Artículo de método

Un flujo de trabajo integrado para estudiar la arquitectura del genoma espacio-temporal centrada en el promotor en poblaciones celulares escasas

DOI:

10.3791/65316

⸱

21 de abril de 2023

 ,  ,  ,  , 
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La expresión génica está regulada por interacciones de promotores génicos con elementos reguladores distales. Aquí, describimos cómo la baja entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite la identificación de estas interacciones en tipos de células raras, que antes no se podían medir.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La transcripción de genes espaciotemporales está estrechamente regulada por elementos reguladores distales, como potenciadores y silenciadores, que dependen de la proximidad física con sus promotores de genes objetivo para controlar la transcripción. Aunque estos elementos reguladores son fáciles de identificar, sus genes diana son difíciles de predecir, ya que la mayoría de ellos son específicos de tipo celular y pueden estar separados por cientos de kilobases en la secuencia lineal del genoma, saltándose otros genes no diana. Durante varios años, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) ha sido el estándar de oro para la asociación de elementos reguladores distales a sus genes diana. Sin embargo, PCHi-C se basa en la disponibilidad de millones de células, lo que prohíbe el estudio de poblaciones de células raras, como las que se obtienen comúnmente de los tejidos primarios. Para superar esta limitación, se ha desarrollado Low input Capture Hi-C (liCHi-C), un método rentable y personalizable para identificar el repertorio de elementos reguladores distales que controlan cada gen del genoma. liCHi-C se basa en un marco experimental y computacional similar al PCHi-C, pero al emplear cambios mínimos en los tubos, modificar la concentración y los volúmenes del reactivo e intercambiar o eliminar pasos, representa una pérdida mínima de material durante la construcción de la biblioteca. En conjunto, liCHi-C permite el estudio de la regulación génica y la organización del genoma espaciotemporal en el contexto de la biología del desarrollo y la función celular.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La expresión génica temporal impulsa la diferenciación celular y, en última instancia, el desarrollo del organismo, y su alteración está estrechamente relacionada con una amplia plétora de enfermedades 1,2,3,4,5. La transcripción génica está finamente regulada por la acción de elementos reguladores, que pueden clasificarse como proximales (es decir, promotores génicos) y distales (por ejemplo, potenciadores o silenciadores), estos últimos frecuentemente ubicados lejos de sus genes diana e interactúan físicamente con ellos a través del bucle de cromatina para modular la expresión génica 6,7,8.

La identificación de regiones reguladoras distales en el genoma es un asunto ampliamente consensuado, ya que estas regiones albergan modificaciones específicas de histonas 9,10,11 y contienen motivos específicos de reconocimiento de factores de transcripción, actuando como plataformas de reclutamiento para ellos12,13,14. Además, en el caso de los potenciadores y superpotenciadores 15,16, también tienen baja ocupación nucleosómica 17,18 y se transcriben en eRNAs no codificantes 19,20.

No obstante, los genes diana de cada elemento regulador distal son más difíciles de predecir. La mayoría de las veces, las interacciones entre los elementos reguladores distales y sus objetivos son de tipo celular y específicas del estímulo 21,22, abarcan cientos de kilobases, puenteando sobre otros genes en cualquier dirección 23,24,25, e incluso pueden ubicarse dentro de regiones intrónicas de su gen objetivo u otros genes no intervinientes 26,27. Además, los elementos reguladores distales también pueden controlar más de un gen al mismo tiempo, y viceversa28,29. Esta complejidad posicional dificulta la identificación de asociaciones regulatorias entre ellos y, por lo tanto, la mayoría de los objetivos de cada elemento regulador en cada tipo de célula siguen siendo desconocidos.

Durante los últimos años, ha habido un auge significativo en el desarrollo de técnicas de captura de conformación cromosómica (3C) para estudiar las interacciones de la cromatina. El más utilizado de ellos, Hi-C, permite generar un mapa de todas las interacciones entre cada fragmento del genoma de una célula30. Sin embargo, para detectar interacciones significativas a nivel de fragmento de restricción, Hi-C se basa en la secuenciación ultraprofunda, lo que prohíbe su uso para estudiar rutinariamente el panorama regulatorio de genes individuales. Para superar esta limitación económica, han surgido varias técnicas 3C basadas en el enriquecimiento, como ChIA-PET31, HiChIP 32 y su contraparte HiCuT33 de baja entrada. Estas técnicas dependen del uso de anticuerpos para enriquecer las interacciones de todo el genoma mediadas por una proteína específica. No obstante, la característica única de estas técnicas 3C es también la pesadilla de su aplicación; Los usuarios cuentan con la disponibilidad de anticuerpos de alta calidad para la proteína de interés y no pueden comparar condiciones en las que la unión de la proteína es dinámica.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) es otra técnica 3C basada en el enriquecimiento que elude estas limitaciones34,35. Mediante el empleo de un sistema de enriquecimiento de sonda de ARN biotinilado, PCHi-C es capaz de generar bibliotecas de alta resolución de todo el genoma de regiones genómicas que interactúan con 28.650 promotores de genes anotados en humanos o 27.595 en ratones, también conocidos como interactoma promotor. Este enfoque permite detectar interacciones significativas de largo alcance a nivel de resolución de fragmentos de restricción de promotores activos e inactivos, y comparar robustamente los interactomas promotores entre cualquier condición independientemente de la dinámica de las modificaciones de histonas o la unión a proteínas. El PCHi-C ha sido ampliamente utilizado en los últimos años para identificar reorganizaciones del interactoma promotor durante la diferenciación celular 36,37, identificar el mecanismo de acción de los factores de transcripción38,39 y descubrir nuevos genes potenciales y vías desreguladas en la enfermedad por variantes no codificantes 40,41,42,43,44,45,46,47,48, junto con nuevas mutaciones no codificantes49,50. Además, con solo modificar el sistema de captura, esta técnica puede personalizarse de acuerdo con la pregunta biológica para interrogar cualquier interactoma (por ejemplo, el interactoma potenciador 51 o el interactoma de una colección de alteraciones no codificantes41,52).

