Detección simultánea de diferentes clases de anticuerpos en una prueba serológica multiplexada

La borreliosis de Lyme es la enfermedad infecciosa transmitida por garrapatas más común en climas moderados del hemisferio norte¹. Es causada por bacterias espiroquetas del género Borrelia, con cinco patógenos humanos conocidos que varían en distribución geográfica². Las principales especies patógenas de Borrelia en Europa son B. afzelii y B. garinii, con B. burgdorferi s.s., B. spielmanii y B. bavariensis implicadas con menor frecuencia. En América del Norte, B. burgdorferi s.s. es el único agente causal de la borreliosis de Lyme ^2,3. Los patógenos de Borrelia son transmitidos por miembros del género de garrapatas Ixodes, y la transmisión puede ocurrir dentro de las 24 horas posteriores a la picadura de garrapata⁴.

El diagnóstico de la borreliosis de Lyme generalmente se realiza mediante síntomas clínicos y posteriormente se confirma mediante serología. Tanto en Europa como en América del Norte, las guías diagnósticas recomiendan una serie de pruebas en dos pasos que consiste en un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) con un inmunoblot reflejo para evaluar la respuesta de anticuerpos contra antígenos específicos de Borrelia 1,5,6,7,8,9 . Sin embargo, este enfoque carece de sensibilidad y no es óptimo, especialmente en la fase temprana de la infección, cuando la seroconversión puede ser incompleta y los títulos de IgG e IgM anti-Borrelia son demasiado bajos⁶.

Los inmunoensayos multiplex mejoran los inmunoensayos tradicionales que miden solo un objetivo a la vez, y pueden evaluar simultáneamente múltiples respuestas de isotipos de anticuerpos contra uno o más antígenos 10,11,12. Los ensayos como los ELISA se limitan a identificar y cuantificar un solo analito por reacción, en el caso actual de IgG o IgM circulante inducida contra un único antígeno bacteriano tras la infección por Borrelia. Este informe ilustra el uso de la tecnología de perfil de analito basada en perlas para el desarrollo de un inmunoensayo multiplex que detecta simultáneamente anticuerpos IgG e IgM contra cualquiera de los antígenos de Borrelia aquí elegidos en muestras de suero humano. Se seleccionaron cuatro antígenos que en conjunto cubren las especies patógenas de Borrelia nativas de Europa más comunes (B. garinii, B. afzelii, B. burgdorferi s.s.) y América del Norte (B. burgdorferi s.s.) (Tabla 1) ^2,3. Esto permite una identificación decisiva del patógeno y la capacidad de discernir la inmunorreactividad temprana de la IgM y la posterior inmunorreactividad de la IgG más duradera en las muestras de los pacientes.

Tabla 1: Antígenos representativos de Borrelia utilizados para el desarrollo de ensayos múltiples.

Inicialmente, desarrollamos un inmunoensayo de un solo reportero que detectaba anticuerpos IgG o IgM contra el antígeno anti-Borrelia en dos reacciones separadas y luego fusionamos estos ensayos en un ensayo múltiplex de doble reportero que mide ambos isotipos de anticuerpos en la misma mezcla de reacción. Las perlas magnéticas se acoplan a un antígeno diana del patógeno de interés y luego se incuban con muestras de suero del paciente. El antígeno acoplado a perlas es reconocido y capturado tanto la IgG como la IgM circulantes en el suero que se genera en una respuesta inmunitaria contra ese antígeno patógeno. La especificidad de IgG frente a IgM se determina mediante la selección de un anticuerpo secundario que se une a IgG o IgM, cada uno con una señal de fluoróforo distinta asociada a los dos anticuerpos secundarios. Cada señal fluorescente se detecta en uno de los dos canales reporteros del instrumento (es decir, doble reportero) que tiene un láser de excitación diferente y una captura de emisión específica para el fluoróforo único utilizado para detectar IgG o IgM (aquí Brilliant Violet 421 o ficoeritrina, respectivamente). El canal de clasificación del instrumento identifica el tinte codificado por colores que es inherente a los diferentes conjuntos de cuentas. Por lo tanto, se pueden acoplar múltiples antígenos diana a perlas teñidas de manera diferente, y los conjuntos de perlas se mezclan y se utilizan para evaluar de manera integral la inmunorreactividad antipatógena diversa en muestras de suero. El canal de clasificación identifica cada conjunto de perlas individuales (es decir, antígeno específico) y mide la fluorescencia asociada con IgG o IgM frente a ese antígeno. El ensayo multiplex resultante ahorra tiempo y recursos en comparación con las pruebas clásicas menos exhaustivas y cataloga con precisión la inmunorreactividad de la enfermedad de Lyme en volúmenes de muestra limitados. Mientras que un enfoque similar de doble reportero se ha utilizado anteriormente para categorizar las respuestas inmunitarias en otras patologías como la infección por SARS-CoV-2¹³, este informe detalla la aplicación de la tecnología de ensayo fluorescente multiplex para caracterizar la inmunorreactividad en la borreliosis de Lyme.

