Method Article

Evaluación del impacto de un nuevo sistema de procesamiento de celdas de enfriamiento en la instalación de aislamiento de celdas de islotes

DOI:

10.3791/65321

⸱

August 11th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qatar Metabolic Institute, Hamad Medical Corporation, 2Univ-Lille, Inserm, CHU Lille, Institute Pasteur Lille, U1190 - EGID F-59000 Lille, 3Department of Nephrology, Leiden University Medical Center (LUMC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo aquí describe un sistema de procesador de celda de enfriamiento personalizado que es compatible con una sala limpia de buenas prácticas de fabricación (GMP) para mejorar el posprocesamiento de la viabilidad de la celda.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El equipo de terapia celular estándar, incluido el procesador de células de referencia para purificar islotes humanos para el trasplante clínico, rara vez se refrigera, lo que podría exponer las células a temperaturas elevadas durante la etapa de centrifugación. Los sistemas de enfriamiento personalizados tienen un beneficio directo en la viabilidad y función de los islotes humanos. El presente estudio fue diseñado para probar la efectividad de un sistema de procesador de celdas refrigeradas recientemente desarrollado y fácilmente disponible que requiere modificaciones mínimas y para evaluar su impacto en la viabilidad de las celdas humanas y el entorno de la sala limpia GMP. El sistema de enfriamiento, un intercambiador de calor refrigerado mecánicamente a -30 °C, se utilizó para suministrar aire seco de grado médico enfriado al recipiente del procesador de celdas a través de un orificio perforado en la tapa de la centrífuga. Con la disponibilidad limitada de donantes de páncreas en Qatar, la validación del sistema se realizó con purificación continua en gradiente de densidad de la capa de leucemia de médula ósea humana agrupada. La esterilidad, la turbulencia y el recuento de partículas se midieron en ambientes de sala limpia de clase C y clase B. No se desarrollaron turbulencias alrededor del procesador de celda enfriada y no se generaron partículas en el aire de 0,5 μm y 5 μm en exceso según las normas GMP de sala limpia. Al principio y al final de las etapas de recolección, la temperatura aumentó respectivamente a 21,50 °C ± 0,34 °C y 21,93 °C ± 0,20 °C en el procesador de celda no refrigerada y a solo 10,9 °C ± 0,17 °C y 11,16 °C ± 0,35 °C en el procesador de celda refrigerada (p <0,05). El procesador de celda refrigerada mejoró la recuperación (98%) de la fracción de celda mononuclear y la viabilidad (100% ± 2%) del posprocesamiento. El nuevo sistema de refrigeración reduce eficazmente el calor producido por el procesador de celdas sin tener impacto de partículas en el entorno de la sala limpia GMP. El procesador de celda refrigerada descrito aquí es un método económico (16.000 dólares sin incluir impuestos, despacho de aduanas y transporte) y mínimamente invasivo para proporcionar una refrigeración robusta. Actualmente, esta tecnología en la instalación de terapia celular GMP se está aplicando al aislamiento y trasplante de células de islotes humanos para el programa clínico.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El trasplante de islotes para la diabetes tipo 1 grave puede restaurar la secreción endógena de insulina y se ha convertido en el estándar de atención en varios países1. El aislamiento de islotes es un procedimiento de varios pasos que incluye la digestión enzimática y mecánica tibia del páncreas, seguida de fases enfriadas para la recuperación del tejido digerido y la purificación de los islotes con gradientes de densidad continuos o discontinuos en un procesador celular. El enfriamiento rápido ralentiza la fase de digestión enzimática y protege los islotes de las enzimas digestivas liberadas por las células acinares contaminantes. El procesador celular fue diseñado originalmente para separar los componentes celulares de la sangre a temperatura ambiente2. Fue reutilizado para purificar los islotes pancreáticos humanos de Langerhans en 19893. Durante tres décadas, los islotes humanos han sido purificados para ensayos clínicos y, más recientemente, para el tratamiento estándar, ya sea en un procesador de células con gradientes discontinuos4 o gradientes de densidad continuos1 hecho con un creador de gradientes1 o un mezclador equivalente operado por ordenador5,6,7. Otros grupos han informado de la purificación de islotes de grandes mamíferos y humanos utilizando grandes botellas de plástico cilíndricas8,7,9, lo que mejoró sustancialmente la eficacia de la purificación y la calidad de los islotes.