Sin embargo, PCHi-C se basa en un mínimo de 20 millones de células para realizar la técnica, lo que impide el estudio de poblaciones celulares escasas como las que se utilizan a menudo en biología del desarrollo y aplicaciones clínicas. Por esta razón, hemos desarrollado Low input Capture Hi-C (liCHi-C), un nuevo método rentable y personalizable basado en el marco experimental de PCHi-C para generar interactomas promotores de alta resolución con entrada de baja celda. Al realizar el experimento con cambios mínimos de tubo, intercambiar o eliminar pasos del protocolo PCHi-C original, reducir drásticamente los volúmenes de reacción y modificar las concentraciones de reactivos, se maximiza la complejidad de la biblioteca y es posible generar bibliotecas de alta calidad con tan solo 50,000 celdas53.

La captura Hi-C de baja entrada (liCHi-C) ha sido comparada con PCHi-C y utilizada para dilucidar el recableado del interactoma promotor durante la diferenciación de células hematopoyéticas humanas, descubrir nuevos genes y vías potenciales asociadas a enfermedades desreguladas por alteraciones no codificantes y detectar anomalías cromosómicas53. El protocolo paso a paso y los diferentes controles de calidad a través de la técnica se detallan aquí hasta la generación final de las librerías y su análisis computacional.

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Protocolo

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Para garantizar una pérdida mínima de material, (1) trabaje con tubos y puntas de ADN de baja unión (consulte la Tabla de materiales), (2) coloque reactivos en la pared del tubo en lugar de introducir la punta dentro de la muestra y, (3) si es posible, mezcle la muestra por inversión en lugar de pipetear la muestra hacia arriba y hacia abajo, y gire hacia abajo después para recuperar la muestra.

1. Fijación celular

  1. Células que crecen en suspensión
    1. Cosechar de 50.000 a un millón de células y colocarlas en un tubo de ADN de baja unión de 1,5 ml.
      NOTA: Los tipos de células utilizados para el presente estudio se detallan en la sección de resultados representativos.
    2. Centrifugar las celdas durante 5 min a 600 x g (a 4 °C) utilizando una centrífuga de rotor de ángulo fijo y extraer el sobrenadante mediante pipeteo.
    3. Resuspender las células en 1 ml de RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) a temperatura ambiente.
    4. Agregue 143 μL de formaldehído al 16% sin metanol para alcanzar una concentración del 2% y mezcle.
    5. Incubar las células durante 10 minutos mientras gira a temperatura ambiente para fijar las células.
      NOTA: Trate de ser lo más preciso posible con la incubación de 10 minutos. La fijación excesiva o insuficiente de las células puede conducir a una disminución en la calidad de la biblioteca.
    6. Apague la reacción agregando 164 μL de glicina 1 M helada y mezcle. Incubar las celdas durante 5 minutos, girando a temperatura ambiente.
    7. Incubar aún más las células durante 15 minutos en hielo, mezclando por inversión cada ~ 5 minutos.
    8. Centrifugar las células durante 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) utilizando una centrífuga de rotor de ángulo fijo y retirar el sobrenadante.
    9. Lave las células resuspendiendo el gránulo en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada.
    10. Centrifugar las células durante 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) y retirar el sobrenadante.
      NOTA: Las celdas granuladas pueden congelarse rápidamente en nitrógeno líquido o hielo seco y almacenarse a -80 °C.
  2. Células adherentes
    1. Lave las células en la placa de cultivo con 1x PBS.
    2. Prepare suficiente RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y formaldehído al 2% sin metanol a temperatura ambiente para cubrir la placa de cultivo.
    3. Agregue los medios suplementados a la placa de cultivo con las células e incube durante 10 minutos, balanceando a temperatura ambiente para fijar las células.
      NOTA: Trate de ser lo más preciso posible con la incubación de 10 minutos. La fijación excesiva o insuficiente de las células puede conducir a una disminución en la calidad de la biblioteca.
    4. Apagar la reacción añadiendo 1 M de glicina hasta 0,125 M y mezclar balanceando.
    5. Incubar las celdas durante 5 minutos, balanceándolas a temperatura ambiente.
    6. Incubar las células durante 15 minutos a 4 °C, mezclando meciendo cada 3-4 min.
    7. Retire el medio y lave las células con 1x PBS frío.
    8. Raspa las células y transfiéralas a un tubo de baja unión de ADN de 1,5 ml. Limpie el plato de cultivo con 0.5-1 ml de PBS frío 1x.
    9. Centrifugar las células durante 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) utilizando una centrífuga de rotor de ángulo fijo y retirar el sobrenadante. Las células peletizadas pueden congelarse rápidamente en nitrógeno líquido o hielo seco y almacenarse a -80 °C.

