Un conjunto de técnicas de cribado para una visión general rápida de la función de los neutrófilos

Resumen

Este protocolo presenta un conjunto de ensayos funcionales de neutrófilos que se utilizarán como método de cribado para cubrir las funciones de diferentes vías de señalización. El protocolo incluye una evaluación inicial y sencilla de la viabilidad celular, la pureza, la producción de especies reactivas de oxígeno, la migración en tiempo real, la fagocitosis y una sugerencia preliminar de trampas extracelulares de neutrófilos.

Resumen

Los neutrófilos son conocidos como una de las primeras líneas de defensa en la respuesta inmune innata y pueden realizar muchas funciones celulares particulares, como la quimiotaxis, la migración inversa, la fagocitosis, la degranulación de enzimas y metabolitos citotóxicos y la liberación de ADN como trampas extracelulares de neutrófilos (NET). Los neutrófilos no solo tienen una señalización estrechamente regulada, sino que también participan en la regulación de otros componentes del sistema inmunológico. Dado que los neutrófilos frescos están diferenciados terminalmente, son de corta duración y muy variables entre los individuos, es importante aprovechar al máximo las muestras recogidas. A menudo, los investigadores necesitan realizar ensayos de detección para evaluar una visión general de las muchas funciones de los neutrófilos que pueden verse afectadas por afecciones específicas que se están evaluando. Para abordar esta necesidad se desarrolló un conjunto de pruebas que seguían un único proceso de aislamiento de neutrófilos de densidad normal, buscando un equilibrio entre velocidad, exhaustividad, coste y precisión. Los resultados se pueden utilizar para razonar y guiar estudios de seguimiento en profundidad. Este procedimiento se puede llevar a cabo en un tiempo promedio de 4 h e incluye la evaluación de la viabilidad celular, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la migración en tiempo real y la fagocitosis de levaduras en portaobjetos de vidrio, dejando suficientes células para enfoques más detallados como estudios ómicos. Además, el procedimiento incluye una forma de observar fácilmente una sugerencia preliminar de NETs después de una tinción panóptica rápida observada por microscopía óptica, con una falta de marcadores específicos, aunque lo suficiente como para indicar si valdría la pena realizar más esfuerzos en ese sentido. La diversidad de funciones probadas combina puntos comunes entre las pruebas, reduciendo el tiempo y los gastos de análisis. El procedimiento se denominó NeutroFun Screen, y aunque tiene limitaciones, equilibra los factores antes mencionados. Además, el objetivo de este trabajo no es un conjunto de pruebas definido, sino más bien una guía que se pueda ajustar fácilmente a los recursos y demandas de cada laboratorio.

Introducción

Los neutrófilos son las células inmunitarias innatas más abundantes en la sangre humana y se sabe que desempeñan un papel importante en la infección y la inflamación, siendo los primeros en responder al sitio del daño tisular^. En los últimos años, ha habido un creciente reconocimiento del papel crucial que desempeñan los neutrófilos en una variedad de enfermedades y en el apoyo a la homeostasis². Los neutrófilos no solo tienen una señalización estrechamente regulada, sino que también participan en la regulación de otros componentes del sistema inmune ^3,4,5. Por lo tanto, la investigación de los neutrófilos y sus muchas funciones celulares inusuales, como la quimiotaxis, la migración inversa⁶, la fagocitosis⁷, el estallido respiratorio⁸ y la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET)⁷, es imperativo en numerosos contextos de investigación donde es necesario evaluar los posibles cambios funcionales, morfológicos o moleculares de los neutrófilos desencadenados por condiciones específicas bajo análisis.

Los neutrófilos recién aislados son terminalmente diferenciados, de vida corta, altamente dinámicos y fácilmente activados⁹. Sin embargo, aún no se ha logrado un método de almacenamiento eficiente que no afecte las respuestas de los neutrófilos, lo que dificulta la realización de múltiples ensayos que deben ser ininterrumpidos. Además, los análisis funcionales descritos anteriormente^10,11, basados en ensayos que requieren citometría y/o tinción fluorescente, pueden no ser una opción viable cuando se necesita una evaluación amplia e inicial del neutrófilo.

Para abordar estos problemas, este protocolo describe un conjunto de pruebas que se pueden llevar a cabo siguiendo un único proceso de aislamiento, incluida la evaluación de la viabilidad celular, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la migración en tiempo real y la fagocitosis de Saccharomyces cerevisiae, cuyos resultados pueden utilizarse para razonar estudios de seguimiento en profundidad. Este procedimiento, denominado NeutroFun Screen, fue diseñado para abarcar las principales actividades efectoras, excepto la degranulación, y puede completarse en un tiempo promedio de 4 h, incluyendo 1 h de activación. Además, las celdas restantes se pueden utilizar para enfoques más detallados, como estudios ómicos. La ventaja de este método radica en su equilibrio entre velocidad, exhaustividad, costo y precisión.