De hecho, considerando el estándar de oro para purificar islotes humanos para trasplantes clínicos10,11, el procesador de células fabricado estaba sin refrigeración. Como consecuencia directa de la falta de refrigeración, los islotes estuvieron expuestos al aumento de las temperaturas durante la etapa de purificación. Durante la centrifugación, se produce un aumento incontrolado de la temperatura debido a la fricción mecánica del rotor12,13. Los procesadores celulares se adaptaron con un sistema de enfriamiento en centros de aislamiento de islotes que aumentó estadísticamente la secreción de insulina inducida por glucosa y la viabilidad celular, confirmando la ventaja de mantener los islotes pancreáticos a bajas temperaturas durante el procedimiento de purificación14,15.

Cabe señalar que a finales de la década de 1980, se construyeron 10 prototipos refrigerados para reducir el daño de los islotes durante la purificación en gradiente de densidad, pero no recibieron más atención. Los prototipos de procesadores de celdas se basaron en el enfriamiento del huso y la cuba con polietilenglicol refrigerado. En particular, las soluciones de purificación de islotes, incluidas las soluciones de preservación de órganos y los gradientes de densidad de polisacáridos, pueden ser perjudiciales para la viabilidad de los islotes cuando se utilizan a temperatura ambiente o por encima de ella16,17,18. Se evaluó una comparación de diferentes estrategias de enfriamiento del procesador de celdas para la purificación de celdas de islotes versus el procesador de celdas no refrigerado original para combatir el aumento incontrolado de temperatura que ocurre debido a la fricción del rotor. Se han hecho varios intentos para enfriar el procesador celular durante la purificación de los islotes humanos. El procesador de celdas puede alojarse temporal o permanentemente en una cámara frigorífica especialmente diseñada para mantener una temperatura de 0-8 °C19 durante la centrifugación en gradiente que se utiliza actualmente en los centros de aislamiento de islotes de la Universidad de Illinois Chicago19, Universidad de Miami14, University of Oxford facilities15y la Universidad de San Francisco (la unidad de enfriamiento personalizada encierra el procesador de celdas). Otra modificación incluye el enfriamiento del núcleo del eje del procesador de celdas con un sistema de enfriamiento que utiliza enfriamiento de nitrógeno líquido controlado electrónicamente en Ginebra, Suecia y la República Checa15,19. Otra alternativa a mediados de 2000 fue la refrigeración del núcleo del procesador de la célula con una unidad de aire acondicionado12 o mediante la refrigeración líquida del eje en la Universidad de Lille.

Las modificaciones de enfriamiento del procesador de celdas no están fácilmente disponibles y conllevan riesgos (humedad, acumulación de condensación) dentro de los entornos de salas limpias GMP, incluida la pérdida de garantía y la negativa del constructor a reparar la máquina. En consecuencia, algunos centros de islotes, incluyendo Milán, Italia, Oslo, Noruega y Edimburgo, Escocia, no utilizan un sistema de enfriamiento para los procesadores de celdas durante el proceso de purificación de islotes15.

El estudio actual fue diseñado para probar la efectividad de un refrigerador fácilmente disponible recientemente desarrollado junto con un sistema de procesador de celdas mínimamente modificado. Brevemente, el enfriador a base de aire descrito aquí es un intercambiador de calor refrigerado mecánicamente que controla la temperatura de 1 pie cúbico estándar por minuto (SCFM) de gas seco entre -40 °C y -100 °C. Este sistema de refrigeración requiere un suministro de aire médico seco. El aire fluirá a través de la línea y el intercambiador de calor y saldrá a través de la boquilla (7,9 mm). Un calentador ubicado dentro de la boquilla suministra calor para controlar la temperatura de la corriente de aire. Se compró una cubierta de centrífuga de plástico sólido de repuesto y se hicieron modificaciones mínimas. Se perforó un orificio de 13,3 mm de diámetro en la tapa y se suministró aire enfriado desde la boquilla del enfriador al procesador de celdas a través del orificio en la tapa de la centrífuga. El aire medicinal enfriado se inyectó dentro del recipiente de centrifugación del procesador de celdas con control constante de la temperatura de los líquidos o gradientes de densidad.

