La contractilidad de la actomiosina juega un papel importante en la morfogénesis celular y tisular. Sin embargo, es difícil manipular la contractilidad de la actomiosina in vivo de forma aguda. Este protocolo describe un sistema optogenético que inhibe rápidamente la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 en embriones de Drosophila , revelando la pérdida inmediata de la tensión epitelial después de la inactivación de la actomiosina in vivo.
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Artículo de método
Inhibición optogenética de la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 junto con la medición de la tensión epitelial en embriones de Drosophila
En este artículo
Resumen
Resumen
Las fuerzas contráctiles generadas por la actina y la miosina II no muscular ("contractilidad de la actomiosina") son críticas para los cambios morfológicos de las células y los tejidos a múltiples escalas de longitud, como la división celular, la migración celular, el plegamiento epitelial y la morfogénesis ramificada. Una comprensión profunda del papel de la contractilidad de la actomiosina en la morfogénesis requiere enfoques que permitan la rápida inactivación de la actomiosina, lo cual es difícil de lograr utilizando enfoques genéticos o farmacológicos convencionales. El protocolo presentado demuestra el uso de un sistema de dimerización optogenética basado en CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, para inhibir la contractilidad de la actomiosina en embriones de Drosophila con controles temporales y espaciales precisos. En este sistema, CRY2 se fusiona con la forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN), mientras que CIBN se ancla a la membrana plasmática. La dimerización mediada por luz azul de CRY2 y CIBN da lugar a una rápida translocación de Rho1DN desde el citoplasma a la membrana plasmática, donde inactiva la actomiosina mediante la inhibición endógena de Rho1. Además, este artículo presenta un protocolo detallado para acoplar la inactivación mediada por Opto-Rho1DN de la actomiosina con la ablación con láser para investigar el papel de la actomiosina en la generación de tensión epitelial durante la formación del surco ventral de Drosophila . Este protocolo se puede aplicar a muchos otros procesos morfológicos que involucran la contractilidad de la actomiosina en embriones de Drosophila con modificaciones mínimas. En general, esta herramienta optogenética es un enfoque poderoso para diseccionar la función de la contractilidad de la actomiosina en el control de la mecánica tisular durante la remodelación tisular dinámica.
Introducción
La contractilidad de la actomiosina, la fuerza contráctil ejercida por la miosina II no muscular (en adelante, «miosina») sobre la red de actina F, es una de las fuerzas más importantes en el cambio de la forma celular y en la morfogénesis a nivel tisular 1,2. Por ejemplo, la activación de la contractilidad de la actomiosina en el dominio apical de las células epiteliales da lugar a la constricción apical, lo que facilita una variedad de procesos morfogenéticos, incluido el plegamiento epitelial, la extrusión celular, la delaminación y la cicatrización de heridas 3,4,5,6,7
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Protocolo
1. Configurar el cruce genético y preparar la copa de recolección de óvulos
- Seleccionar moscas hembras (vírgenes) de la línea optogenética UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) en una almohadilla de CO2 bajo un microscopio estereoscópico y se estableció un cruce con moscas macho de la línea conductora materna GAL4 67 Sqh-mCherry; 15 E-cadherina-GFP.
NOTA: El 67 y el 15 representan la tubulina-GAL4 materna insertada en el segundo (II) y tercer (III) cromosomas, respectivamente52. La línea GAL4 utilizada en este protocolo también expresa la cadena ligera reguladora de miosina marcada con mCherry ....
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Resultados
En los embriones no estimulados sometidos a constricción apical, Sqh-mCherry se enriqueció en la región medioapical de las células mesodérmicas ventrales, mientras que CRY2-Rho1DN-mCherry fue citosólico (Figura 1A). La ablación con láser dentro del dominio de constricción condujo a un rápido retroceso tisular a lo largo del eje A-P (Figura 1B, C). En los embriones estimulados, la señal CRY2-Rho1DN-mCherry se localizó en la membrana plasmática, m.......
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Discusión
Este protocolo describe el uso combinado de la optogenética y la ablación con láser para sondear los cambios en la tensión tisular inmediatamente después de la inactivación de la contractilidad de la actomiosina. La herramienta optogenética descrita aquí aprovecha la forma negativa dominante de Rho1 (Rho1DN) para inhibir agudamente la contractilidad endógena de Rho1 y actomiosina dependiente de Rho1. La caracterización previa de Opto-Rho1DN en el contexto de la formación del surco ventral de Drosophila demostró .......
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Divulgaciones
Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Ann Lavanway por el apoyo a las imágenes. Los autores agradecen al laboratorio de Wieschaus y al laboratorio de De Renzis por compartir reactivos y al Bloomington Drosophila Stock Center por las poblaciones de moscas. Este estudio cuenta con el apoyo de NIGMS, ESI-MIRA R35GM128745 y la Subvención de Investigación Institucional de la Sociedad Americana Contra El Cáncer #IRG-82-003-33 a BH.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Plato con fondo de vidrio de 35 mm | MatTek | P35G-1.5-10-C | Se utiliza para la preparación de muestras |
| 60 mm y veces; 15 mm Placa de Petri con tapa | Falcon | 351007 | Se utiliza para la preparación de muestras |
| Tela negra para cubrir el microscopio | Online | NA | Se utiliza para evitar la estimulación de luz no deseada |
| Clorox Ultra Germicadal Bleach (8,25% de hipoclorito de sodio) | VWR | 10028-048 | Se utiliza para la decorinación de embriones |
| Almohadilla CO2 | Genesee Scientific | 59-114 | Se utiliza para la configuración cruzada |
| ddH2O | NA | NA Se | utiliza para la preparación de muestras |
| Pinzas Dumont Style 5 | VWR | 102091-654 | Se utiliza para la preparación |
| de muestras Herramienta para pestañas (hecha de marta roja pura pincel redondo #2) | VWR | 22940-834 | Se utiliza para la preparación de muestras |
| FluoView (Software) | Olympus | NA | Se utiliza para la adquisición de imágenes y la estimulación optogenética |
| Aceite de halocarbono 27 | Sigma Aldrich | H8773-100ML | Se utiliza para la visualización de la etapa embrionaria |
| ImageJ/FIJI | NIH | NA | Se utiliza para el análisis de imágenes |
| MATLAB | MathWorks | NA | Se utiliza para el análisis de imágenes |
| Estereoscopio Nikon SMZ-745 | Nikon | NA | Se utiliza para la preparación de muestras |
| Microscopio multifotónico Olympus FVMPE-RS con láseres ultrarrápidos de doble línea InSight DS para la obtención simultánea de imágenes multifotónicas de doble longitud de onda, un objetivo de inmersión en agua (XLPLN25XWMP2) de 25x/NA1.05 y una unidad de estimulación IR/VIS para fotoactivación/estimulación. Este sistema también está equipado con un filtro TRITC (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), y una unidad de iluminación de fluorescencia que emite luz blanca. | Olympus | NA | Se utiliza para la adquisición de imágenes y la estimulación optogenética |
| Caja de almacenamiento de polipropileno SP Bel-Art de 100 plazas (Caja negra a prueba de luz para la transferencia de muestras) | VWR | 30621-392 | Se utiliza para evitar la estimulación de la luz no deseada |
| Pantalla de filtro UV para FM1403 Fluores (Pantalla de plástico rojo anaranjado) | Boliópticos | FM14036151 | Se utiliza para evitar la estimulación |
| de luz no deseadaVITCHELO V800 Linterna frontal con luces LED blancas y rojas | Amazon | NA | Se utiliza para evitar la estimulación lumínica no deseada |
Referencias
- Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
- Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis.
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Reimpresiones y permisos