Se recibió la aprobación apropiada de la Junta de Revisión Institucional y el Comité de Ética para el uso de muestras de suero humano en esta serie experimental. Las muestras fueron materiales residuales anonimizados de un estudio nacional alemán de seroprevalencia del SARS-CoV-2¹⁴. La aprobación para el uso de muestras humanas fue otorgada por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de Hannover, Alemania (9086_BO_S_2020). En el presente estudio se utilizaron un total de 21 muestras de suero humano.

1. Aprobación ética para el uso de muestras humanas

1. Obtener las aprobaciones éticas apropiadas para el uso de muestras humanas.

2. Reactivos y equipos

1. Muestras de suero humano: Realizar la validación técnica del ensayo y el control de calidad utilizando muestras de suero de personas previamente diagnosticadas con borreliosis de Lyme o de un estado inmunológico negativo para Borrelia ^12,14.
2. Instrumentación de un solo reportero. Utilice un instrumento de un solo reportero de dos canales (Tabla de materiales) para el desarrollo inicial del ensayo y la validación técnica.
   NOTA: El sistema de un solo reportero tiene dos láseres: 1) identifica y cuantifica la fluorescencia específica del conjunto de perlas para discriminar diferentes conjuntos de perlas, si se utilizan (canal de clasificación), y 2) detecta y cuantifica la fluorescencia de ficoeritrina (PE) específica del objetivo unido a perlas (canal reportero; excitación de 532 nm, emisión "naranja" de 565-585 nm). Por lo tanto, solo se puede analizar una sola clase de isotipo de anticuerpo (por ejemplo, IgG o IgM) a la vez utilizando el único canal informador.
   1. Realizar estudios de validación iniciales para evaluar la IgG y la IgM anti-Borrelia por separado, en un formato de 96 pocillos de un solo reportero que utiliza reactivos de detección marcados con PE para ambas clases de anticuerpos.
      NOTA: El presente ensayo evalúa las IgG circulantes específicas para el antígeno VlsE de Borrelia y dos variantes de DbpA, y las IgM circulantes específicas para el antígeno OspC, como ejemplos representativos. El ensayo puede ampliarse para evaluar la inmunorreactividad sérica frente a otros antígenos anti-Borrelia , según se desee¹².
3. Instrumentación de doble reportero. Utilizar un instrumento de doble reportero de tres canales (Tabla de Materiales) que permita el análisis concurrente de IgG/IgM en la misma reacción, para el desarrollo y validación técnica del ensayo dual IgM/IgG (detallado más adelante). Este instrumento tiene un total de 3 canales de detección de fluorescencia, de los cuales 2 son canales reporteros que evalúan las señales asociadas a Ig dirigidas.
   NOTA: El sistema de doble reportero tiene tres láseres: 1) identifica y cuantifica la fluorescencia específica del conjunto de perlas (canal de clasificación); 2) detecta y cuantifica la fluorescencia de ficoeritrina (PE) específica de la diana (Canal Reportero 1; excitación de 532 nm, emisión "naranja" de 565-585 nm), y 3) evalúa la fluorescencia de violeta brillante 421 (BV421) específica de la diana de un segundo analito diana (Canal Reportero 2; excitación de 405 nm, emisión "azul" de 421-441 nm). El sistema de doble reportero es compatible con los formatos de ensayo de placa de microtitulación (manipulación semiautomática) de 96 pocillos y 384 pocillos. El esquema general del ensayo se muestra en la Figura 1. Los pasos del protocolo se detallan a continuación.

