmortem estándar derivados de SEZ es superior a 12 pasadas en nuestras manos. Debido a que se ha demostrado que el potencial de expansión in vivo de las NSC de las ZEE, como lo revelan los experimentos de mapeo del destino celular in vivo ¹⁴, es limitado, el ordeño produce células con un comportamiento in vitro significativamente diferente al de las células en cultivos estándar, aunque mucho más cercano al comportamiento de las NSC endógenas. Las células recolectadas se sembraron en pocillos recubiertos de poli-D-lisina. donde crecieron como monocapas adherentes y, más raramente, como neuroesferas (Figura 3B). Las células recién aisladas (recolectadas 3 días después de la inyección y fijadas 24 h después de la siembra) que eran inmunopositivas para el marcador astroglial GFAP también eran inmunopositivas para ID3, un marcador de quiescencia, y tenían la característica de morfología bipolar NSC (Figura 3C). Además, como se informó anteriormente⁷, una comparación inmunocitoquímica más detallada de las células derivadas de la biopsia y de las células derivadas de la autopsia de los mismos animales, a los 3 días después de la inyección (en busca de astrocitos GFAP+, neuroblastos Dcx+, progenitores de oligodendrocitos PDGFRa+ y células SOX2+ del linaje neural) mostró que el perfil de las células recolectadas era similar al de las células SEZ endógenas (Figura 3D). En particular, cuando se compararon las células derivadas de la biopsia y de los tejidos en diferentes condiciones (por ejemplo, la inyección de un cóctel de liberación con y sin FGF2), se encontró que el factor de crecimiento resultó en un aumento concomitante y significativo en la presencia de células SOX2+, así como en una disminución significativa en la presencia de neuroblastos Dcx+ en ambas muestras (Figura 3D). Estos datos confirmaron que cualquier cambio que aparezca en el perfil de las poblaciones endógenas de NSC se refleja en las muestras de células generadas por el ordeño.

Figura 1: Resumen gráfico del ordeño. Sección coronal de un hemisferio encefálico con los principales puntos de referencia anatómicos (el ventrículo lateral, el cuerpo calloso suprayacente y la comisura anterior por debajo [tractos de sustancia blanca en gris] y la zona subependimaria en las paredes laterales [en azul]). El cóctel de liberación se inyecta en el ventrículo lateral, lo que compromete la integridad del tejido y libera células madre neurales cerebrales postnatales en el líquido cefalorraquídeo, del que se pueden extraer mediante biopsias líquidas. Abreviaturas: ZEE = zona subependimaria; VI = ventrículo lateral; LCR = líquido cefalorraquídeo; pbNSCs = células madre neurales cerebrales postnatales; β1-int = integrina beta1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Evaluación histológica de los efectos de las inyecciones i.c.v. (A-D) Imágenes de bajo aumento de la mitad dorsal del ventrículo lateral después de la inmunotinción para Dcx (en rojo, para marcar neuroblastos). (A) La simple inserción i.c.v. de una jeringa Hamilton no altera la citoarquitectura de la SEZ, mientras que la inyección i.c.v. de 10 mL (velocidad de infusión de 1 mL/min) conduce a un daño severo de la pared ventricular independientemente de su contenido. (B) Solución salina y (C) cóctel de liberación. (D) La inyección de 2 μL del cóctel de liberación conduce a un compromiso controlado de la pared ventricular, observado incluso a los 8 meses después de la cirugía. El detalle de mayor aumento de la pared de la ZEE a los 7 y 14 días después de la inyección se muestra en (E) y (F), respectivamente. Hay una estructura desorganizada, con neuroblastos Dcx+ (en verde) descansando en la superficie de la pared y las otras células del nicho (Sox2+, en blanco) descansando más profundamente. El tejido periventricular está dañado a nivel rostrocaudal de la inyección en el punto de tiempo de 2 meses (en G), mientras que el tejido está intacto a un nivel más caudal (en H) en el mismo animal. La pared ventricular se evalúa mediante inmunotinción para los marcadores ependimarios S100β y β-catenina. El detalle de la arquitectura típica de la muralla se muestra en (I). La tinción nuclear se realiza mediante DAPI (que se muestra en azul). Barras de escala = 300 μm (A-C, G, H, recuadros), 150 μm (D), 30 μm (E, F) y 50 μm (I). Esta figura es una modificación de McClenahan et ^al.13. Abreviaturas: ZEE = zona subependimaria; i.c.v = intracerebroventricular; Dcx = doble cortina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Evaluación de las células aisladas mediante ordeño. (A) Gráfico que muestra el número máximo de pasajes obtenidos por muestra de biopsia líquida de animales inyectados con solución salina (barras grises, total de 12 muestras), o después del ordeño (barras negras, total de 29 muestras, cóctel de liberación con neuraminidasa