Evaluamos el rendimiento técnico del procesador de celda refrigerada y el impacto del elemento de refrigeración en el entorno de la sala limpia GMP. El objetivo principal era lograr una temperatura robustamente baja (<10 °C) durante la purificación de los islotes humanos para preservar la viabilidad. Utilizando una separación de la densidad de la capa leucocitaria como proxy del aislamiento de los islotes, determinamos la eficacia de este protocolo de enfriamiento en la viabilidad celular.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo utilizó sangre entera desechada que no es apta para su uso según las pautas de descarte de la institución. La aprobación del IRB y el consentimiento informado no son aplicables.

1. Configuración del procesador de celda refrigerada

NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en un entorno de sala limpia, y el personal debe respetar los procedimientos de ropa de sala limpia.

  1. Compra de equipos
    1. Compra una tapa de plexiglás de repuesto. Compre el sistema de equipo de enfriamiento, el enfriador con controlador de temperatura de flujo de gas refrigerado mecánicamente, el secador de aire, el regulador de presión y flujo, y la garantía (opcional). Ver Tabla de Materiales para referencias.
      NOTA: El costo total es de $16,133 sin gastos de envío ni aduanas.
    2. Pida aire seco medicinal, un gas medicinal comprimido que cumple con el grado estándar (farmacopea europea referencia 1238) del proveedor local de gases medicinales. Compra 2 cilindros de 6,8m3 (47 L: 23 cm x 153 cm; diámetro x longitud).
  2. Configuración del equipo (Figura 1 y Figura 2)
    1. Ingrese el equipo a la sala limpia GMP (desinfecte antes de ingresar a la sala limpia de acuerdo con los procedimientos GMP.
    2. Para el aire comprimido de grado médico, instale una línea de gas en lugar de colocar el cilindro de gas directamente en la sala limpia.
  3. Modificación del procesador de celdas para la refrigeración
    1. Primero, retire la cubierta de plexiglás. Guarde la cubierta de plexiglás original en caso de que haya un problema con la garantía. Taladre un orificio en la tapa de repuesto del procesador de celdas con un diámetro que coincida y ajuste el diámetro exterior de la punta de la boquilla del dispositivo de enfriamiento para evitar que se agriete la tapa de la centrífuga (se recomiendan 13,3 mm).
    2. Fije los soportes con una pieza circular de espuma. Esto se hace para evitar roturas y/o arañazos en la tapa, para mantener la boquilla del enfriador en su lugar sobre el procesador de celdas, para proteger la tapa de la flexión excesiva debido a la alta presión del aire inyectado, para soportar el peso de la boquilla y, por último, para garantizar la máxima seguridad para el operador al tener acceso libre y seguro a todas las funciones requeridas del procesador de celdas durante el procedimiento experimental.
    3. Conecte el sistema de enfriamiento al procesador de celdas conectando la boquilla de enfriamiento al orificio del plexiglás. Asegúralo con soportes y cojines de espuma.
    4. Coloque la carcasa de refrigeración a una distancia de hasta 8 pies (2,44 m) de la boquilla. Guarda el controlador de temperatura en un armario independiente y colócalo a menos de 1,83 m (6 pies) de la carcasa de refrigeración.
    5. Ajuste el punto de ajuste del enfriador a -40 °C para enfriar la corriente de aire en el enfriador. La temperatura del aire de salida se indica continuamente en el indicador digital con una resolución de 0,1 °C. Ajuste la temperatura de salida digitalmente a 0,1 °C con el controlador de temperatura.
    6. Controle la presión y el caudal del suministro de aire en el módulo regulador de presión y caudal (Figura 2) antes de alimentar al enfriador. Ajústelos a caudales de 55 psi y 4 SCFM, respectivamente, para alcanzar las condiciones óptimas en una corriente de aire enfriada a -30 °C ± 2 °C.
    7. Verifique que el suministro de gas medicinal esté regulado a una presión de salida de 5 bar y que pueda durar al menos 90 minutos, ya que esto es necesario para que el aire comprimido alcance los -30 °C.
      NOTA: El aire seco medicinal es gas médico comprimido, y el aire seco completamente presurizado cumple con el grado estándar.
    8. Suministre 5 bar desde una boquilla enfriadora conectada a la tapa del procesador de celdas a través de un orificio perforado en la tapa de la centrífuga. Inyecte el aire médico enfriado dentro del recipiente de centrifugación del procesador celular (Figura 2). Seleccione la posición de la inyección de aire de manera que el aire enfriado se dirija perpendicularmente al borde de aluminio del rotor de la centrífuga.
    9. Al preparar el procesador de celdas, asegúrese de que el rotor esté a temperatura ambiente (18 °C). Ajuste el termorregulador automático del sistema de refrigeración a -30 °C y las inyecciones directas de aire frío al rotor.
      NOTA: Se probaron diferentes condiciones de prueba para alcanzar un gradiente de temperatura óptimo de +4 °C, que es necesario para superar la termorresistencia del sistema separador de celdas del procesador de celdas y el calentamiento del rotor durante la centrifugación. El termorregulador programado mantendrá la temperatura objetivo óptima dentro de la máquina de procesamiento de células durante el procedimiento, especialmente durante la centrifugación, a una temperatura ambiente limpia de +18 °C.
      1. Configure el procesador de celda con la primera fase de preenfriamiento para enfriar el procesador (sin el kit de procesador de celda) a +3 °C durante 30 a 45 min, y la segunda fase de preenfriamiento de la ejecución del procesador de celda debe ser con el kit preenfriado a +4 °C a 134 x g, durante 5 min.

