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Artículo de método

Un conjunto de técnicas de cribado para una visión general rápida de la función de los neutrófilos

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DOI:

10.3791/65329

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9 de febrero de 2024

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1Laboratory of Protein Chemistry and Biochemistry, Department of Cell Biology, University of Brasilia, 2Institute of Physics, University of Brasilia

En este artículo

Resumen

Este protocolo presenta un conjunto de ensayos funcionales de neutrófilos que se utilizarán como método de cribado para cubrir las funciones de diferentes vías de señalización. El protocolo incluye una evaluación inicial y sencilla de la viabilidad celular, la pureza, la producción de especies reactivas de oxígeno, la migración en tiempo real, la fagocitosis y una sugerencia preliminar de trampas extracelulares de neutrófilos.

Resumen

Los neutrófilos son conocidos como una de las primeras líneas de defensa en la respuesta inmune innata y pueden realizar muchas funciones celulares particulares, como la quimiotaxis, la migración inversa, la fagocitosis, la degranulación de enzimas y metabolitos citotóxicos y la liberación de ADN como trampas extracelulares de neutrófilos (NET). Los neutrófilos no solo tienen una señalización estrechamente regulada, sino que también participan en la regulación de otros componentes del sistema inmunológico. Dado que los neutrófilos frescos están diferenciados terminalmente, son de corta duración y muy variables entre los individuos, es importante aprovechar al máximo las muestras recogidas. A menudo, los investigadores necesitan realizar ensayos de detección para evaluar una visión general de las muchas funciones de los neutrófilos que pueden verse afectadas por afecciones específicas que se están evaluando. Para abordar esta necesidad se desarrolló un conjunto de pruebas que seguían un único proceso de aislamiento de neutrófilos de densidad normal, buscando un equilibrio entre velocidad, exhaustividad, coste y precisión. Los resultados se pueden utilizar para razonar y guiar estudios de seguimiento en profundidad. Este procedimiento se puede llevar a cabo en un tiempo promedio de 4 h e incluye la evaluación de la viabilidad celular, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la migración en tiempo real y la fagocitosis de levaduras en portaobjetos de vidrio, dejando suficientes células para enfoques más detallados como estudios ómicos. Además, el procedimiento incluye una forma de observar fácilmente una sugerencia preliminar de NETs después de una tinción panóptica rápida observada por microscopía óptica, con una falta de marcadores específicos, aunque lo suficiente como para indicar si valdría la pena realizar más esfuerzos en ese sentido. La diversidad de funciones probadas combina puntos comunes entre las pruebas, reduciendo el tiempo y los gastos de análisis. El procedimiento se denominó NeutroFun Screen, y aunque tiene limitaciones, equilibra los factores antes mencionados. Además, el objetivo de este trabajo no es un conjunto de pruebas definido, sino más bien una guía que se pueda ajustar fácilmente a los recursos y demandas de cada laboratorio.

Introducción

Los neutrófilos son las células inmunitarias innatas más abundantes en la sangre humana y se sabe que desempeñan un papel importante en la infección y la inflamación, siendo los primeros en responder al sitio del daño tisular. En los últimos años, ha habido un creciente reconocimiento del papel crucial que desempeñan los neutrófilos en una variedad de enfermedades y en el apoyo a la homeostasis2. Los neutrófilos no solo tienen una señalización estrechamente regulada, sino que también participan en la regulación de otros componentes del sistema inmune 3,4,5. Por lo tanto, la investigación de los neutrófilos y sus muchas funciones celulares inusuales, como la quimiotaxis, la migración inversa6, la fagocitosis7, el estallido respiratorio8 y la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET)7, es imperativo en numerosos contextos de investigación donde es necesario evaluar los posibles cambios funcionales, morfológicos o moleculares de los neutrófilos desencadenados por condiciones específicas bajo análisis.