3. Acoplamiento de antígenos

1. Acoplar los antígenos de Borrelia a microesferas magnéticas, carboxiladas y fluorescentes codificadas por colores de 6,5 μm (perlas; Tabla de Materiales) utilizando la química de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)/sulfo-N-hidroxisuccinimida (sNHS).
   NOTA: Se puede encontrar una descripción detallada en la referencia¹¹y la referencia¹². Encuentre la concentración de acoplamiento de cada antígeno en la Tabla 1. Las perlas acopladas deben almacenarse en la oscuridad a 4 °C hasta su uso. Todos los tampones utilizados en las reacciones de acoplamiento y detección se detallan en los Materiales Suplementarios.

4. Procedimiento de ensayo: Ensayo serológico de IgG o IgM de un solo reportero: formato de 96 pocillos

1. Diluir la muestra en 2 pasos (2 pasos, ambos en placas de 96 pocillos; dilución de la muestra de suero de 200 veces en tampón de ensayo).
   NOTA: La composición del tampón de ensayo es una mezcla 1:4 de tampón cruzado bajo: PBS que contiene 1% (p/v) de albúmina sérica bovina. El Tween-20 se añade a la mezcla hasta una concentración final del 0,05 % (v/v).
   1. Paso 1 de dilución de la muestra: Mezclar 5 μl de la muestra de suero con 120 μl del tampón de ensayo (dilución de 25 veces).
   2. Paso 2 de dilución de la muestra: Diluya la dilución de la muestra de 25 veces y adicionalmente 8 veces mezclando 10 μL de la dilución con 70 μL del tampón de ensayo para que la dilución final de la muestra sea de 200 veces.
2. Dilución de mezcla de perlas magnéticas
   1. Prepare una mezcla de perlas que contenga 1,0 × 10⁶ perlas/ml por población de perlas (es decir, por antígeno diana único).
   2. Diluya la mezcla de perlas preparada 25 veces en tampón de ensayo para que la concentración final de perlas en esta suspensión diluida sea ahora de 4 × 10⁴ perlas/ml por población de perlas (es decir, por antígeno diana único).
3. Incubación de muestras de suero con perlas
   1. Pipetear 25 μL de suspensión de perlas múltiplex acoplada diluida (que contiene 4,0 × 10⁴ perlas/set/mL) en pocillos asignados de una placa de microtitulación de media área de 96 pocillos (Tabla de materiales).
   2. Añadir 25 μL de muestra de suero diluida 200 veces (del Paso 4.1 anterior) en pocillos apropiados que contengan 25 μL de suspensión de perlas acopladas.
      NOTA: Esto produce una dilución adicional de 2 veces, por lo que la dilución final de la muestra de suero en el pocillo es de 400 veces y el recuento final de perlas es de 1000 perlas / juego de perlas / reacción de 50 μL.
   3. Cubra la placa de reacción de 96 pocillos con un sello de microplaca (lámina adhesiva o cubiertas de placa de plástico).
   4. Incubar la placa durante 2 h a 20 °C, a 750 rpm en un agitador de placas.
4. Lavado de perlas
   1. Retire la placa de reacción de 96 pocillos del agitador de placas y retire con cuidado el sello de la placa adhesiva.
   2. Coloque la placa de reacción de 96 pocillos en una arandela de placas.
   3. Lave las perlas tres veces con tampón de lavado de 100 μL (1× PBS + 0,05% v/v Tween 20) utilizando la lavadora de placas magnética automática.
5. Vuelva a suspender las perlas lavadas en 100 μL de tampón de lavado, cubra la placa con una lámina adhesiva o una cubierta de plástico para placas y agite la placa en un agitador de placas durante 1 min a 20 °C a 1000 rpm.
6. Divide las cuentas lavadas
   1. Retire la placa de reacción de 96 pocillos del agitador de placas y retire con cuidado el sello de la placa adhesiva.
   2. Mezcle las reacciones pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces y transfiera 50 μL de cada volumen de reacción de 100 μL a cada una de las dos nuevas placas de reacción de 96 pocillos, una placa para la detección de IgG y otra para la detección de IgM.
7. Detección de incubación de anticuerpos/reactivos
   NOTA: En este punto, las perlas acopladas al antígeno diana se han incubado con muestras de suero para extraer los anticuerpos circulantes en el suero (si están presentes) que reaccionan con los antígenos. Las perlas reaccionadas con inmunoglobulina unida se han dividido en dos placas, y la IgG y la IgM ahora se detectan y cuantifican en sus placas separadas utilizando anticuerpos secundarios específicos del isotipo con una marca PE. Escalonar la manipulación de la placa en 20 min.
   1. Aspire el sobrenadante de los pocillos que contienen perlas magnéticas utilizando la arandela de placas magnéticas.
   2. Para cada placa, prepare la mezcla adecuada de reactivos de detección de Ig (ya sea anti-IgG o anti-IgM), que contenga IgG antihumana de cabra conjugada con PE (3 μg/mL) o IgM antihumana de burro conjugado con PE (5 μg/mL) en el tampón de ensayo. Para cada pocillo que contiene perlas, se utilizan 30 μL de reactivo de detección. Prepare suficientes volúmenes de reactivos de detección de IgG e IgM para los pocillos de reacción, con suficiente extra para acomodar las pérdidas de pipeteo.
   3. Pipetear 30 μL de reactivo de detección de IgG en cada pocillo que contenga perlas reaccionadas en la placa de IgG y cubrir la placa de reacción de 96 pocillos con un sello de microplaca.
   4. Pipetear 30 μL de reactivo de detección de IgM en cada pocillo que contenga perlas reaccionadas en la placa de IgM y cubrir la placa de reacción de 96 pocillos con un sello de microplaca.
   5. Incubar durante 45 min a 20 °C agitando a 750 rpm en un agitador de placas.
8. Lavado de perlas
   1. Retire la placa de reacción de 96 pocillos del agitador de placas y retire con cuidado el sello de la placa adhesiva.
   2. Coloque la placa de reacción de 96 pocillos en una arandela de placa magnética.
   3. Lave las perlas tres veces con un tampón de lavado de 100 μL utilizando la lavadora de placas magnéticas.
9. Vuelva a suspender las perlas en 100 μL de tampón de lavado.
10. Analice los resultados en el instrumento de reportero único.
    1. Cubra la placa de reacción de 96 pocillos con un sello de microplaca.
    2. Agite la placa de reacción de 96 pocillos durante 3 min a 20 °C, a 1000 rpm en un agitador de placas.
    3. Transfiera la placa de reacción de 96 pocillos del agitador de placas y colóquela en un instrumento analizador de flujo de un solo reportero (Tabla de materiales).
    4. Para cada muestra, analice la mediana de la intensidad fluorescente (MFI) utilizando los siguientes ajustes del instrumento: Volumen de absorción = 80 μL, Recuento = 50/población de perlas, Tiempo de espera = 60 s, Activación = 7.500-15.000)^12,13.