Además, hay una manera de observar fácilmente una sugerencia preliminar de NET, sin marcadores específicos, pero suficiente para indicar si valdría la pena realizar más esfuerzos en esa dirección. La diversidad de funciones probadas tiene como objetivo combinar puntos comunes entre las pruebas, reduciendo el tiempo y los gastos de análisis. El objetivo principal de este método es proporcionar un análisis funcional equilibrado con respecto a la velocidad, la exhaustividad, el costo y la precisión que permita una visión general de la respuesta de los neutrófilos, lo que lo convierte en un paso inicial útil en la investigación de los efectos de nuevos estímulos en los neutrófilos de densidad normal.

Protocolo

Todos los experimentos siguieron estrictamente las directrices éticas establecidas por el comité de revisión institucional de la Universidad de Brasilia (proceso 13364819.0.0000.5558), y las muestras fueron identificadas por códigos para garantizar el anonimato de los donantes. Las células se obtuvieron de donantes masculinos sanos normales de entre 18 y 35 años, que firmaron el consentimiento informado y cumplieron con los siguientes criterios de elegibilidad: no fumadores/vapeadores, sin condiciones de salud crónicas y sin antecedentes de afecciones inflamatorias en los últimos 14 días.

1. Extracción de sangre

1. Coloque asépticamente 0,3 ml de 5.000 UI/ml de heparina (ver Tabla de materiales) en una jeringa estéril de 20 ml para heparinizarla.
2. Aplique un torniquete venoso aproximadamente 4 pulgadas por encima del sitio de punción e identifique la vena cubital o cefálica mediana para la venopunción.
   NOTA: Asegúrese de que el tiempo total del torniquete no exceda de 1 minuto.
3. Limpiar el lugar de la punción con alcohol al 70% y realizar la venopunción.
4. Invierta suavemente la jeringa tres o cuatro veces después de recolectar la sangre para mezclar la sangre y la heparina correctamente.

2. Aislamiento de neutrófilos

NOTA: Los leucocitos polimorfonucleares (PMN) se aíslan mediante centrifugación en gradiente de densidad seguida de lisis hipotónica de los glóbulos rojos (RBC) restantes, como se describió anteriormente¹¹ con algunos cambios. Este método no es obligatorio para realizar los ensayos de cribado, y puede ser reemplazado siempre y cuando el método elegido dé como resultado una viabilidad del >97%, cebado o activación del <3% de las PMN, y produzca suficientes células para todos los ensayos, réplicas y condiciones. Realizar estos pasos en condiciones asépticas y utilizar soluciones libres de endotoxinas son obligatorios para evitar la activación celular.

1. Realice diluciones de 12 mL de medios de separación al 60% y 70% (disponibles comercialmente; consulte la Tabla de materiales) en tubos cónicos de 50 mL.
2. Prepare el gradiente de abajo hacia arriba añadiendo 4 ml a la vez de la dilución del 60 % sobre la dilución del 70 %, utilizando una pipeta de 5 ml. Hazlo con cuidado para evitar que se mezcle la interfaz.
3. Coloque cuidadosamente 12 ml de sangre heparinizada sobre el gradiente de densidad. Centrifugar a 200 x g durante 15 min a temperatura ambiente.
   NOTA: A partir de este paso, hasta la activación de PMN, todos los reactivos y tubos utilizados deben mantenerse en una hielera llena de hielo.
4. Deseche la capa de plasma/células mononucleares, luego transfiera suavemente la capa por encima del gránulo de eritrocitos a dos tubos cónicos de 15 ml con aproximadamente 7,5 ml en cada uno. Calcule el volumen del tubo con la solución salina equilibrada de Hank (HBSS; consulte la tabla de materiales).
5. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 19 °C.
6. Lave el gránulo celular con HBSS.
   1. Deseche el sobrenadante vertiendo el tubo y vuelva a suspender suavemente el gránulo en 7 ml de HBSS.
   2. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 19 °C para eliminar todos los medios de separación.
7. Realizar lisis hipotónica de los glóbulos rojos restantes.
   1. Deseche el sobrenadante y combine los gránulos en un solo tubo.
   2. Resuspender el gránulo de RBC/PMN en 3 mL de_H2Oestéril y añadir 3 mL de HBSS (2x) en un plazo de 25 s para restaurar la osmolaridad. A continuación, centrifugar a 300 x g durante 5 min a 19 °C.
   3. Repita los pasos 2.8.1 y 2.8.2 para obtener un gránulo blanco sin eritrocitos.
      NOTA: El sobrenadante debe eliminarse lo antes posible para minimizar el contacto de los neutrófilos con los productos de degradación de los glóbulos rojos. Alternativamente, la segunda lisis hipotónica puede reemplazarse resuspendiendo suavemente la capa residual de glóbulos rojos y eliminando todo el sobrenadante, ya que los glóbulos rojos restantes se sedimentarán por encima del gránulo de PMN.
8. Deseche el sobrenadante vertiendo el tubo, vuelva a suspender suavemente los PMN en el tampón restante y transfiéralos a un microtubo helado.
   NOTA: Asegúrese de anotar el volumen mientras transfiere las células resuspendidas con una micropipeta.
9. Transferir 3 x 1 μL de la suspensión celular a un portaobjetos de vidrio limpio (tres pocillos de 1 μL cada uno) y teñir con panóptico rápido (ver Tabla de Materiales) para la evaluación de la morfología y la pureza¹².
   1. Para teñir con panóptico rápido, sumergir el portaobjetos cinco veces en fijador panóptico n° 1, seis veces en eosina n° 2 y dos veces en hematoxilina n° 3, con una duración de 1 s cada inmersión.
   2. Lave suavemente el portaobjetos de vidrio con agua destilada.
   3. Deje escurrir y seque al aire.
10. Observe bajo un microscopio y cuente 300 células aleatorias en cada pocillo, diferenciando así los neutrófilos de otros granulocitos.
11. Transferir 1 μL de la suspensión celular a 49 μL de colorante azul de tripano al 0,2%¹³ y contar las células utilizando una cámara de Neubauer, distinguiendo entre células muertas y viables.
12. Ajustar la concentración celular a 6.667 células/μL utilizando una solución de plasma autólogo al 50% y HBSS al 50% suplementado con calcio y magnesio. Divida la suspensión de 6.667 células/μL de forma uniforme entre los microtubos correspondientes a las condiciones a ensayar, incluido el testigo negativo.
    NOTA: Se puede utilizar cualquier concentración celular similar a los neutrófilos circulantes en el organismo modelo, pero es importante utilizar la misma concentración celular en todos los experimentos para la reproducibilidad.