Los neutrófilos recién aislados son terminalmente diferenciados, de vida corta, altamente dinámicos y fácilmente activados9. Sin embargo, aún no se ha logrado un método de almacenamiento eficiente que no afecte las respuestas de los neutrófilos, lo que dificulta la realización de múltiples ensayos que deben ser ininterrumpidos. Además, los análisis funcionales descritos anteriormente10,11, basados en ensayos que requieren citometría y/o tinción fluorescente, pueden no ser una opción viable cuando se necesita una evaluación amplia e inicial del neutrófilo.

Para abordar estos problemas, este protocolo describe un conjunto de pruebas que se pueden llevar a cabo siguiendo un único proceso de aislamiento, incluida la evaluación de la viabilidad celular, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la migración en tiempo real y la fagocitosis de Saccharomyces cerevisiae, cuyos resultados pueden utilizarse para razonar estudios de seguimiento en profundidad. Este procedimiento, denominado NeutroFun Screen, fue diseñado para abarcar las principales actividades efectoras, excepto la degranulación, y puede completarse en un tiempo promedio de 4 h, incluyendo 1 h de activación. Además, las celdas restantes se pueden utilizar para enfoques más detallados, como estudios ómicos. La ventaja de este método radica en su equilibrio entre velocidad, exhaustividad, costo y precisión.

Además, hay una manera de observar fácilmente una sugerencia preliminar de NET, sin marcadores específicos, pero suficiente para indicar si valdría la pena realizar más esfuerzos en esa dirección. La diversidad de funciones probadas tiene como objetivo combinar puntos comunes entre las pruebas, reduciendo el tiempo y los gastos de análisis. El objetivo principal de este método es proporcionar un análisis funcional equilibrado con respecto a la velocidad, la exhaustividad, el costo y la precisión que permita una visión general de la respuesta de los neutrófilos, lo que lo convierte en un paso inicial útil en la investigación de los efectos de nuevos estímulos en los neutrófilos de densidad normal.

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Protocolo

Todos los experimentos siguieron estrictamente las directrices éticas establecidas por el comité de revisión institucional de la Universidad de Brasilia (proceso 13364819.0.0000.5558), y las muestras fueron identificadas por códigos para garantizar el anonimato de los donantes. Las células se obtuvieron de donantes masculinos sanos normales de entre 18 y 35 años, que firmaron el consentimiento informado y cumplieron con los siguientes criterios de elegibilidad: no fumadores/vapeadores, sin condiciones de salud crónicas y sin antecedentes de afecciones inflamatorias en los últimos 14 días.

1. Extracción de sangre

  1. Coloque asépticamente 0,3 ml de 5.000 UI/ml de heparina (ver Tabla de materiales) en una jeringa estéril de 20 ml para heparinizarla.
  2. Aplique un torniquete venoso aproximadamente 4 pulgadas por encima del sitio de punción e identifique la vena cubital o cefálica mediana para la venopunción.
    NOTA: Asegúrese de que el tiempo total del torniquete no exceda de 1 minuto.
  3. Limpiar el lugar de la punción con alcohol al 70% y realizar la venopunción.
  4. Invierta suavemente la jeringa tres o cuatro veces después de recolectar la sangre para mezclar la sangre y la heparina correctamente.

2. Aislamiento de neutrófilos

NOTA: Los leucocitos polimorfonucleares (PMN) se aíslan mediante centrifugación en gradiente de densidad seguida de lisis hipotónica de los glóbulos rojos (RBC) restantes, como se describió anteriormente11 con algunos cambios. Este método no es obligatorio para realizar los ensayos de cribado, y puede ser reemplazado siempre y cuando el método elegido dé como resultado una viabilidad del >97%, cebado o activación del <3% de las PMN, y produzca suficientes células para todos los ensayos, réplicas y condiciones. Realizar estos pasos en condiciones asépticas y utilizar soluciones libres de endotoxinas son obligatorios para evitar la activación celular.