5. Procedimiento de ensayo: Ensayo serológico de IgG e IgM de doble reportero: formato de 96 pocillos

1. Dilución de la muestra (2 pasos, ambos en placas de 96 pocillos; dilución de la muestra de suero 200 veces en tampón de ensayo)
   1. Paso 1 de dilución de la muestra: Mezclar 5 μl de muestra de suero con 120 μl de tampón de ensayo (dilución de 25 veces).
   2. Paso 2 de dilución de la muestra: Diluir las diluciones de la muestra de 25 veces 8 veces más mezclando 10 μl de la primera dilución (muestra diluida 25 veces de la sección 5.1.1) con tampón de ensayo de 70 μl (dilución de 8 veces), para obtener una dilución final de la muestra de 200 veces.
2. Dilución de mezcla de perlas magnéticas
   1. Prepare una mezcla de perlas que contenga 1,0 × 10⁶ perlas acopladas a antígeno diana/ml por población de perlas (es decir, por antígeno diana único).
      NOTA: En esta serie experimental, evaluamos la inmunorreactividad de IgG e IgM frente a cuatro antígenos únicos de Borrelia en cada reacción.
   2. Diluya la mezcla de perlas preparada 50 veces en tampón de ensayo. La concentración de perlas en esta suspensión diluida es ahora de 2,0 × 10⁴ perlas/ml por población de perlas.
      NOTA: El número de perlas en la reacción de ensayo dúplex se reduce a la mitad con respecto al utilizado en la reacción de un solo reportero para permitir la comparabilidad directa entre los dos ensayos y conservar los recursos, después de que los estudios preliminares confirmaran que la señal de fluorescencia se mantenía dentro del rango lineal de cuantificación cuando se utilizaba la mitad del número de perlas.
3. Incubación de muestras de suero con perlas
   1. Pipetear 25 μL de suspensión de perlas acopladas al antígeno diana diluida (que contiene 2,0 × 10⁴ perlas/set/mL) en pocillos preasignados de una placa de microtitulación de media área de 96 pocillos. El número exacto de pocillos de reacción y su colocación en la placa dependen del número total de muestras analizadas determinado por el operador y de si se ejecutarán pocillos individuales o replicados por muestra.
      NOTA: Las perlas magnéticas acopladas al antígeno diana se harán reaccionar con muestras de suero humano. Tanto la IgG como la IgM inmunorreactivas al antígeno anti-Borrelia , si están presentes en las muestras, se unirán y se inmovilizarán en las mismas perlas acopladas al antígeno. A continuación, se realizará la cuantificación secundaria de anticuerpos de IgG e IgM unidos en las mismas perlas en las mismas reacciones, utilizando diferentes fluoróforos para la identificación de IgG e IgM que permita su diferenciación.
   2. Añadir 25 μL de suero diluido 200 veces (del paso 5.1 anterior) en cada pocillo que contenga 25 μl de suspensión de perlas acopladas al antígeno diana mixto (paso 5.2).
      NOTA: Esto produce una dilución adicional de 2 veces, por lo que la dilución final de la muestra de suero en el pocillo es de 400 veces y el recuento final de perlas es de 500 perlas / juego de perlas / reacción de 50 μL.
   3. Cubra la placa de reacción de 96 pocillos con un sello de microplaca (lámina adhesiva o cubierta de placa de plástico).
   4. Incubar la placa con perlas durante 2 h a 20 °C, a 750 rpm en un agitador de placas.
4. Lavado de perlas (para eliminar el exceso de muestra de suero)
   1. Retire la placa de reacción de 96 pocillos del agitador de placas y retire el sello de la placa adhesiva.