y anticuerpo bloqueador de integrina-β1). (B) Imagen representativa de microscopía confocal de células primarias obtenidas mediante ordeño, a los 3 días después de la inyección, inmunoteñidas contra GFAP e ID3. (C,D) Imágenes de campo claro de células aisladas 3 días después de la inyección, sembradas en pocillos recubiertos de poli-D-lisina y dejadas crecer en medio de proliferación de NSC durante 7 días. (E) Gráfico que muestra el perfil del tipo celular de las células aisladas mediante ordeño de la ZEE y de la población endógena de NSC de la ZEE de los mismos animales de experimentación. Las fracciones SOX2+ y Dcx+ aumentaron y disminuyeron significativamente, respectivamente, después de la coinyección de FGF2. (Análisis ANOVA de un factor por marcador, seguido de análisis post hoc; n = 4-6 animales por grupo experimental). Barras de escala = 100 μm (C,D) y 10 μm (B). Esta figura es una modificación de McClenahan et ^al.13. Abreviaturas: ZEE = zona subependimaria; DPI = días después de la inyección; NSC = células madre neurales; Dcx = doble cortina; GFAP = proteína ácida fibrilar glial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Las células madre y progenitoras son relativamente escasas en el tejido cerebral de los mamíferos. Además, las NSC se encuentran en áreas inaccesibles para realizar biopsias fáciles y seguras (paredes ventriculares, hipocampo). Por lo tanto, la única forma de trabajar experimentalmente con este tipo de células, hasta ahora, ha sido su aislamiento postmortem. A continuación se describe paso a paso un método que permite la recolección única o repetida de NSC y OPC de ratas vivas, llamado ordeño. El método se basa en dos características clave: i) las NSC u OPC están separadas por la monocapa de células ependimarias del LCR, que fluye dentro del sistema ventricular del cerebro; ii) las células ependimarias y los progenitores neurales mantienen contacto entre ellas y con otros tipos de células vecinas a través de integrinas. Por lo tanto, el cóctel de liberación inyectado en áreas específicas de los ventrículos para permitir la desconexión de las NSC, u OPC, del parénquima cerebral contiene neuraminidasa, una toxina que se dirige específicamente y mata las células ependimarias^10,11, y un anticuerpo bloqueador de la integrina-β1. También contiene FGF2, ya que este factor de crecimiento es esencial para la supervivencia y el mantenimiento de las NSC en el nicho y en el cultivo^15,16. Se ha demostrado previamente⁷ que este protocolo es bien tolerado por los animales; en este informe, se confirma además que el daño a las células ependimarias, inducido por el cóctel de liberación como requisito previo para la liberación de NSC/OPC en el LCR, está limitado alrededor del nivel rostrocaudal de la inyección. Esto ha sido de vital importancia, ya que el protocolo debe preservar la función homeostática del cerebro, incluido el propio nicho de células madre, y no debe comprometer el bienestar a largo plazo de los animales. La inyección estereotáxica del cóctel de liberación es de gravedad leve y nunca ha resultado en la muerte. Además, la realización de biopsias líquidas de la cisterna magna es un procedimiento rápido y mínimamente invasivo que puede repetirse varias veces consecutivas.

Es importante destacar que las muestras de NSC aisladas mediante ordeño reflejan fielmente el conjunto endógeno de NSC. El perfil de los progenitores de las ZEE puede verse influido por la inyección i.c.v. de FGF2. Cuando esto sucede, el perfil de las células derivadas del ordeño se ve afectado de la misma manera. Además, trabajos experimentales previos han indicado que las NSC aisladas a través del ordeño de la ZEE tienen un potencial de autorrenovación limitado, un comportamiento similar al de las NSC endógenas, como se revela con estrategias in vivo, transgénicas y de destino celular^14,17. Las NSC cerebrales postnatales se mantienen en quiescencia, rara vez transitan hacia la activación mitótica para generar progenie neurogénica y gliogénica^18,19,20. En este caso, se proporciona evidencia de que la fracción de células derivadas del ordeño que expresan GFAP y se espera que incluyan NSC de buena fe co-expresan ID3, un marcador de NSC inactivas²¹. La presencia enriquecida de NSC quiescentes, que luego se siembran en el medio NSC típicamente utilizado para el cultivo de NSC aisladas postmortem, parece limitar el potencial de expansión de las NSC recolectadas (por ejemplo, un proceso crucial si las células se utilizaran para trasplantes autólogos). Esto se debe a que estos medios están diseñados específicamente para la supervivencia y la expansión mitótica de las NSC activadas; por lo tanto, la generación de protocolos que permitan la activación mitótica eficiente y rápida de las NSC inactivas aumentará el valor y el alcance del uso del ordeño.