2. Recuento de partículas en el aire

  1. Evalúe la conformidad del dispositivo de enfriamiento con el entorno de sala limpia GMP según la norma ISO 14644-1 para evaluar el impacto de los dispositivos de calor durante la fase de operación.
  2. Utilice el monitoreo del recuento de partículas para proporcionar evidencia de que se logra el nivel requerido de limpieza en los puntos de control críticos en reposo y en funcionamiento.
    1. El número mínimo de ubicaciones de muestra depende del área medida. Calcule esto usando la ecuación
      figure-protocol-1
      donde A es el área de la sala limpia o del espacio limpio controlado por aire enm 2, y NL es el número de ubicaciones de muestras redondeado a un número entero.
    2. El volumen de muestreo en el aire es el volumen mínimo en cada ubicación. Asegúrese de que el volumen de aire sea lo suficientemente grande como para contar 20 partículas del tamaño de partícula más grande especificado. Calcule el volumen de muestreo en el aire a través de la ecuación
      V= 20/C x 1000
      donde V es el volumen mínimo de una sola muestra por ubicación, expresado en L, y C es el límite de clase (número de partículas/m3).
    3. Para cada ubicación, dependiendo de la zona, utilice una o más muestras. Asegúrese de que el volumen mínimo muestreado en cada ubicación sea de 2 L y que el tiempo mínimo de muestreo sea de al menos 1 minuto.
  3. Antes de tomar muestras, purgue el dispositivo contador de partículas con un filtro de purga. Retire el filtro y colóquelo con la sonda isocinética para la toma de muestras.
  4. Coloque el instrumento contador de partículas en el lugar de muestreo identificado. Inicie la recolección de muestras desde la pantalla principal del dispositivo contador de partículas.
  5. Una vez finalizado el muestreo, lleve el dispositivo contador de partículas a la siguiente ubicación. Cuando finalicen todas las ubicaciones para el muestreo, revise los datos e imprima un informe.
  6. Cuando la concentración promedio de partículas para todos los puntos de muestreo en el área cae por debajo del límite de clase establecido en la Tabla 1, considere el espacio pasado para tener la concentración de partículas permitida.