   2. Coloque la placa de reacción de 96 pocillos en una arandela de placa magnética.
   3. Lave las perlas tres veces con un tampón de lavado de 100 μL utilizando la lavadora de placas magnéticas.
5. Aspire el volumen de lavado final de las perlas después del último paso de lavado.
6. Detección de anticuerpos (Incubación - Parte I)
   1. Hacer un reactivo de detección dual de IgG e IgM fresco que contenga IgG antihumana de cabra biotinilada (1 μg/mL) junto con IgM antihumana de burro conjugada con PE (5 μg/mL) en tampón de ensayo. Para cada pocillo que contiene perlas, se utilizan 30 μL de reactivo de detección dual. Prepare suficientes volúmenes de reactivos de detección dual de IgG e IgM para los pocillos de reacción, con suficiente extra para acomodar las pérdidas de pipeteo.
   2. Pipetee 30 μL de reactivo de detección dual de IgG e IgM en cada pocillo asignado y cubra la placa de reacción de 96 pocillos con un sello de microplaca.
   3. Incubar la placa durante 45 min a 20 °C mientras se agita a 750 rpm en un agitador de placas.
7. Lavado de perlas (para eliminar el exceso de anticuerpos de detección)
   1. Retire la placa de reacción de 96 pocillos del agitador de placas y retire con cuidado el sello de la placa adhesiva.
   2. Coloque la placa de reacción de 96 pocillos en una arandela de placa magnética automática.
   3. Lave las perlas tres veces con un tampón de lavado de 100 μL utilizando la lavadora de placas magnética automática.
8. Aspire el volumen de lavado final de las perlas después del último paso de lavado.
9. Reportero conjugado con estreptavidina (Incubación - Parte II)
   1. Diluir estreptavidina fresca marcada con BV421 en tampón de ensayo a una concentración de 0,2 μg/ml. Para cada pocillo que contiene perlas, se utilizan 30 μL de estreptavidina marcada con BV421. Prepare suficiente volumen de estreptavidina marcado con BV421 para los pocillos de reacción, con suficiente extra para acomodar las pérdidas de pipeteo.
   2. Pipetear 30 μL de BV421-Estreptavidina diluida en cada pocillo de reacción y cubrir la placa de reacción de 96 pocillos con el sello de microplaca.
   3. Incubar la placa durante 30 min a 20 °C mientras se agita a 750 rpm en un agitador de placas.
10. Lavar las perlas (para eliminar el exceso de BV421-Estreptavidina)
    1. Retire la placa de reacción de 96 pocillos del agitador de placas y retire con cuidado el sello de la placa adhesiva.
    2. Coloque la placa de reacción de 96 pocillos en la arandela de placa magnética.
    3. Lave las perlas tres veces con un tampón de lavado de 100 μL utilizando la lavadora de placas magnética automática.
11. Vuelva a suspender las perlas dentro de los pocillos hasta un volumen final de 100 μL en tampón de lavado.
12. Analice los resultados en el instrumento de doble reportero
    1. Cubra la placa de reacción de 96 pocillos con un sello de microplaca.
    2. Incubar la placa de reacción de 96 pocillos durante 3 min a 20 °C, a 1000 rpm en un agitador de placas.
    3. Transfiera la placa de reacción de 96 pocillos del agitador de placas al instrumento analizador de flujo de doble indicador (Tabla de materiales).
    4. Evalúe la mediana de la intensidad fluorescente (MFI) de la muestra de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Configuración del instrumento: modo de doble reportero, volumen de absorción = 80 μL, recuento = 50/población de perlas, tiempo de espera = 60 s, compuerta = 7.500-15.000).