2. Lisis y digestión

  1. Resuspender las células en 1 ml de tampón de lisis fría (Tabla 1) para interrumpir la membrana celular. La adición del tampón solo debería ser suficiente para resuspender las células, pero pueden resuspenderse aún más si es necesario mediante vórtice ligero.
  2. Incubar en hielo durante 30 min, mezclando por inversión cada ~5 min. Centrifugar los núcleos durante 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Resuspender los núcleos con 500 μL de tampón de restricción 2 frío 1.25x (ver Tabla de materiales).
  3. Centrifugar los núcleos durante 10 min a 1.000 x g (a 4 °C) y retirar el sobrenadante. Resuspender los núcleos en 179 μL del tampón de restricción 1.25x 2.
  4. Agregue 5.5 μL de dodecil sulfato de sodio al 10% (SDS; consulte la Tabla de materiales) y mezcle. Las células pueden formar grumos; Esto es normal y debe desglosarse tanto como sea posible mediante vórtices. Incubar la muestra durante 1 h a 37 °C en un termobloque, agitando a 950 rpm.
  5. Apague la SDS agregando 37.5 μL de Triton X-100 al 10% y mezcle. Incubar la muestra durante 1 h a 37 °C en un termobloque, agitando a 950 rpm.
  6. Digiera la cromatina agregando 7.5 μL de HindIII (100 U/μL; ver Tabla de materiales) y mezcle. Incubar la muestra durante la noche a 37 °C en un termobloque, agitando a 950 rpm.
  7. A la mañana siguiente, añadir 2,5 μL adicionales de HindIII (100 U/μL) e incubar la muestra durante 1 h a 37 °C en un termobloque, agitando a 950 rpm para asegurar una digestión adecuada de la cromatina.
    NOTA: Como parte de los controles de eficiencia digestiva (ver paso 5.1), transfiera el equivalente de 20.000 a 40.000 núcleos a otro tubo para representar el control no digerido. Después de la digestión, transfiera el mismo número de células a otro tubo nuevamente para representar el control digerido. Se recomienda probar la eficiencia de la digestión como un experimento separado si la disponibilidad del material de partida es escasa.

3. Ligadura y desenlace

  1. Enfríe la muestra en hielo. Prepare una mezcla maestra y agregue los siguientes reactivos para rellenar y biotinilar los voladizos del fragmento de restricción: 3 μL de tampón de restricción 10x 2, 1 μL de agua libre de nucleasa, 0.75 μL de 10 mM dCTP, 0.75 μL de 10 mM dTTP, 0.75 μL de 10 mM dGTP, 18.75 μL de 0.4 mM biotina-14-dATP y 5 μL de 5 U/μL de Klenow (ver Tabla de materiales). Incubar la muestra durante 75 min a 37 °C, mezclando por inversión cada ~15 min.
  2. Enfríe la muestra en hielo. Prepare una mezcla maestra y agregue los siguientes reactivos para ligar los extremos de ADN rellenos: 50 μL de tampón de ligadura 10x, 2.5 μL de albúmina sérica bovina (BSA) de 20 mg / ml de albúmina sérica bovina (BSA), 12.5 μL de 1 U/μL de ligasa de ADN T4 y 173 μL de agua libre de nucleasas (ver Tabla de materiales).
  3. Incubar la muestra durante 4-6 h a 16 °C, mezclando por inversión cada ~1 h. Además, incubar la muestra durante 30 minutos a temperatura ambiente. Desentrecruza la cromatina añadiendo 30 μL de proteinasa K de 10 mg/ml y mezcla. Incubar la muestra durante la noche a 65 °C.
  4. A la mañana siguiente, añadir 15 μL adicionales de 10 mg/ml de proteinasa K e incubar la muestra durante 2 h a 65 °C para garantizar una reticulación adecuada de la cromatina.

4. Purificación del ADN

  1. Enfriar la muestra a temperatura ambiente y transferirla a un tubo adecuado para la purificación de fenol-cloroformo.
  2. Añadir 1 volumen (545 μL) de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) para purificar el ADN y mezclar agitando vigorosamente.
  3. Centrifugar la muestra durante 5 min a 12.000 x g a temperatura ambiente y transferir la fase acuosa superior (545 μL) a un tubo de baja unión de ADN de 2 ml.
  4. Agregue los siguientes reactivos para precipitar el ADN: 1,362.5 μL de etanol 100% refrigerado a -20 ° C, 54.5 μL de acetato de sodio 3 M (pH 5.2) y 2 μL de glucógeno de 15 mg / ml como coprecipitante.
  5. Incubar durante 1 h a -80 °C o durante la noche a -20 °C.
  6. Centrifugar la muestra durante 30 min a 16.000-21.000 x g a 4 °C y retirar el sobrenadante. El pellet de ADN debe ser visible.
  7. Lave el pellet agregando 1 ml de etanol al 70%, vórtice y centrifugación durante 10 minutos a 16,000-21,000 x g a temperatura ambiente.
  8. Retire el sobrenadante y deje que el pellet se seque al aire. Resuspender el pellet de ADN en 130 μL de agua libre de nucleasas.
  9. Evaluar la concentración mediante cuantificación fluorométrica (ver Tabla de materiales). Almacene el material purificado de 3C a -20 °C durante varios meses antes de continuar con el protocolo.