En general, estos datos indican que el ordeño permite la toma de muestras de NSCs y OPCs cerebrales postnatales (dependiendo del nivel rostrocaudal de la inyección del cóctel de liberación) de ratas vivas. Este trabajo indica la factibilidad de realizar biopsias líquidas sucesivas en el mismo animal, incluso en períodos de tiempo significativos después de la inyección del cóctel de liberación (por lo tanto, para planificar y realizar estudios experimentales longitudinales), ya que los neuroblastos permanecen agrupados en las paredes ventriculares incluso a los 8 meses después de la inyección. Estos métodos son de vital importancia porque permiten la investigación de eventos dentro de animales individuales que resultan en una reducción del ruido biológico generado por la variación fisiológica. Esto, a su vez, conduce a una mayor precisión y a la implementación de los principios de las "3R" (reemplazo, reducción y refinamiento). Los pasos clave futuros para la mejora del método serán la determinación del número máximo y el período de tiempo en que se pueden realizar biopsias líquidas después de un procedimiento de liberación, aunque la realización de procedimientos de liberación adicionales debería ser factible, si es necesario.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
lanzamiento
y beta; Anticuerpo bloqueante de 1 integrina	BD Biosciences	#555002	clon NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Ha2/5, 1 mg/mL. Cualquier cuerpo abntibody con actividad de bloqueo debe ser apropiado.
Neuraminidasa de Clostridium perfringens (Clostridium welchii)	Sigma-Aldrich	#N2876	Las neuraminidasas de otras fuentes (por ejemplo, de Vibrio cholerae) no han sido probadas.
FGF humano recombinante básico (154 a.a.)	Peprotech	#100-18B	mantenido como un 1 μ g/μ L de caldo, diluido en agua estéril a -20 °C; C
Procedimientos quirúrgicos
10 y micro; L Jeringa	Hamilton	#80330	Modelo 701 RN, Aguja Pequeña Removible, Calibre 26s, 2 pulg., estilo de punta 2
BD Jeringas de insulina microfinas de 1 mL	BD biosciences	04085-00	29 G x 12.7 mm
BETADINE CUT. SOL 10% FLx30ML	LAVIPHARM-CASTALIA	SKU:
Bupaq	RICHTERPHARMA	1021854AF	10 mL (buprenofina 0,3 mg/mL)
Digital Nuevo Estándar Estereotáxico, Ratas y Ratón	Stoelting	51500D
Sistema de Monitorización Homeotérmica	Harvard Apparatus	55-7020
ISOFLURIN 1.000 mg/g vapor de inhalación, líquido	Vetpharma Salud Animal	32509/4031
Ketamidor	RICHTER PHARMA	SKU:	Ketamina 100 mg/mL
Sutura de nylon, Ethilon	Ethicon	D9635	Transparente, tamaño 5-0
Recortadoras quirúrgicas inalámbricas recargables	Stoelting	Artículo:51472
Hojas de bisturí, estériles	Swann Morton	AW050
Scopettes Jr.  Hisopos de 8 pulgadas	Birchwood Laboratories	34-7021-12P
Taladro estereotáxico de alta velocidad	Foredom	1474w/o1464
Stoelting' s Kit de Instrumento Estereotáxico Almacenamiento	Artículo	: 52189
Xylan 2%	Chanelle Pharmaceuticals	13764/03/19-5-2004	Xilacina, 25
mLManipulación de tejidos y células e inmunotinciones
placas de 96 pocillos apropiadas para microscopía	Greiner	#655866	Suplemento de microplaca de estrella de pantalla
B27	ThermoFisher Scientific A1486701
Albúmina sérica bovina (BSA)	Merck	P06-1391100	Fracción V,
	térmico Merck	71497	Citrato de sodio monobásico
Criostato	Leica	CM1510S
DAPI	Merck, Calbiochem	28718-90-3	Tinción nuclear, dilución: 1/1.000
DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065	Alto contenido de glucosa, piruvato
anti-cabra	Biotium	20016 o 20106 o 20048	Dilución: 1/1.000
burro anti-ratón	Biotium	20014 o 20105 o 20046	Dilución: 1/1.000
burro anti-conejo	Biotium	20015 o 20098 o 20047	Dilución: 1/1.000
EGF	Peprotech	315-09
FGF-2 (o bFGF)	Peprotech	100-18B
cabra anti-GFAP	Abcam	ab53554	Dilución: 1/500
cabra anti-SOX2	Santa Cruz Biotecnology	sc-17320	Dilución: 1/200
ratón anti-ID3	Santa Cruz Biotecnology	sc-56712	Dilución: 1/200
ratón anti-S100β	Sigma	S2532	Dilución: 1/200
Mowiol	Merck, Calbiochem		475904 Medio de montaje
N2 suplemento	ThermoFisher Scientific
Parafolmadehído	Merck	158127
Poly-D-Lisina	Merck, Millipore	A-003-E	Solución, 1,0 mg/mL
anti-Doublecortin (DCX)	Abcam	ab18723	Dilución: 1/500
conejo anti-PDGFR&alfa;	Abcam	ab51875	Dilución: 1/200
conejo anti-β- catenina	Abcam	ab16051	Dilución: 1/500
Triton X-100	Merck	X100
Microscopía y análisis de imágenes
Microscopio confocal	Leica	SP6 y SP8
Análisis de imágenes	NIH, EE. UU.	ImageJ
Análisis de imagen	Leica	LasX