6. Ensayo serológico de IgG e IgM de doble reportero: formato semiautomatizado de 384 pocillos

1. Realice el ensayo de doble indicador en formato de placa de 384 pocillos siguiendo los pasos de ensayo detallados en la sección 5, pero procese las muestras utilizando un robot de pipeteo y una lavadora de placas magnética automatizada (Tabla de materiales). En formato de 384 pocillos, agite las placas durante las incubaciones y lavados a 1450 rpm, y antes de medir la fluorescencia, agite la placa durante 5 minutos a 21 °C y 1800 rpm.

Visión general del experimento
En la Figura 1 se muestran los esquemas generales para los ensayos de Borrelia basados en perlas de un solo reportero y de doble reportero. En el caso de las dianas de anticuerpos individuales (es decir, IgG o IgM) generadas contra un antígeno de Borrelia determinado, ambas clases de anticuerpos se evaluaron de forma independiente en muestras de suero humano utilizando un anticuerpo antiisotipo conjugado con PE para su notificación. Para el ensayo de doble reportero con análisis simultáneo de la inmunorreactividad de IgG e IgM, la detección de IgG específica del antígeno de Borrelia utilizó un sistema reportero de estreptavidina (fluorescencia azul) marcado con IgG humana + BV421 biotinilado, al tiempo que conservó el reportero conjugado con PE (fluorescencia naranja) para la detección de IgM. El flujo de trabajo del ensayo de doble reportero es similar al del ensayo de un solo reportero, con la excepción de una incubación adicional del sistema de detección de 30 minutos con el reactivo de detección de fluorescencia de segundo canal BV421-Estreptavidina.