5. Controles de calidad opcionales

  1. Evaluar la eficiencia digestiva. Realizar la desvinculación y purificación del ADN fenol:cloroformo, como se describió anteriormente, a los controles no digeridos y digeridos obtenidos en el paso 2.13. Resuspender el pellet de ADN en 10 μL de agua libre de nucleasas. Cuantificar la concentración y diluir el ADN obtenido, si es necesario, a 4 ng/μL.
  2. Realice PCR cuantitativa con 4 ng de ADN tanto de los controles no digeridos como de los digeridos, con cebadores que abarcan un locus de cromatina abierto con y sin un objetivo HindIII (consulte la Tabla 2 para el diseño del cebador). Calcule la eficiencia de la digestión siguiendo un informe publicado anteriormente35.
    NOTA: La eficiencia de la ligadura se calcula como un porcentaje utilizando la fórmula: digestión (%) = 100 -100/(2^[(Ct digerido con HindIII - Ctdigested without HindIII) - (Ct no digerido con HindIII - Ct no digerido sin HindIII)]) (ver Tabla 3), que tiene en cuenta el diferencial de los diferentes Cts obtenidos para cada par de cebadores en los controles no digeridos y digeridos.
  3. Evalúe la sensibilidad de la detección de interacción mediante la realización de la reacción en cadena de la polimerasa convencional (PCR) (0,2 mM dNTP, 0,4 μm ambos cebadores F + R, 0,1 y U/μL de polimerasa de arranque en caliente), con cebadores que abarcan interacciones invariantes celulares de largo y corto alcance (consulte la Tabla 2 para el diseño del cebador). Utilice 50-100 ng de material 3C (para interacciones de corto y largo alcance, respectivamente) y amplíe utilizando las siguientes condiciones: 98 °C durante 15 min, seguido de 37 ciclos de 98 °C durante 30 s, 60 °C durante 1 min, 72 °C durante 1 min, y terminar a 72 °C durante 10 min. Mantener a 4 °C.
    NOTA: Si la cantidad de ADN obtenida es inferior a 2 μg, compruebe únicamente una interacción de largo y corto alcance en lugar de todo el panel de interacción.
  4. Ejecute el producto en 1x tris-borato-EDTA (TBE) utilizando gel de agarosa al 1,6% y busque la presencia del amplificador PCR correspondiente54.
    NOTA: Debido al impredecible "cortar y pegar" del genoma, pueden aparecer bandas inespecíficas. Siempre que se observe el tamaño de banda correcto, se cuenta como correcto.
  5. Evalúe la eficiencia del relleno y la ligadura de biotina digiriendo diferencialmente un producto de PCR de corto alcance con HindIII, NheI (consulte la Tabla de materiales), ambas enzimas o ninguna (agua) y ejecutando el producto en un gel de agarosa 1x TBE al 1,6%. Un relleno y ligadura correctos eliminan el objetivo HindIII anterior y crean un nuevo objetivo NheI, por lo que el amplicón debe cortarse solo en presencia de NheI.
    NOTA: Para minimizar la pérdida de material, recupere 2,5 μL de un producto de PCR de corto alcance de los controles de interacción y vuelva a amplificarlo cinco veces para realizar los controles de relleno y ligadura.

6. Sonicación

  1. Transfiera los 130 μL de la muestra (rellene con agua libre de nucleasas si se usó algo para los controles) a una cubeta adecuada para la sonicación.
  2. Configure un sonicador de baño de agua y un sonicate utilizando los siguientes parámetros (optimizados para el modelo y las cubetas descritas en la Tabla de materiales): factor de trabajo: 20%; potencia de incidencia máxima: 50; ciclos por ráfaga: 200; Tiempo: 65 s; y rango de temperatura: 6-10 °C (óptimo 8 °C).
  3. Transfiera la muestra a un nuevo tubo de baja unión de ADN de 1,5 ml.

7. Reparación final

  1. Prepare una mezcla maestra y agregue los siguientes reactivos para reparar los extremos desiguales de los fragmentos de ADN creados durante la sonicación: 18 μL de tampón de ligadura 10x, 18 μL de mezcla dNTP de 2.5 mM cada uno, 6.5 μL de 3 U/μL T4 ADN polimerasa, 6.5 μL de 10 U/μL T4 PNK y 1.3 μL de 5 U/μL Klenow (ver Tabla de materiales).
  2. Incubar la muestra durante 30 min a 20 °C y completar con tampón Tris-low EDTA (TLE) (ver Tabla 1) hasta 300 μL.