Figura 1: Protocolo de aislamiento de neutrófilos. Se apilan dos concentraciones del medio de separación (percoll) (A) (B), luego la sangre se coloca en capas sobre el gradiente de separación (C). Después de la centrifugación, el PMN se encuentra en la capa central (D), que se divide en dos tubos de 15 mL (E). La suspensión celular se lava dos veces en HBSS y se centrifuga (G-I) para eliminar el medio, luego las células se resuspenden y los glóbulos rojos residuales se someten a dos rondas de lisis hipotónica (J-M). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Preparación para la activación de neutrófilos

1. En microtubos de 1,5 mL, prepare un sistema de activación para cada condición de modo que la concentración celular final sea de 6.600 células/μL. Por ejemplo, para probar los efectos de 100 nM de fMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; ver Tabla de Materiales), agregue 5 μL de 10 μM de fMLP a 495 μL de la suspensión de 6,667 células/μL. Para el control negativo (no estimulado), agregue HBSS que contenga Ca²⁺ y Mg²⁺.
   NOTA: Para demostrar esta metodología, se utilizaron las siguientes concentraciones finales de los estímulos: 100 nM de fMLP, 16 μM de fallaxina, un péptido antimicrobiano^{natural 14}, y 100 nM de PMA (forbol 12-miristato 13-acetato) (ver Tabla de Materiales).
2. Incubar a 37 °C sin rotación.
   NOTA: Todas las alícuotas para los ensayos funcionales se toman de esta suspensión celular, en lo sucesivo denominada sistema de activación.

4. Ensayo de cloruro azul de nitrotetrazolio (NBT) para evaluar la producción de ROS

1. Preparación de la solución de trabajo NBT: Para cada condición experimental, prepare una solución de trabajo NBT (ver Tabla de Materiales) de 6 mM siguiendo los siguientes pasos:
   1. Disolver 0,0005 g de NBT en 10 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) y vórtice durante al menos 15 min.
   2. Añadir 90 μL de HBSS Ca²⁺Mg²⁺ y vórtice hasta 2 min.
      NOTA: Todos los pasos que involucran NBT deben realizarse en la oscuridad.
2. Realice la prueba de diapositiva NBT.
   1. Después de 20 minutos de activación celular, mezcle suavemente la suspensión celular y transfiera con cuidado 2 μL de PMN a un portaobjetos de vidrio limpio. Incubar durante 20 min en una cámara humidificada a 37 °C.
      NOTA: No extienda demasiado la suspensión de la celda sobre el portaobjetos; de lo contrario, puede secarse antes de la incubación.
   2. Añadir 1 μL de la solución de trabajo NBT sobre las células e incubar durante 20 minutos protegido de la luz.
   3. Seque el portaobjetos con aire caliente y fíjelo con una gota de metanol en cada pocillo durante 1 min. Tiñir con safranina al 0,03% (ver Tabla de Materiales) durante 1 min.
   4. Lave suavemente el portaobjetos de vidrio con agua destilada.
   5. Deje que el portaobjetos se seque al aire y observe bajo un microscopio.
   6. Cuente 100 células aleatorias en cada pocillo, diferenciando los neutrófilos con y sin depósitos de formazano.
3. Realizar el ensayo de espectrofotometría NBT.
   1. Después de 40 minutos de activación celular, mezcle suavemente la suspensión celular y transfiera 90 μL de PMN del sistema de activación a un microtubo limpio. A continuación, agregue con cuidado 20 μL de la solución de NBT de 6 mM. Incubar en la oscuridad durante 20 minutos a 37 °C.
   2. Añadir 100 μL de dodecil sulfato de sodio al 10% (SDS; ver Tabla de Materiales) y vórtice.
   3. Sonicar utilizando un sonicador de punta a una amplitud del 60%, cinco ciclos de 15 s cada uno con intervalos de 15 s. Centrifugar a 12.000 x g durante 5 min.
   4. Transfiera 60 μL del sobrenadante a una placa de fondo transparente de 96 pocillos y mida la absorbancia del producto de formazano a 570 nm.