Figura 1: Esquema de los ensayos de Borrelia basados en perlas de un solo reportero y de doble reportero. (A) El instrumento de un solo reportero se utilizó para desarrollar y validar inicialmente el ensayo basado en perlas que caracterizó la IgG o la IgM anti-Borrelia individualmente, ambas utilizando una etiqueta reportera fluorescente de ficoeritritina (PE) que emite señal en los espectros "naranjas". Cualquier antígeno de Borrelia deseado puede acoplarse a las perlas y utilizarse para capturar y cuantificar la IgG o la IgM presentes en las muestras de suero. Se necesitan dos inmunoensayos separados para evaluar la reactividad de IgG e IgM frente a un antígeno determinado. (B) El sistema de doble reportero permitió el análisis simultáneo de muestras de suero para anticuerpos IgG e IgM contra cualquier antígeno individual de Borrelia en el mismo pocillo. Este enfoque utiliza el mismo anticuerpo de detección conjugado con PE para dirigirse a la IgM anti-Borrelia , pero reemplaza la detección de IgG de un sistema basado en PE al uso de un anticuerpo de detección primaria biotinilado y estreptavidina marcada con BV421 (un emisor "azul") que necesita un paso de incubación adicional del sistema de detección de 30 minutos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Precisión intraensayo
El análisis de correlación de Spearman para tres antígenos representativos de Borrelia (Figura 2) demostró una reproducibilidad uniforme de los valores de IMF al detectar anticuerpos anti-Borrelia presentes en sueros humanos.

Figura 2: Precisión intra-ensayo del ensayo Borrelia basado en perlas de doble reportero. El análisis de correlación de Spearman mostró una alta precisión intraensayo del ensayo de doble reportero cuando se utilizó un sistema de detección de PE para detectar anticuerpos IgM específicos de Borrelia (A) y un sistema de detección BV421 para detectar anticuerpos IgG específicos de Borrelia (B, C). Un total de 21 muestras de suero fueron analizadas por duplicado mediante un procedimiento semiautomatizado. En cada gráfico, las señales de MFI se trazaron entre sí y se analizaron mediante regresión lineal. Una curva lineal (x=y) mostrada como una línea discontinua roja indica señales MFI idénticas para los sistemas de detección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Precisión entre ensayos
Se observó una buena reproducibilidad ensayo a ensayo con el ensayo de doble reportero. Los gráficos de Levey-Jennings (Figura 3) con los valores de IMF de una muestra de control de calidad medida durante siete corridas independientes demostraron la alta precisión entre ensayos para todos los antígenos representativos. El coeficiente de variación porcentual promedio (CV% = desviación estándar/media × 100) de los cuatro antígenos representativos de Borrelia fue del 5,3%.

Linealidad de dilución
Debido a que el ensayo original de un solo reportero y el nuevo ensayo de doble reportero emplean diferentes plataformas de citometría de flujo, comparamos las salidas de fluorescencia medianas del mismo inmunoensayo de antígeno entre los dos instrumentos de citometría de flujo (Figura 4). Las series de dilución de muestras proporcionaron curvas de dilución lineales para la evaluación de IgM e IgG, con un buen paralelismo de dosis-respuesta entre los instrumentos a lo largo de todo el rango de dilución evaluado (1:100-1:12.800).

Figura 3: Precisión entre ensayos del ensayo Borrelia basado en perlas de doble reportero. Para la evaluación de la precisión entre ensayos, se analizó la respuesta de anticuerpos IgM (A) e IgG (B-D) específicos de Borrelia de una muestra de control de calidad en siete corridas independientes, en pocillos duplicados cada vez. Los ensayos se realizaron manualmente. Los valores de MFI se trazaron en un gráfico de Levey-Jennings. Una línea verde da la media de todos los valores. Dos líneas discontinuas rojas indican el rango de tolerancia de la precisión entre ensayos. Esto se calculó a partir del valor medio ± 2,5 veces la desviación estándar (2,5 DE). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Linealidad de dilución del ensayo de Borrelia basado en perlas de doble reportero. A diluciones de muestra de 100 a 12.800 veces, las curvas de dilución para la detección de IgM (A) y la detección de IgG (B) fueron similares cuando se realizaron manualmente con el instrumento de un solo reportero y el instrumento de doble informador. En todas las diluciones analizadas, los valores de MFI fueron ligeramente más altos utilizando el instrumento de reportero único (símbolos rojos) que el instrumento de reportero dual (símbolos azules). Se muestran curvas de dilución para 2 antígenos representativos, y cada punto de dilución representa la medición promedio de pocillos por triplicado con desviación estándar (SD *) indicada por barras de error. Nota: Las SD pequeñas no son visibles a esta escala. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Los autores no tienen nada que revelar.