8. Extracción de biotina

  1. Transfiera 150 μL de perlas de estreptavidina C1 (consulte la Tabla de materiales) por muestra a un tubo de 1.5 ml, colóquelas en un imán de tubo de 1.5 ml y espere de 2 a 3 minutos o hasta que todas las perlas estén pegadas a la pared. Retire el sobrenadante, dejando las cuentas atrás.
  2. Lave las perlas con 400 μL de 1x tampón Tween (TB; ver Tabla 1). Para lavar las cuentas, agregue el tampón y vuelva a suspenderlas mediante un vórtice suave. Coloque el tubo de nuevo en el imán y espere 2-3 minutos o hasta que todas las cuentas estén pegadas a la pared. Retire el sobrenadante, dejando las cuentas atrás.
  3. Lave las perlas con 300 μL de 1x sin tampón Tween (NTB; ver Tabla 1). Resuspender las perlas en 300 μL de 2x NTB (ver Tabla 1).
    NOTA: Las perlas pueden formar una capa polvorienta alrededor de la pared del tubo al lavarlas con tampones sin detergente. Esto es normal y no afecta el resultado del protocolo.
  4. Combinar estos 300 μL de perlas en 2x NTB con los 300 μL de la muestra. Incubar durante 15 minutos, girando a temperatura ambiente para extraer los fragmentos de ADN informativos con biotina. La biblioteca ahora está pegada a las cuentas de estreptavidina C1.
  5. Lave las perlas con 400 μL de 1x NTB. Lave las perlas con 100 μL de tampón TLE y luego vuelva a suspenderlas en 35.7 μL de tampón TLE.

9. dATP-tailing, ligadura del adaptador y amplificación por PCR

  1. Preparar una mezcla maestra y añadir los siguientes reactivos a la muestra para dATP-cola los extremos de los fragmentos de ADN reparados: 5 μL de tampón de restricción 10x 2, 2,3 μL de 10 mM dATP, y 7 μL de 5 U/μL Klenow exo-. Incubar la muestra durante 30 min a 37 °C.
  2. Inactivar Klenow exo- incubando la muestra durante 10 min a 65 °C. Enfríe la muestra en hielo. Lave las perlas con 300 μL de 1x TB. Lave las perlas con 300 μL de 1x NTB.
  3. Lave las perlas con 100 μL de 1x tampón de ligadura y luego resuspenda en 50 μL de 1x tampón de ligadura. Agregue 4 μL de mezcla adaptadora prerecocida de 15 μM (ver Tabla 2) y 1 μL de 2,000 U/μL de ADN ligasa T4 (ver Tabla de materiales) a la muestra.
  4. Incubar durante 2 h a temperatura ambiente. Lave las perlas con 400 μL de 1x TB. Lave las perlas con 200 μL de 1x NTB. Lave las perlas con 100 μl de 1x tampón de restricción 2.
  5. Lave las perlas con 50 μL de 1x tampón de restricción 2 y luego vuelva a suspenderlas en 50 μL de 1x tampón de restricción 2.
  6. Mezcle los siguientes reactivos para preparar la reacción de PCR para amplificar la biblioteca: 50 μL de perlas con la biblioteca, 250 μL de 2x mezcla maestra de PCR con enzima, 12 μL de cebadores F + R (25 μM cada uno; ver Tabla 2) y 188 μL de agua libre de nucleasas.
  7. Realizar la PCR con las siguientes condiciones (dividir la mezcla de reactivos de PCR en reacciones de 50 μL): 98 °C durante 40 s, seguido de ciclos X de 98 °C durante 10 s, 65 °C durante 30 s, 72 °C durante 30 s y terminar a 72 °C durante 10 min. Mantener a 4 °C.
    NOTA: Utilice el siguiente número de ciclos como punto de partida para optimizar el protocolo en celdas diploides con el objetivo de una salida de 500-1.000 ng antes de la captura de la biblioteca: un millón de celdas para ocho ciclos; 250.000 células para 10 ciclos; 50.000 células para 12 ciclos.
  8. Agrupe todas las reacciones de 50 μL de la misma muestra en un tubo de baja unión de ADN de 1,5 ml, colóquelo en un imán de tubo de 1,5 ml y espere 2-3 minutos o hasta que todas las perlas estén pegadas a la pared.
  9. Transfiera el sobrenadante que contiene la biblioteca (500 μL) a un nuevo tubo de baja unión de ADN de 1,5 ml. Rellene con tampón TLE a 500 μL si se pierde parte del sobrenadante. Las perlas de estreptavidina C1 ya no son necesarias.
  10. Realice una selección de doble cara55 utilizando purificación de perlas paramagnéticas (volumen 0.4-1). Esto permite la eliminación selectiva de fragmentos demasiado grandes (>1.000 pb) y demasiado pequeños o cebadores de PCR (<200 pb), dependiendo de la concentración de polietilenglicol y sal de las perlas paramagnéticas añadidas.
  11. Agregue 200 μL (0.4 volúmenes) de cuentas de stock a la biblioteca y mezcle por vórtice. Incubar durante 10 min, girando a temperatura ambiente.
  12. Colóquelo en un imán, espere 2-3 minutos o hasta que todas las perlas estén pegadas a la pared y transfiera el sobrenadante que contiene la biblioteca (sin los fragmentos más grandes) a un nuevo tubo de baja unión de ADN de 1,5 ml.
  13. Concentre las perlas tomando 750 μL de perlas de stock, colóquelas en un tubo de 1.5 ml en un imán, espere 2-3 min o hasta que todas las perlas estén pegadas a la pared, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas mediante un vórtice en 300 μL de cuentas nuevas.
  14. Añadir estos 300 μL de perlas concentradas a la muestra (1 volumen) y mezclar por vórtice. Incubar durante 10 min, girando a temperatura ambiente. Colóquelo en un imán, espere 2-3 minutos o hasta que todas las perlas estén pegadas a la pared y retire el sobrenadante (que contiene los fragmentos más pequeños y los cebadores de PCR).
  15. Lave las perlas tres veces con 1 ml de etanol al 70%. Para hacer esto, agregue el etanol mientras el tubo con las perlas todavía está en el imán, tratando de no molestar las perlas, y espere 30-60 s. Después, retire el sobrenadante sin alterar las cuentas.
  16. Deje que las perlas se sequen al aire y resuspenda en 21 μL de tampón TLE mediante vórtice.
    NOTA: El secado excesivo de las perlas puede reducir el rendimiento al eluyir el ADN. Trate de resuspenderlos en tampón TLE inmediatamente después de que ya no estén "brillantes" del etanol.
  17. Incubar la muestra durante 10 min a 37 °C en un termobloque para eluyer la biblioteca de las cuentas. Coloque el tubo en un imán y transfiera el sobrenadante que contiene la biblioteca a un nuevo tubo de baja unión de ADN de 1,5 ml.
  18. Cuantificar el tamaño y la concentración mediante electroforesis automatizada (ver Tabla de materiales). El material Hi-C purificado se puede almacenar a -20 °C durante varios meses antes de continuar con el protocolo.