3. Preparación de gradientes y procesamiento de separación de células

  1. Antes de la experimentación, preenfríe los gradientes de densidad ligera y pesada y los kits de procesador de celdas durante la noche a +4 °C en un refrigerador.
  2. Enfrie previamente el procesador de celda durante 45 minutos en reposo (es decir, encienda el procesador de celda antes de usarlo). Mantenga la temperatura entre +2 °C y +5 °C. Inserte el kit de procesador de celdas preenfriado a +4 °C.
  3. Para el fabricante de gradiente de doble camisa enfriado por etanol estándar (opcional; Figura 3) Conecte las 2 cámaras de vidrio y colóquelas en un agitador magnético. Sujete el tubo entre las 2 cámaras. Enfríe el generador de gradiente con un enfriador de enfriamiento que circule etanol a 0 °C.
  4. Primero, prepárese para cargar la capa pesada en el fondo de la bolsa llenando la cámara con 130 mL de gradiente de densidad pesada (HD; 1.087 g/mL). Carga a una velocidad de bomba de 150 mL/min.
  5. Una vez que el gradiente pesado esté en la bolsa, agregue 130 mL de alta densidad (HD) al vaso delantero y 140 mL de gradientes de baja densidad (LD; 1.063 g/mL) a la parte posterior (abrazadera cerrada).
  6. Retire el hemostático/pinza entre las 2 cámaras y cree un gradiente continuo a una velocidad de bomba de 50 mL/min.
  7. Prepare con anticipación células de capa leucocitaria mononuclear humana para la purificación a partir de múltiples capas de leucocláusula anónimas agrupadas recolectadas de productos de desecho de sangre total (se agregaron de 40 mL a 60 mL de sangre completa a 10 bolsas de abrigo leucocitario) dependiendo de la disponibilidad del banco de sangre.
    1. Separación de MNC
      1. Utilice la centrifugación en gradiente de densidad para el aislamiento de células mononucleares humanas de baja densidad. Para ello, siga los pasos que se describen a continuación.
      2. Para la preparación de células, calcule el volumen de sangre (sangre entera anticoagulada o capa leucocitaria suspendida). Diluya la sangre con una solución tampón 2x-4x mezclando la inversión. Cuanto más diluida esté la sangre, mejor será la pureza de las células mononucleares.
      3. Prepare el tampón mezclando tampón de fosfato con un anticoagulante. Calcule el número de tubos necesarios dividiendo el volumen de sangre por 35 mL y vierta 15 mL de solución de gradiente de densidad 1.073 en cada tubo.
      4. Coloque gradualmente 35 mL de la suspensión de sangre diluida sobre el gradiente de densidad deslizando suavemente sobre la superficie del gradiente de densidad utilizando una jeringa de 60 mL conectada a una aguja; para volúmenes pequeños, use una pipeta. Trate de no interrumpir la interfaz, ya que esto dará como resultado una capa mononuclear deficiente.
      5. Centrifugar a 400 x g durante 20 min a 20 °C sin interrupciones (aceleración 0, deceleración 0). Después de la centrifugación, recoja suavemente la capa de interfaz de las células mononucleares con una pipeta de transferencia estéril. Transfiera las células a otro tubo cónico nuevo de 50 mL.
      6. Lavar las células 2 veces con tampón (PBS con anticoagulante añadido). Para el primer lavado, llene el tubo que contiene las células con tampón hasta 50 mL. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 20 °C a celdas de pellets (aceleración 9, deceleración 0). Retire suavemente todo el sobrenadante con cuidado.
      7. Realizar el segundo lavado para la eliminación de plaquetas. Vuelva a suspender el pellet a un volumen de 50 mL con tampón. Centrifugar a 200-300 x g durante 10 min a 20 °C (aceleración 9, desaceleración 0).
      8. Reconstituya las células hasta un volumen final de 5 mL, estas células deben tener una gravedad específica que se asemeje a la de una MNC de baja densidad <1.073. Mida la densidad específica del gradiente con un densiómetro.
      9. Vuelva a suspender el pellet hasta un volumen final de 100 mL con 95 mL de medio de gradiente de alta densidad (1.083 g/mL) en una bolsa de transferencia. Utilice este producto para la purificación con un separador de células. El volumen final de 100 mL contiene células y 1.083 medio de gradiente de alta densidad.
        NOTA: La capa leucocitaria puede almacenarse en el refrigerador durante la noche en PBS que contenga 0.5% de BSA o plasma autólogo. El pelaje buffy también se puede lavar.
  8. Cargar los gradientes preformados con un máximo de 30 mL de MNC aislado de la capa leucocitaria suspendida en 100 mL de medio de conservación concentrado utilizando una bomba peristáltica a 25 mL/min. Mantener el gradiente a +4 °C.
  9. Mida continuamente la temperatura dentro del procesador de celdas con una termosonda precalibrada. Utilizando un termopar digital conectado a una termosonda estéril, controle la temperatura de los gradientes y las células durante el proceso.