  1. Realice diluciones de 12 mL de medios de separación al 60% y 70% (disponibles comercialmente; consulte la Tabla de materiales) en tubos cónicos de 50 mL.
  2. Prepare el gradiente de abajo hacia arriba añadiendo 4 ml a la vez de la dilución del 60 % sobre la dilución del 70 %, utilizando una pipeta de 5 ml. Hazlo con cuidado para evitar que se mezcle la interfaz.
  3. Coloque cuidadosamente 12 ml de sangre heparinizada sobre el gradiente de densidad. Centrifugar a 200 x g durante 15 min a temperatura ambiente.
    NOTA: A partir de este paso, hasta la activación de PMN, todos los reactivos y tubos utilizados deben mantenerse en una hielera llena de hielo.
  4. Deseche la capa de plasma/células mononucleares, luego transfiera suavemente la capa por encima del gránulo de eritrocitos a dos tubos cónicos de 15 ml con aproximadamente 7,5 ml en cada uno. Calcule el volumen del tubo con la solución salina equilibrada de Hank (HBSS; consulte la tabla de materiales).
  5. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 19 °C.
  6. Lave el gránulo celular con HBSS.
    1. Deseche el sobrenadante vertiendo el tubo y vuelva a suspender suavemente el gránulo en 7 ml de HBSS.
    2. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 19 °C para eliminar todos los medios de separación.
  7. Realizar lisis hipotónica de los glóbulos rojos restantes.
    1. Deseche el sobrenadante y combine los gránulos en un solo tubo.
    2. Resuspender el gránulo de RBC/PMN en 3 mL deH2Oestéril y añadir 3 mL de HBSS (2x) en un plazo de 25 s para restaurar la osmolaridad. A continuación, centrifugar a 300 x g durante 5 min a 19 °C.
    3. Repita los pasos 2.8.1 y 2.8.2 para obtener un gránulo blanco sin eritrocitos.
      NOTA: El sobrenadante debe eliminarse lo antes posible para minimizar el contacto de los neutrófilos con los productos de degradación de los glóbulos rojos. Alternativamente, la segunda lisis hipotónica puede reemplazarse resuspendiendo suavemente la capa residual de glóbulos rojos y eliminando todo el sobrenadante, ya que los glóbulos rojos restantes se sedimentarán por encima del gránulo de PMN.
  8. Deseche el sobrenadante vertiendo el tubo, vuelva a suspender suavemente los PMN en el tampón restante y transfiéralos a un microtubo helado.
    NOTA: Asegúrese de anotar el volumen mientras transfiere las células resuspendidas con una micropipeta.
  9. Transferir 3 x 1 μL de la suspensión celular a un portaobjetos de vidrio limpio (tres pocillos de 1 μL cada uno) y teñir con panóptico rápido (ver Tabla de Materiales) para la evaluación de la morfología y la pureza12.
    1. Para teñir con panóptico rápido, sumergir el portaobjetos cinco veces en fijador panóptico n° 1, seis veces en eosina n° 2 y dos veces en hematoxilina n° 3, con una duración de 1 s cada inmersión.
    2. Lave suavemente el portaobjetos de vidrio con agua destilada.
    3. Deje escurrir y seque al aire.
  10. Observe bajo un microscopio y cuente 300 células aleatorias en cada pocillo, diferenciando así los neutrófilos de otros granulocitos.
  11. Transferir 1 μL de la suspensión celular a 49 μL de colorante azul de tripano al 0,2%13 y contar las células utilizando una cámara de Neubauer, distinguiendo entre células muertas y viables.
  12. Ajustar la concentración celular a 6.667 células/μL utilizando una solución de plasma autólogo al 50% y HBSS al 50% suplementado con calcio y magnesio. Divida la suspensión de 6.667 células/μL de forma uniforme entre los microtubos correspondientes a las condiciones a ensayar, incluido el testigo negativo.
    NOTA: Se puede utilizar cualquier concentración celular similar a los neutrófilos circulantes en el organismo modelo, pero es importante utilizar la misma concentración celular en todos los experimentos para la reproducibilidad.