10. Captura de la biblioteca

  1. Trabajar con 500-1.000 ng de la biblioteca. Concentrar la biblioteca secando el ADN usando un concentrador de vacío y resuspendiendo el material en 3.4 μL de agua libre de nucleasas.
  2. Agregue los siguientes bloqueadores del kit de enriquecimiento objetivo (consulte la Tabla de materiales) a la muestra: 2,5 μL del bloqueador 1, 2,5 μL del bloqueador 2 y 0,6 μL del oligobloqueante personalizado para los adaptadores.
  3. Vuelva a suspender completamente, transfiera la solución a una tira de PCR de 0,2 ml e incubar en un termociclador durante 5 min a 95 °C, seguido de 5 min a 65 °C con una tapa calentada. Dejar el tubo incubando a 65 °C.
  4. Preparar la solución de hibridación combinando los siguientes reactivos del kit de enriquecimiento objetivo (ver Tabla de materiales) por muestra (13 μL). Mantener en el banco a temperatura ambiente: 6,63 μL de Hyb 1, 0,27 μL de Hyb 2, 2,65 μL de Hyb 3 y 3,45 μL de Hyb 4.
  5. Diluir 0,5 μL de bloque de RNasa del kit de enriquecimiento objetivo con 1,5 μL de agua libre de nucleasa por muestra. Descongele 5 μL del ARN biotinilado por muestra en hielo y añádale los 2 μL del bloque de RNasa diluido. Mantener en el banco a temperatura ambiente.
  6. Añadir los 13 μL de la solución de hibridación a los 7 μL del ARN biotinilado con RNasa y mezclar bien.
  7. Mientras esté en el termociclador a 65 °C, transfiera la solución de hibridación con el ARN biotinilado (20 μL) a la biblioteca bloqueada. Cierre firmemente la tapa del tubo e incubar en el termociclador durante la noche a 65 °C.
    NOTA: Para minimizar la evaporación de la muestra (que puede conducir a una hibridación subóptima de ARN-ADN) al realizar varias muestras al mismo tiempo, utilice una pipeta multicanal para transferir el ARN biotinilado a cada biblioteca al mismo tiempo.