4. Optimización de diferentes pasos de carga de gradiente

  1. Inserte el kit de procesador de celdas preenfriado a +4 °C. Cargue el gradiente pesado (130 mL) a + 4,5 °C. Al final de la carga de gradiente, ajuste la centrífuga a una velocidad relativamente baja (537 x g) para minimizar el calor generado por el rotor.
  2. Apague el procesador de celdas para permitir que el sistema hidráulico vuelva a los niveles previos al funcionamiento y libere aire.
  3. Reinicie el procesador de celdas a 537 x g y agregue los gradientes de densidad pesados (130 mL) y bajos (140 mL) para crear un gradiente de densidad continuo a +4,3 °C y un caudal de 50 mL/min.
  4. Cargue la capa leucocitaria (30 ml) con 100 ml de medio de almacenamiento en frío a +6 °C y un caudal de 25 ml/min. Agregue 50 ml (25 ml x 2) de solución de lavado.
  5. Después de 5 min a +5 °C, recoja el gradiente hilado en 12 frascos a un caudal de 100 mL/min.
  6. Llene los tubos con medios de lavado (M199 + 20% albúmina humana + 10% estreptomicina de penicilina). Llene el tubo 1 con 100 mL de medio de lavado y 150 mL de celdas y los tubos 2-12 con 225 mL de medio de lavado y 25 mL de celdas.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primero se cuantificó el impacto del procesador de celda refrigerada en la sala limpia GMP. Los métodos estandarizados utilizaron un contador de partículas que midió la contaminación de partículas en el aire en un entorno de sala limpia de clase C y clase B de grado GMP en puntos críticos cerca del procesador de celdas y el sistema de enfriamiento de aire presurizado. Los resultados demostraron que no se desarrollaron turbulencias alrededor del equipo. Los datos registrados mostraron que no había un exceso de partículas ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las instalaciones de aislamiento de islotes de todo el mundo han adoptado durante décadas la purificación de islotes humanos en un procesador celular reutilizado. Aunque algunas instalaciones de producción de islotes continúan procesando islotes en un procesador de celdas no refrigerado, la mayoría de los centros utilizan una versión refrigerada del procesador de celdas 10,11,15. Los centros colocan el procesador de celdas en un...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean agradecer al Instituto Europeo de Genómica para la Diabetes (ANR-10- LABEX-0046 a FP) y al Instituto Metabólico de Qatar - Hamad Medical Corporation, Qatar. Los autores agradecen también al Centro de Investigación Médica de Hamad Medical Corporation por el apoyo de las tarifas de procesamiento de artículos.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
fuerte
Aire contra partículasLasair III 
AirJet XR40 SP ScientificFTS system XR40
Gabinete de bioseguridadThermo ScientificEQ-1301
Enfriador de enfriamiento circulanteJulaboCF30
COBE 2991 Terumo BCT
Bandeja de enfriamiento cónicaBiorepCCT-01
Máquina de degradado de doble camisa personalizado en casa
KJT-Termómetro de termopar HannaInstruments HI93551NPara medir la temperatura de los líquidos
Agitador magnético Thermo Scientific88880014
Bomba peristáltica Termómetro MasterFlexMK-77921-79
 Extech InstrumentsRMS 430Para temperatura COBE
Baño de perlas sin aguaCole-Parmer10122-00
Materiales y reactivos
BD kit de enumeración de células madreBD Biosciences 
Kit de tubos COBE 2911Terumo BCT90819
Tubos Cónicos 250mlCorning430776
Densidad de gradiente 1.1Biochrom L6155
Botellas desechables graduadasThermo fisher382019-1000
Albúmina humana 20% Kedrion Biopharma 8091600
M199 solución de lavado Corning 99-784-CM 
Tubos MasterflexMasterflex96400-6
Medical Dry AirLinde HealthcareMedi On 22
Pencillin-estreptomicina Gibco 
ThermoprobeBiorepTC-02Thermosensor
Trypan azul Sigma Aldrich15250061
Universidad de Wisconsin Belzer (UW) Puente de la Vida RM/N 4055Medio de conservación
34456315140122