figure-protocol-1
Figura 1: Protocolo de aislamiento de neutrófilos. Se apilan dos concentraciones del medio de separación (percoll) (A) (B), luego la sangre se coloca en capas sobre el gradiente de separación (C). Después de la centrifugación, el PMN se encuentra en la capa central (D), que se divide en dos tubos de 15 mL (E). La suspensión celular se lava dos veces en HBSS y se centrifuga (G-I) para eliminar el medio, luego las células se resuspenden y los glóbulos rojos residuales se someten a dos rondas de lisis hipotónica (J-M). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Preparación para la activación de neutrófilos

  1. En microtubos de 1,5 mL, prepare un sistema de activación para cada condición de modo que la concentración celular final sea de 6.600 células/μL. Por ejemplo, para probar los efectos de 100 nM de fMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; ver Tabla de Materiales), agregue 5 μL de 10 μM de fMLP a 495 μL de la suspensión de 6,667 células/μL. Para el control negativo (no estimulado), agregue HBSS que contenga Ca2+ y Mg2+.
    NOTA: Para demostrar esta metodología, se utilizaron las siguientes concentraciones finales de los estímulos: 100 nM de fMLP, 16 μM de fallaxina, un péptido antimicrobianonatural 14, y 100 nM de PMA (forbol 12-miristato 13-acetato) (ver Tabla de Materiales).
  2. Incubar a 37 °C sin rotación.
    NOTA: Todas las alícuotas para los ensayos funcionales se toman de esta suspensión celular, en lo sucesivo denominada sistema de activación.

4. Ensayo de cloruro azul de nitrotetrazolio (NBT) para evaluar la producción de ROS

  1. Preparación de la solución de trabajo NBT: Para cada condición experimental, prepare una solución de trabajo NBT (ver Tabla de Materiales) de 6 mM siguiendo los siguientes pasos:
    1. Disolver 0,0005 g de NBT en 10 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) y vórtice durante al menos 15 min.
    2. Añadir 90 μL de HBSS Ca2+Mg2+ y vórtice hasta 2 min.
      NOTA: Todos los pasos que involucran NBT deben realizarse en la oscuridad.
  2. Realice la prueba de diapositiva NBT.
    1. Después de 20 minutos de activación celular, mezcle suavemente la suspensión celular y transfiera con cuidado 2 μL de PMN a un portaobjetos de vidrio limpio. Incubar durante 20 min en una cámara humidificada a 37 °C.
      NOTA: No extienda demasiado la suspensión de la celda sobre el portaobjetos; de lo contrario, puede secarse antes de la incubación.
    2. Añadir 1 μL de la solución de trabajo NBT sobre las células e incubar durante 20 minutos protegido de la luz.
    3. Seque el portaobjetos con aire caliente y fíjelo con una gota de metanol en cada pocillo durante 1 min. Tiñir con safranina al 0,03% (ver Tabla de Materiales) durante 1 min.
    4. Lave suavemente el portaobjetos de vidrio con agua destilada.
    5. Deje que el portaobjetos se seque al aire y observe bajo un microscopio.
    6. Cuente 100 células aleatorias en cada pocillo, diferenciando los neutrófilos con y sin depósitos de formazano.
  3. Realizar el ensayo de espectrofotometría NBT.
    1. Después de 40 minutos de activación celular, mezcle suavemente la suspensión celular y transfiera 90 μL de PMN del sistema de activación a un microtubo limpio. A continuación, agregue con cuidado 20 μL de la solución de NBT de 6 mM. Incubar en la oscuridad durante 20 minutos a 37 °C.
    2. Añadir 100 μL de dodecil sulfato de sodio al 10% (SDS; ver Tabla de Materiales) y vórtice.
    3. Sonicar utilizando un sonicador de punta a una amplitud del 60%, cinco ciclos de 15 s cada uno con intervalos de 15 s. Centrifugar a 12.000 x g durante 5 min.
    4. Transfiera 60 μL del sobrenadante a una placa de fondo transparente de 96 pocillos y mida la absorbancia del producto de formazano a 570 nm.