11. Extracción de biotina y amplificación por PCR

  1. Transfiera 50 μL de perlas de estreptavidina T1 por muestra a un tubo de baja unión de ADN de 1.5 ml, colóquelas en un imán de tubo de 1.5 ml y espere 2-3 minutos o hasta que todas las perlas estén pegadas a la pared. Retire el sobrenadante, dejando las cuentas atrás. Lave las perlas tres veces con 200 μL del tampón de unión del kit de enriquecimiento objetivo.
  2. Resuspender las perlas en 200 μL de tampón de unión. Mientras esté en el termociclador a 65 °C, transfiera la muestra a las perlas de estreptavidina T1 resuspendidas e incube durante 30 minutos, girando a temperatura ambiente.
  3. Lave las perlas con 200 μL de tampón de lavado 1 del kit de enriquecimiento objetivo. Incubar durante 15 min, girando a temperatura ambiente. Lavar las perlas tres veces con 200 μL de tampón de lavado 2 del kit de enriquecimiento objetivo calentado a 65 °C. Incubar durante 10 min a 65 °C en un termobloque, agitando a 300 rpm entre lavados.
  4. Lave las perlas con 200 μL de 1x tampón de restricción 2 y luego vuelva a suspenderlas en 30 μL de 1x tampón de restricción 2.
  5. Mezcle los siguientes reactivos para preparar la reacción de PCR para amplificar la biblioteca: 30 μL de perlas con la biblioteca, 150 μL de 2x PCR mastermix con enzima, 7.2 μL de cebadores F + R (25 μM cada uno; ver Tabla 2) y 112.8 μL de agua libre de nucleasas.
  6. Realizar la PCR con las siguientes condiciones (dividir la mezcla de reactivos de PCR en reacciones de 50 μL): 98 °C durante 40 s, seguido de cuatro ciclos de 98 °C durante 10 s, 65 °C durante 30 s, 72 °C durante 30 s y terminar con 72 °C durante 10 min. Mantener a 4 °C.
  7. Agrupe todas las reacciones de 50 μL de la misma muestra en un tubo de baja unión de ADN de 1,5 ml, colóquelo en un imán de tubo de 1,5 ml y espere 2-3 minutos o hasta que todas las perlas estén pegadas a la pared.
  8. Transfiera el sobrenadante que contiene la biblioteca (300 μL) a un nuevo tubo de baja unión de ADN de 1,5 ml. Rellene con tampón TLE a 300 μL si se perdió parte del sobrenadante. Las perlas de estreptavidina T1 ya no son necesarias.
  9. Realice una purificación de ADN utilizando perlas paramagnéticas (0,9 volúmenes; consulte la Tabla de materiales). Agregue 270 μL de perlas de caldo a la muestra y mezcle por vórtice.
  10. Incubar durante 10 min, girando a temperatura ambiente.
  11. Colóquelo en un imán, espere 2-3 minutos o hasta que todas las cuentas estén pegadas a la pared y retire el sobrenadante.
  12. Lave las perlas tres veces con 1 ml de etanol al 70%. Para hacer esto, agregue el etanol mientras el tubo con las perlas todavía está en el imán, tratando de no molestar las perlas, y espere 30-60 s. Después, retire el sobrenadante sin alterar las cuentas.
  13. Deje que las perlas se sequen al aire y resuspenda en 21 μL de tampón TLE mediante vórtice.
    NOTA: El secado excesivo de las perlas puede reducir el rendimiento al eluyir el ADN. Trate de resuspenderlos en tampón TLE inmediatamente después de que ya no estén "brillantes" del etanol.
  14. Incubar la muestra durante 10 min a 37 °C en un termobloque para eluyer la biblioteca de las cuentas.
  15. Coloque el tubo en un imán y transfiera el sobrenadante que contiene la biblioteca a un nuevo tubo de baja unión de ADN de 1,5 ml.
  16. Cuantificar el tamaño y la concentración mediante electroforesis automatizada.

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Resultados

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liCHi-C ofrece la posibilidad de generar bibliotecas de interactoma promotor de todo el genoma de alta calidad y resolución con tan solo 50.000 células53. Esto se logra – además de la reducción drástica de los volúmenes de reacción y el uso de artículos de plástico de baja unión de ADN en todo el protocolo – eliminando pasos innecesarios del protocolo original, en los que se producen pérdidas significativas de material. Estos incluyen la purificación de fenol después de la desinterconexión, la eli...