5. Ensayo de fagocitosis

1. Prepare una suspensión de 33.000 levaduras/μL para cada afección, como se describe a continuación:
   1. Añadir aproximadamente 0,75 mg de levadura seca (Saccharomyces cerevisiae; ver Tabla de Materiales) a 200 μL de HBSS Ca²⁺Mg²⁺ e incubar en una termomezcladora a 100 °C con 500 rpm durante al menos 15 min.
   2. Homogeneizar la mezcla mediante vórtice y transferir 5 μL de suspensión de levadura a 45 μL de colorante azul de tripano al 0,2%. Cuente las levaduras con una cámara Neubauer.
   3. Ajustar la concentración de la suspensión inicial a 33.000 células de levadura/μL utilizando HBSS Ca²⁺Mg²⁺. Mantenga la suspensión en hielo hasta su uso.
2. Después de 20 minutos de activación celular, mezcle suavemente la suspensión celular y transfiera 5 μL del sistema de activación a 5 μL de la suspensión de 33.000 levaduras/μL de Saccharomyces cerevisiae en un nuevo microtubo estéril.
   NOTA: La proporción de neutrófilos a levadura es de 1:5 (PMN:levadura).
3. Transfiera inmediatamente 6 μL de la suspensión de PMN/levadura a tres pocillos de un portaobjetos de vidrio limpio (2 μL cada uno) e incube el portaobjetos en una cámara humidificada durante 40 min.
   NOTA: No extienda demasiado la suspensión de la celda sobre el portaobjetos; de lo contrario, puede secarse antes de la incubación.
4. Seque el portaobjetos con aire caliente y tiña con panóptico rápido, como se describe en el paso 2.9 anterior.
   NOTA: El tercer paso de la tinción panóptica rápida es fundamental para el análisis microscópico del portaobjetos. La tinción del portaobjetos durante ≥3 s en este paso puede hacer que no sea apto para el análisis, ya que será difícil diferenciar la levadura de los lóbulos nucleares de los neutrófilos.
5. Observe los portaobjetos bajo el microscopio, contando 100 neutrófilos aleatorios de cada pocillo y discriminando entre PMN positivos y negativos para fagocitosis.
   NOTA: Al menos una partícula de levadura dentro o en contacto directo con la membrana celular de PMN indica un PMN positivo para fagocitosis. Si está interesado en la proporción de levadura/neutrófilos, cuente también el número de partículas de levadura engullidas.

6. Ensayo de quimiotaxis PMN en tiempo real

NOTA: El ensayo de migración se realiza de forma similar al protocolo descrito anteriormente¹⁵, con las siguientes adaptaciones:

1. Prepare el gradiente quimiotáctico agregando 160 μL de quimioatrayente (p. ej., fMLP, IL-8, C5 o LTB4; consulte la Tabla de materiales) a la cámara inferior de una placa de analizador celular en tiempo real (RTCA) basada en impedancia. Para controles negativos y blancos, añadir 160 μL de HBSS Ca²⁺Mg²⁺.
2. Coloque la cámara superior y agregue 25 μL de HBSS Ca^{2 +} Mg²⁺. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 1 h para formar el gradiente quimiotáctico.
3. Después de 60 minutos de activación celular, mezcle suavemente la suspensión celular y coloque 60 μL de suspensión celular en la cámara superior. Añadir 60 μL de HBSS Ca²⁺Mg²⁺ a la pieza en bruto.
4. Coloque la placa RTCA y programe el software RTCA para medir el índice celular (IC) cada 60 s durante 2 h.
   NOTA: Las placas RTCA se pueden lavar para su reutilización como se describió anteriormente¹⁶. En resumen, lavar las cámaras y los electrodos de RTCA con solución salina con fosfato (PBS) tres veces, luego con agua ultrapura tipo I dos veces. Incubar la cámara inferior y superior con tripsina al 0,25% y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,53 mM durante 40 min. Lavar con agua ultrapura tres veces.