5. Ensayo de fagocitosis

  1. Prepare una suspensión de 33.000 levaduras/μL para cada afección, como se describe a continuación:
    1. Añadir aproximadamente 0,75 mg de levadura seca (Saccharomyces cerevisiae; ver Tabla de Materiales) a 200 μL de HBSS Ca2+Mg2+ e incubar en una termomezcladora a 100 °C con 500 rpm durante al menos 15 min.
    2. Homogeneizar la mezcla mediante vórtice y transferir 5 μL de suspensión de levadura a 45 μL de colorante azul de tripano al 0,2%. Cuente las levaduras con una cámara Neubauer.
    3. Ajustar la concentración de la suspensión inicial a 33.000 células de levadura/μL utilizando HBSS Ca2+Mg2+. Mantenga la suspensión en hielo hasta su uso.
  2. Después de 20 minutos de activación celular, mezcle suavemente la suspensión celular y transfiera 5 μL del sistema de activación a 5 μL de la suspensión de 33.000 levaduras/μL de Saccharomyces cerevisiae en un nuevo microtubo estéril.
    NOTA: La proporción de neutrófilos a levadura es de 1:5 (PMN:levadura).
  3. Transfiera inmediatamente 6 μL de la suspensión de PMN/levadura a tres pocillos de un portaobjetos de vidrio limpio (2 μL cada uno) e incube el portaobjetos en una cámara humidificada durante 40 min.
    NOTA: No extienda demasiado la suspensión de la celda sobre el portaobjetos; de lo contrario, puede secarse antes de la incubación.
  4. Seque el portaobjetos con aire caliente y tiña con panóptico rápido, como se describe en el paso 2.9 anterior.
    NOTA: El tercer paso de la tinción panóptica rápida es fundamental para el análisis microscópico del portaobjetos. La tinción del portaobjetos durante ≥3 s en este paso puede hacer que no sea apto para el análisis, ya que será difícil diferenciar la levadura de los lóbulos nucleares de los neutrófilos.
  5. Observe los portaobjetos bajo el microscopio, contando 100 neutrófilos aleatorios de cada pocillo y discriminando entre PMN positivos y negativos para fagocitosis.
    NOTA: Al menos una partícula de levadura dentro o en contacto directo con la membrana celular de PMN indica un PMN positivo para fagocitosis. Si está interesado en la proporción de levadura/neutrófilos, cuente también el número de partículas de levadura engullidas.

6. Ensayo de quimiotaxis PMN en tiempo real

NOTA: El ensayo de migración se realiza de forma similar al protocolo descrito anteriormente15, con las siguientes adaptaciones:

  1. Prepare el gradiente quimiotáctico agregando 160 μL de quimioatrayente (p. ej., fMLP, IL-8, C5 o LTB4; consulte la Tabla de materiales) a la cámara inferior de una placa de analizador celular en tiempo real (RTCA) basada en impedancia. Para controles negativos y blancos, añadir 160 μL de HBSS Ca2+Mg2+.
  2. Coloque la cámara superior y agregue 25 μL de HBSS Ca2 + Mg2+. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 1 h para formar el gradiente quimiotáctico.
  3. Después de 60 minutos de activación celular, mezcle suavemente la suspensión celular y coloque 60 μL de suspensión celular en la cámara superior. Añadir 60 μL de HBSS Ca2+Mg2+ a la pieza en bruto.
  4. Coloque la placa RTCA y programe el software RTCA para medir el índice celular (IC) cada 60 s durante 2 h.
    NOTA: Las placas RTCA se pueden lavar para su reutilización como se describió anteriormente16. En resumen, lavar las cámaras y los electrodos de RTCA con solución salina con fosfato (PBS) tres veces, luego con agua ultrapura tipo I dos veces. Incubar la cámara inferior y superior con tripsina al 0,25% y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,53 mM durante 40 min. Lavar con agua ultrapura tres veces.