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Discusión

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liCHi-C ofrece la capacidad de generar bibliotecas de interactoma promotor de alta resolución utilizando un marco experimental similar al de PCHi-C, pero con un número de células muy reducido. Esto se logra en gran medida mediante la eliminación de pasos innecesarios, como la purificación de fenol y la eliminación de biotina. En el protocolo clásico Hi-C de ligadura en núcleo57 y su posterior técnica derivada PCHi-C, la biotina se elimina de fragmentos de restricción no ligados para evitar extraer...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos al resto de miembros del laboratorio Javierre sus comentarios sobre el manuscrito. Agradecemos al Programa CERCA, a la Generalitat de Catalunya y a la Fundación Josep Carreras por el apoyo institucional. Este trabajo ha sido financiado por FEDER/Ministerio de Ciencia e Innovación (RTI2018-094788-A-I00), la Asociación Europea de Hematología (4823998) y la Asociación Española contra el Cáncer (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ está financiado por el proyecto Junior Leader de la Fundación Bancaria La Caixa (LCF/BQ/PI19/11690001), LR está financiado por una beca AGAUR FI (2019FI-B00017) y LT-D está financiado por una beca FPI (PRE2019-088005). Agradecemos el apoyo del programa de doctorado en bioquímica y biología molecular de la Universitat Autònoma de Barcelona. Ninguno de los financiadores participó en ningún momento en el diseño experimental o la redacción del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,4 mM Biotina-14-dATPInvitrogen19524-016
0,5 M EDTA pH 8,0InvitrogenAM9260G
1 M Tris pH 8,0InvitrogenAM9855G
10x NEBuffer 2New England BiolabsB7002SReferenciado como tampón de restricción 2 en el manuscrito
10x PBSFisher ScientificBP3994
10x Tampón de reacción de ADN ligasa T4New England BiolabsB0202S
Solución de formaldehído al 16% (p/v), sin metanolThermo Scientific28908
20 mg/mL Albúmina sérica bovinaNew England BiolabsB9000S
5 M NaClInvitrogenAM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Tubos de luzQiuantabio 2302820Para la purificación de fenol-cloroformo en la sección 4 (purificación de ADN). Los tubos de gel Phase Lock son un tipo comercial de tubos especialmente diseñados para maximizar la recuperación de ADN después de las purificaciones de fenol-cloroformo, evitando al mismo tiempo el arrastre de contaminantes en la fase orgánica al contener una resina de densidad intermedia que se deposita entre la fase orgánica y acuosa y las aísla. Los tubos de PLG deben centrifugarse a 12.000 x g durante 30 s antes de su uso para asegurarse de que la resina esté bien colocada en el fondo del tubo
Adaptadores y cebadores de PCR para la amplificación de bibliotecasTecnologías de ADNintegradas:se compran como cebadores individuales con purificación PAGE para
NGS Raspadores de célulasNunc179693O cualquier otra marca
Centrífuga (rotor de ángulo fijo para tubos de 1,5 mL)Cualquier marca
Paquete CHiCAGO R1.14.0
Perlas CleanNGSCleanNACNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTPPromegaU120A, U121A, U122A, U123AO cualquier otra marca
DNA LoBind tubo, 1,5 mLEppendorf30108051
DNA LoBind tubo, 2mL Eppendorf30108078
ADN polimerasa I grande (Klenow) fragmento 5000 unidades/mLNew England BiolabsM0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beadsInvitrogen65002Para la extracción de biotina de la biblioteca precapturada en la sección 8 (extracción de biotina)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beadsInvitrogen65602Para la extracción de biotina de la biblioteca posterior a la captura en la sección 11 (extracción de biotina y amplificación por PCR)
DynaMag-2Invitrogen12321DO cualquier otro imán adecuado para tubo de 1,5 mlL
Etanol absolutoVWR20821.321
FBS, calificadoGibco10270-106O cualquier otra marca
GlycineFisher BioReagentsBP381-1
GlycoBlue CoprecipitanteInvitrogenAM9515Utilizado para la coprecipitación de ADN en la sección 4 (purificación de ADN)
HiCUP0.8.2
HindIII, 100 U/µ LNew England BiolabsR0104T
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50ML
Klenow EXO- 5000 unidades/mLNew England BiolabsM0212L
Puntas de filtro de baja retención ( 10 y micro; L, 20 y micro; L, 200 y micro; L y 1000 µ L)ZeroTipPMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Ultrasonido focalizadoCovaris500295
Micro TUBE AFA Fiber Tapón a presión precortado 6 viales de 16 mmCovaris520045Para sonicación en sección 6 (sonicación)
NheI-HF, 100 U/µ LNew England BiolabsR3131M
Agua de grado de biología molecular sin nucleasasSigma-AldrichW4502
Imprimadores de PCR para controles de calidadIntegrated DNATechnologies-PCR
strips  y tapasAgilent Technologies410022, 401425
fenol: Cloroformo: Alcohol isoamílico 25:24:1, saturado con 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTASigma-AldrichP3803
Phusion  Mezcla maestra de PCR de alta fidelidad con tampón HFNew England BiolabsM0531LPara la amplificación de la biblioteca en las secciones 9 (dATP-tailing, ligadura de adaptadores y amplificación por PCR)
y 11 (extracción de biotina y amplificación por PCR)
Cóctel de inhibidores de la proteasa (sin EDTA)Roche
Proteinasa K, recombinante, Grado PCRRoche3115836001
Qubit 1x dsDNA Kit de alta sensibilidadInvitrogenQ33230Para la cuantificación de ADN después de la precipitación en la sección 4 (purificación de ADN)
Tubos de ensayo QubitInvitrogenQ32856
tampón rCutsmartNew England BiolabsB6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAXGibco61870-010O cualquier otra marca
SDS - Solución 10% para biología molecularPanReac AppliChemA0676
Acetato de sodio pH 5.2Sigma-AldrichS7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb libraryAgilent Technologies5190-4831Ratón diseñado a medida o sistema de captura humano, utilizado para la captura
SureSelect Target Enrichment Box 1Agilent Technologies5190-8645Utilizado para la captura
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full AdapterAgilent Technologies931107Utilizado para la captura
T4 ADN ligasa 1 U/µ LInvitrogen15224025Para ligadura en la sección 3 (ligadura y dereticulación)
T4 ADN ligasa 2000000/mLNew England BiolabsM0202TPara ligadura en la sección 9 (cola de dATP, ligadura de adaptador y amplificación por PCR)
ADN polimerasa T4 3000 unidades/mLNew England BiolabsM0203L
T4 PNK 10000 unidades/mLInstrumento New England BiolabsM0201L
Tapestation 4200Agilent TechnologiesFor automated electroforesis in section 9 (dATP-tailing, ligadura de adaptadores y amplificación por PCR) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Cualquier otro sistema de electroforesis automatizado es válido
Reactivos TapestationAgilent Technologies5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,Para electroforesis automatizada en la sección 9 (cola de dATP, ligadura de adaptadores y amplificación por PCR) y
sección 11 (Extracción de biotina y amplificación por PCR). Cualquier otro sistema de electroforesis automatizado es válido
Triton X-100 para biología molecularPanReac AppliChemA4975
Tween 20Sigma-AldrichP9416-50ML
11873580001

Referencias

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