7. Ensayo sugestivo NET

1. Después de 10 minutos de activación celular, mezcle suavemente la suspensión celular y transfiera 4 μL de PMN de cada sistema de activación bajo evaluación, divididos en dos pocillos de un portaobjetos de vidrio limpio. Incubar en una cámara humidificada a 37 °C durante 30 min.
2. Añadir 1 μL de ADNasa I a uno de los pocillos e incubar durante 20 min a 37 °C (en cámara húmeda).
3. Seque el portaobjetos y tiña con un panóptico rápido, como se describió anteriormente en el paso 2.9 de la sección "aislamiento de neutrófilos".
4. Evalúe los portaobjetos bajo un microscopio.
   NOTA: Busque cualquier indicio de liberación de NET, caracterizada por la presencia de estructuras similares a telarañas. Una vez identificado, confirmar si el tratamiento con ADNasa I fue capaz de eliminar dichas estructuras. Este ensayo sugiere la formación de NET, ya que se requieren pruebas adicionales para confirmar su presencia.

Resultados

El método de aislamiento basado en la densidad utilizado en este estudio (Figura 1) cumplió con los criterios de los experimentos propuestos. Los parámetros de neutrófilos obtenidos con este método incluyeron viabilidad ≥98%, pureza ≥94% y rendimiento celular ≥1,5 x 10⁷, sin activación detectable por las pruebas de cribado. Dos pasos relevantes en el aislamiento de PMN son la anticoagulación y la eliminación de los glóbulos rojos. Mantener el tubo sanguíneo anticoagulado o la jeringa en un balanceo suave antes de aplicar capas sobre el gradiente de densidad y elegir un método de eliminación de glóbulos rojos para evitar tanto la activación como la contaminación puede influir en el rendimiento y la reproducibilidad del experimento.

Para evaluar la visión funcional de la función de los neutrófilos, se desarrolló un flujo de trabajo que permitió realizar los ensayos de cribado propuestos con al menos dos investigadores en un tiempo medio de 4 h, con 1 h de activación y 2 h de monitorización de la migración en tiempo real, como se muestra en la Figura 2.

Figura 2: Flujo de trabajo de NeutroFun Screen. Para evaluar el panel de respuestas funcionales desencadenadas por condiciones específicas bajo evaluación, el flujo de trabajo de NeutroFun Screen incluye la participación de al menos dos investigadores. El investigador 1 (R1) inicia el proceso de aislamiento de PMN, seguido del ajuste de la concentración celular y la incubación del sistema de activación, mientras que en paralelo, el investigador 2 (R2) prepara los materiales para llevar a cabo los siguientes ensayos, que se dividen entre los dos: R1 realiza ensayos de fagocitosis, NET y NBT espectrofotométrico; R2 realiza pruebas de migración en tiempo real y pruebas de deslizamiento NBT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El ensayo clásico NBT¹⁷ se optimizó para la evaluación espectrofotométrica y de portaobjetos de la formación de formazano resultante de la reacción de NBT con las ROS generadas por PMN. El ensayo espectrofotométrico permitió la cuantificación relativa entre condiciones, mientras que el ensayo de microscopía fue útil para el análisis descriptivo y semicuantitativo, evaluando la regularidad de la distribución de los cristales, la morfología y el número de células que contienen formazano. Los resultados del ensayo espectrofotométrico se muestran en la Figura 3A, lo que indica que 100 nM de PMA indujeron una producción elevada de ROS (en una proporción promedio de 3:2:1) en comparación con fMLP y los grupos de control. Los resultados de la prueba de portaobjetos NBT (Figura 3B) corroboraron los resultados espectrofotométricos, mostrando también PMA como el estímulo inductor de producción de ROS más intenso en comparación con fMLP (Figura 3C), como se demostró previamente mediante la medición directa de ROS por citometría¹⁸. En cuanto al recuento celular, el número de neutrófilos que contenían cristales de formazán mostró una relación de 7:4:1 en las condiciones PMA:fMLP:control, revelando también diferentes patrones de distribución de formazán entre fMLP y PMN activados por PMA; El tratamiento con fMLP dio lugar a células individuales intensamente activadas, mientras que PMA indujo la formación de cristales de formazano dispersos por todo el citoplasma en la mayoría de las PMN. Además, se observaron algunas características morfológicas que diferenciaron las condiciones, como la agregación celular expresiva después del tratamiento con PMA. La ausencia de estas características típicas de activación y los bajos niveles de formazano en el grupo control indicaron que el estado de reposo no se alteró significativamente. Por lo tanto, el ensayo NBT demostró ser una prueba simple, económica y confiable para la producción de ROS de neutrófilos que se puede utilizar para ver la capacidad e intensidad de un estímulo dado para inducir la producción de ROS.