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  2. Vesilind, G. W., Simpson, M. B., Colman, R. E., Kao, K. J. Evaluation of a centrifugal blood cell processor for washing platelet concentrates. Transfusion. 28 (1), 46-51 (1988).
  3. Lake, S. P., et al. Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator. Diabetes. 38, 143-145 (1989).
  4. Ricordi, C., et al. Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases. Transplantation. 53 (2), 407-414 (1992).
  5. Friberg, A. S., Stahle, M., Brandhorst, H., Korsgren, O., Brandhorst, D. Human islet separation utilizing a closed automated purification system. Cell transplantation. 17 (12), 1305-1313 (2008).
  6. Bampton, T. J., et al. Australian experience with total pancreatectomy with islet autotransplantation to treat chronic pancreatitis. ANZ Journal of Surgery. 91 (12), 2663-2668 (2021).
  7. Doppenberg, J. B., Engelse, M., de Koning, E. J. P. PRISM: A Novel Human Islet Isolation Technique. Transplantation. 106 (6), 1271-1278 (2021).
  8. Shimoda, M., et al. Islet purification method using large bottles effectively achieves high islet yield from pig pancreas. Cell Transplantation. 21 (2-3), 501-508 (2012).
  9. Noguchi, H. Pancreatic Islet Purification from Large Mammals and Humans Using a COBE 2991 Cell Processor versus Large Plastic Bottles. Journal of Clinical Medicine. 10 (1), 10(2021).
  10. Shapiro, A. M., et al. International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation. The New England Journal of Medicine. 355 (13), 1318-1330 (2006).
  11. Ricordi, C. National Institutes of Health-Sponsored Clinical Islet Transplantation Consortium Phase 3 Trial: Manufacture of a Complex Cellular Product at Eight Processing Facilities. Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).
  12. Swift, S., Kin, T., Mirbolooki, M., Wilson, R., Lakey, J. R. T. Comparison of cooling systems during islet purification. Cell Transplantation. 15 (2), 175-180 (2006).
  13. Rilo, H. L. R., et al. Comparison of islet number and viability obtained during purification on Euro-Collins-Ficoll gradients processed on a refrigerated or nonrefrigerated COBE 2991 cell separator. Transplantation Proceedings. 26 (6), 3430(1994).
  14. Chadwick, D. R., et al. Pancreatic islet purification using bovine serum albumin: The importance of density gradient temperature and osmolality. Cell Transplantation. 2 (4), 355(1993).
  15. Nano, R., et al. Heterogeneity of human pancreatic islet isolation around Europe: results of a survey study. Transplantation. 104 (1), 190-196 (2020).
  16. Chadwick, D. R., et al. Storage of pancreatic digest before islet purification. Transplantation. 58 (1), 99-104 (1994).
  17. Amrani, M., et al. Detrimental effects of temperature on the efficacy of the University of Wisconsin solution when used for cardioplegia at moderate hypothermia. Comparison with the St. Thomas Hospital solution at 4 degrees C and 20 degrees C. Circulation. 86, 280-288 (1992).
  18. Fremes, S. E., Li, R. K., Weisel, R. D., Mickle, D. A., Tumiati, L. C. Prolonged hypothermic cardiac storage with University of Wisconsin solution. An assessment with human cell cultures. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 102 (5), 666-672 (1991).
  19. Adewola, A., et al. Comparing cooling systems for the COBE 2991 cell separator used in the purification of human pancreatic islets of Langerhans. Cryo Letters. 31 (4), 310-317 (2010).
  20. Keymeulen, B., et al. Implantation of standardized beta-cell grafts in a liver segment of IDDM patients: graft and recipients characteristics in two cases of insulin-independence under maintenance immunosuppression for prior kidney graft. Diabetologia. 41 (4), 452-459 (1998).
  21. de Kort, H., de Koning, E. J., Rabelink, T. J., Bruijn, J. A., Bajema, I. M. Islet transplantation in type 1 diabetes. BMJ. 342, (2011).
  22. Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84 (9), 1200-1203 (2007).
  23. Lemarie, C., et al. A new single-platform method for the enumeration of CD34+ cells. Cytotherapy. 11 (6), 804-806 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Islet Cell IsolationCooled Cell ProcessorDensity Gradient PurificationHuman Islet ViabilityCell Therapy EquipmentCleanroom GMP StandardsMononuclear Cell FractionCentrifugation StepAirborne Particle AssessmentCell Viability Measurement

Related Articles