7. Ensayo sugestivo NET

  1. Después de 10 minutos de activación celular, mezcle suavemente la suspensión celular y transfiera 4 μL de PMN de cada sistema de activación bajo evaluación, divididos en dos pocillos de un portaobjetos de vidrio limpio. Incubar en una cámara humidificada a 37 °C durante 30 min.
  2. Añadir 1 μL de ADNasa I a uno de los pocillos e incubar durante 20 min a 37 °C (en cámara húmeda).
  3. Seque el portaobjetos y tiña con un panóptico rápido, como se describió anteriormente en el paso 2.9 de la sección "aislamiento de neutrófilos".
  4. Evalúe los portaobjetos bajo un microscopio.
    NOTA: Busque cualquier indicio de liberación de NET, caracterizada por la presencia de estructuras similares a telarañas. Una vez identificado, confirmar si el tratamiento con ADNasa I fue capaz de eliminar dichas estructuras. Este ensayo sugiere la formación de NET, ya que se requieren pruebas adicionales para confirmar su presencia.

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Resultados

El método de aislamiento basado en la densidad utilizado en este estudio (Figura 1) cumplió con los criterios de los experimentos propuestos. Los parámetros de neutrófilos obtenidos con este método incluyeron viabilidad ≥98%, pureza ≥94% y rendimiento celular ≥1,5 x 107, sin activación detectable por las pruebas de cribado. Dos pasos relevantes en el aislamiento de PMN son la anticoagulación y la eliminación de los glóbulos rojos. Mantener el tubo sanguíneo anticoagulado o la jeri...

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Discusión

Los neutrófilos son células altamente dinámicas y receptivas que tienen una vida corta y aún no pueden ser criopreservadas19, lo que dificulta las investigaciones sobre su biología. Por lo tanto, es esencial seguir pasos cuidadosos para obtener neutrófilos viables, enriquecidos y en reposo11,20. En este estudio se empleó una técnica de aislamiento basada en la densidad que enfatiza la manipulación suave y mínima, así como el uso de bajas t...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Los autores reconocen a las siguientes agencias de financiamiento: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP y FINATEC.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CIM-Placa 16Agilent 
Lector de placas CLARIOstar BMG LABTECHUS 9,733,124
Detalles del producto: Software de análisis de datos MARS
Dimethyl sulfoxideDinâ mica1582
DNAse ISigma - AldrichDN 25
Ácido etilendiaminotetraacético sal disódica dihidratadaSigma - AldrichE5134
Tinción panóptica rápidaLaborclin620529
Portaobjetos de vidrioExacta7102
Hank' s Solución salina equilibrada con calcio, con magnesio, sin rojo fenol.Sigma - Aldrich55037C
Hank' s Solución salina equilibrada sin cloruro de calcio, sulfato de magnesio y bicarbonato de sodio.Sigma - AldrichH4641
HeparinaBlau 
Cabina de flujo laminarVecoVLFS-12
MicroscopioZeiss415501-0101-002Puntos Clave: Bloque de mezcla Primostar 1
BIOERMB-102
Neubauer mejorado de líneas brillantesNuevo Optik1110000
N-formil-metionil-leucil-fenilalaninaSigma - AldrichF3506
Nitroblue tetrazolioNeonCAS 298-83-9
PercollCytiva17089101medios
de separación Phorbol 12-miristato 13-acetatoSigma - AldrichP8139
Comprimido de solución salina tamponada con fosfatoSigma - AldrichP4417
ROTOFIX 32 AHettich1206
Saccharomyces cerevisiaeFleischmann
SafraninaSigma - Aldrich50240
Dodecil sulfato de sodioCytiva17-1313-01
SonicatorQsonicaQ125
Solución de azul de tripánVetecC.I. 23850
Vortex Genie 2Scientific Industries, Inc.0K-0500-902
xCELLigence Análisis de células en tiempo real (RTCA) DP (doble propósito)Agilent 380601050Detalles del producto: Sistema RTCA compuesto por hardware de detección, placas de celda y software
5665825001Número de patente de 7896014655229

Referencias

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