Figura 3: Prueba NBT. (A) La evaluación espectrofotométrica del estallido respiratorio de neutrófilos a diferentes condiciones (control negativo: 100 nM fMLP y 100 nM PMA) mediante absorbancia de formazano (490-630 nm). Los datos de cuatro donantes se presentan como media ± desviación estándar (DE). * = todos los grupos son diferentes entre sí (p≤ 0,05); £ = Las comparaciones CTRL versus PMA y fMLP versus PMA muestran diferencias significativas (p≤ 0,05). (B) La prueba de portaobjetos se puede analizar cualitativamente, caracterizando la intensidad de los depósitos de formazano, su ubicación dentro de la célula y la agregación celular. Las flechas negras apuntan a cristales de formazano. Barras de escala: 20 μm. (C) Número de PMN que contienen formazano, contado por microscopía óptica. Los datos de ocho donantes se presentaron como media ± DE. *** p < 0,0001, prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los portaobjetos de fagocitosis se utilizaron para determinar la tasa de fagocitosis como porcentaje de neutrófilos que realizan fagocitosis, como se muestra en la Figura 4. Aunque tanto la fMLP de 100 nM como el péptido antimicrobiano de 16 μM indujeron un aumento aparente de la engullición de levaduras, la diferencia no fue estadísticamente significativa hasta la estimulación dual, que mejoró significativamente la fagocitosis en comparación con el grupo de control y podría sugerir una respuesta a la estimulación dual.

Figura 4: Prueba de fagocitosis. Los neutrófilos se evaluaron por su capacidad de fagocitosis (recuento de neutrófilos que contenían levaduras). Aunque la exposición a 100 nM de fMLP o a un péptido antimicrobiano de 16 μM antes de la incubación de la levadura aumentó la fagocitosis en comparación con el grupo de control, (A) el aumento no fue estadísticamente significativo. Curiosamente, una incubación inicial con fMLP, seguida de la adición del péptido antimicrobiano, dio lugar a un aumento significativo de la fagocitosis en los neutrófilos humanos (asterisco entre CTRL y el péptido antimicrobiano fMLP+). (B) Las flechas negras muestran las células de levadura, las flechas verdes muestran solo los neutrófilos y las flechas rojas apuntan a los neutrófilos fagocitadores. Los datos de cinco donantes se presentaron como media ± DE. Barras de escala: 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En la Figura 5 se muestra un ejemplo de los resultados de la migración celular en tiempo real, que muestra el conocido efecto quimiotáctico de 100 nM fMLP en los neutrófilos. La cinética de migración celular se ajustó al modelo de Gompertz, lo que permitió la comparación de sus parámetros.

Figura 5: Migración celular en tiempo real. El índice de la célula refleja la impedancia eléctrica resultante de la migración de la célula. En este ensayo, se utilizó fMLP como control positivo de la migración de neutrófilos mediante la adición de fMLP de 100 nM a la cámara inferior. Un control negativo (CTRL) contenía solo HBSS en la cámara inferior. Las curvas superpuestas representan el ajuste de la curva al modelo de Gompertz, modificado para adaptarse mejor a las pendientes ascendentes y descendentes. Datos de tres donantes, presentados como media ± DE.* p < 0,05, prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Finalmente, se presenta una prueba de microscopía óptica simple sugestiva de la presencia de TNE, en la que las PMNs se tiñen con panóptico rápido. Es posible observar que para algunos estímulos específicos inductores de NET, como PMA o algunos péptidos antimicrobianos, incluso después de un corto tiempo de activación (1 h) es posible observar estructuras filamentosas en forma de red cerca de las células, mientras que esto no es posible en otras condiciones como el control negativo y fMLP (Figura 6). Para respaldar mejor esta afirmación, se añadió DNasa I después de 40 minutos de activación celular con PMA de 100 nm o un péptido antimicrobiano, eliminando las estructuras similares a NET (Figura 6). Aunque este método no es adecuado para la caracterización de los NET y puede ser influenciado por artefactos, es un punto de partida barato, simple e interesante para justificar nuevas inversiones en el análisis de los NET, especialmente en contextos en los que los efectos de los estímulos son desconocidos o están mal descritos.

Figura 6: Ensayo sugestivo de formación de NET. Un análisis cualitativo de neutrófilos teñidos con panópticos después de 1 h de activación sobre un portaobjetos de vidrio puede indicar la liberación de NET. Los grupos CTRL (A,B) y fMLP (C,D) no mostraron ninguna indicación de liberación de NET, mientras que la activación con PMA (E-H) indujo la formación de estructuras similares a NET que fueron degradadas por el tratamiento con DNasa I (I-L). La investigación de los efectos de un péptido antimicrobiano en los neutrófilos mostró que tal estímulo podría ser capaz de provocar la liberación de NET, ya que las diapositivas presentaban las estructuras similares a NET (M-P) que fueron degradadas por la DNasa I (Q-T). Las flechas rojas apuntan a estructuras similares a NET. Barras de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Los neutrófilos son células altamente dinámicas y receptivas que tienen una vida corta y aún no pueden ser criopreservadas¹⁹, lo que dificulta las investigaciones sobre su biología. Por lo tanto, es esencial seguir pasos cuidadosos para obtener neutrófilos viables, enriquecidos y en reposo^11,20. En este estudio se empleó una técnica de aislamiento basada en la densidad que enfatiza la manipulación suave y mínima, así como el uso de bajas temperaturas hasta el paso de activación. Además, el procesamiento de la sangre debe realizarse dentro de los 30 minutos posteriores a la venopunción y almacenarse a temperatura ambiente. El presente trabajo presenta una opción para disminuir el estrés de manipulación y el tiempo de experimentación. Para simplificar aún más el proceso, introdujimos un nuevo paso (como opción) en el protocolo, que consiste en eliminar los glóbulos rojos mediante la resuspensión suave y la aspiración de la capa de glóbulos rojos después de un solo procedimiento de hemólisis. Este paso reduce el estrés de manipulación y el tiempo de experimentación, ya que elimina la mayoría de los glóbulos rojos con un solo paso de hemólisis hipotónica. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las habilidades del operador afectan en gran medida la efectividad de este paso, y es posible que no siempre elimine por completo los glóbulos rojos. Además, la aspiración de glóbulos rojos puede conducir a una pérdida de neutrófilos, pero esto no afecta el rendimiento, ya que inicialmente se recuperaron más neutrófilos del gradiente cuando se recolectaron más cerca de la capa de glóbulos rojos. Por lo tanto, se recomienda la aspiración de glóbulos rojos si los ensayos no requieren la mayor pureza posible o si el operador ha obtenido buenos resultados de forma constante. Para las pruebas de detección que se presentan aquí, una pequeña cantidad de glóbulos rojos contaminantes (<3%) no interferiría con los resultados.

Para garantizar que todos los procedimientos se realicen a su debido tiempo, incluida la preparación de los reactivos, se presenta un flujo de trabajo (Figura 2) que detalla el cronograma y la división de tareas entre dos investigadores. Una vez finalizados todos los ensayos funcionales, las células restantes pueden prepararse para futuras investigaciones moleculares, como estudios ómicos por lisis celular con el tampón de lisis y el almacenamiento adecuados.

Producción de ROS
El estallido respiratorio es un sello distintivo del cebado y la activación de los neutrófilos^18,21, y la evaluación de la producción de ROS es un método común utilizado para estimar el estado de activación de los neutrófilos. Este estudio evaluó la producción de ROS utilizando dos enfoques: microscopía óptica y espectrofotometría.

La prueba NBT es un abordaje bien conocido para evaluar el estallido respiratorio en neutrófilos^22,23. Dos métodos comúnmente utilizados son los ensayos basados en microscopía óptica (o prueba de portaobjetos) y los ensayos basados en espectrofotometría 24,25,26. Aunque la microscopía óptica permite la visualización de detalles a nivel celular, es propensa al sesgo del usuario. Por lo tanto, la prueba de portaobjetos NBT sirve como complemento cualitativo al ensayo espectrofotométrico con respecto a las características fenotípicas, como los patrones de formación de formazano, la intensidad y la agregación celular.

Los pasos críticos tanto para el portaobjetos NBT como para las pruebas espectrofotométricas son la solubilización completa de NBT y formazan. Contrariamente a las recomendaciones del fabricante, el NBT no se disuelve bien en agua. Sin embargo, la homogeneización de NBT en DMSO durante al menos 15 minutos y luego la adición de agua/HBSS y vórtice durante 2 minutos proporciona una solubilización completa. Además, para analizar la absorbancia del formazán, se deben lograr dos pasos críticos: (1) liberación de cristales de formazano de las células mediante lisis de PMN y (2) solubilización completa de los cristales de formazano. Ambos pasos se lograron tratando el gránulo celular con SDS al 10%, como se sugirió recientemente²⁷, seguido de sonicación y análisis de absorbancia del sobrenadante a 570 nm.

Además, los resultados del NBT de los grupos de control negativo y positivo son el primer paso del cribado que se va a evaluar. Este paso debe mostrar una diferencia notable, ya que la evaluación de la producción de ROS a través de formazano indica si el proceso de aislamiento podría haber sido responsable de cambios no deseados en el estado de reposo de las células, ya sea por estimulación o inhibición.

Otros métodos, como la reducción del citocromo^{c 28} o el análisis de citometría de flujo²⁹, se utilizan a menudo para la detección de ROS; Sin embargo, considerando un enfoque de cribado, su aplicación requiere un tiempo de experimentación más largo, el uso de marcadores específicos e instrumentos costosos. La quimioluminiscencia de luminol/isoluminol es un método rápido y rentable para detectar ROS, al tiempo que permite la diferenciación de ROS intra y extracelulares. Sin embargo, se requiere un luminómetro para este método ^30,31. Aunque el costo del instrumento podría eludirse mediante el uso de una instalación, aún no sería apto para un análisis de detección realizado simultáneamente con otros ensayos.

Fagocitosis
La incubación de PMN/levadura proporciona una visión general de la capacidad y eficacia de la fagocitosis de neutrófilos contando el número de neutrófilos que realizan fagocitosis y el número de levaduras engullidas por neutrófilo. Sin embargo, como la partícula de levadura en sí misma es una señal de activación, la comparación del grupo control con PMN pretratada constituye un sistema de estimulación dual, que puede no mostrar cambios significativos, como se muestra en el CTRL frente al PMN tratado con fMLP (Figura 4). Sin embargo, este ensayo es útil para indicar si un modulador potencial generaría algún impacto en la fagocitosis. Con este ensayo se probó un nuevo péptido antimicrobiano, y los resultados indican una respuesta potencial interesante a esta combinación de estímulos, que recientemente se ha discutido como necesaria para una activación eficiente³².

El paso crítico para este ensayo es la tinción, ya que el análisis se vuelve poco fiable si el portaobjetos se mantiene en el panóptico n.º 3 (hematoxilina) durante ≥3 s. Esto se debe a que las células de levadura y los lóbulos nucleares de los neutrófilos no se pueden distinguir entre sí. Además, este enfoque permite el análisis morfológico de los neutrófilos después de la exposición a moduladores. La citometría de flujo es otra técnica eficaz para analizar la fagocitosis³³, aunque tiene limitaciones debido a la dificultad de discriminar entre partículas unidas a la membrana y engullidas y otros factores relacionados con el conjunto de cribado propuesto, como se discutió en el tema anterior. La misma limitación se observa en el método aquí descrito, aunque debe considerarse como un cribado inicial para guiar los estudios de seguimiento.

Migración en tiempo real
El protocolo de cribado en tiempo real se optimizó para evaluar la capacidad de migración de las PMN. Aunque un estudio previo sugirió que era necesario recubrir la parte inferior de la placa RTCA para que el ensayo de migración mostrara una diferencia entre el control negativo y el tratamiento con IL-8¹⁵, este estudio mostró valores de intervalo de confianza (IC) altos para las células tratadas con fMLP sin la adición de agentes de recubrimiento. Los resultados presentaron una alta reproducibilidad con una migración significativa a partir de los 12 min. Además, el análisis de ajuste de curvas de los datos de migración obtenidos puede revelar parámetros, como el índice máximo de la celda, así como el aumento y la disminución de la pendiente, que son útiles para comprender la dinámica de la migración, y pueden depender de la concentración o diferir entre condiciones. El mejor ajuste para las curvas de migración de neutrófilos (Figura 5) fue la función de Gompertz ajustada³⁴, que muestra que fMLP aumenta el índice celular máximo y la pendiente aumentada.

Se requiere especial atención para evitar burbujas en el sistema RTCA, ya que pueden bloquear el paso de las células a través de los electrodos, comprometiendo el experimento. Un factor limitante es el alto costo de las placas. Aunque las técnicas más baratas analizan la migración celular, carecen de una buena reproducibilidad o son difíciles y requieren mucho tiempo, como la cámara de Boyden³⁵. Por lo tanto, el RTCA es un análisis de migración fiable compatible con las otras pruebas de cribado aquí presentadas.

Redes
Por último, se desarrolló un ensayo prometedor, fácil y de bajo costo para una evaluación preliminar de la formación de NET utilizando microscopía óptica. Se derivó de la observación de láminas de fagocitosis, en las que PMA, un estímulo específico inductor de NET probado por su efecto sobre la capacidad de fagocitosis, también indujo una formación de estructura similar a una red en comparación con los grupos CTRL y fMLP. Este trabajo planteó la hipótesis de que esas estructuras podrían indicar la liberación de NET. Dicha hipótesis se probó tratando las muestras con DNasa I después de la activación, donde no se encontraron estructuras filamentosas en los neutrófilos activados por PMA. La suposición de que es probable que tales estructuras sean NETs se basa en el hecho de que PMA es citado como un conocido inductor de la formación de NET ^36,37, el hallazgo de estructuras similares por microscopía de fluorescencia utilizando marcadores específicos para NETs^38,39 y la degradación de NETs catalizada por la DNasa I^40,41. Es importante destacar que no se trata de un método para la confirmación de la formación de TNE, sino sólo de un cribado preliminar que sugiere la presencia de TNE. Aunque esta prueba tiene limitaciones, ya que los TNE pueden confundirse con artefactos de tinción, tiene un propósito relevante al sugerir la formación de TNE en un cribado rápido y de bajo costo que se puede realizar junto con otras pruebas funcionales. Una vez detectados como posiblemente relevantes para el estudio que se está examinando, los TNE pueden evaluarse más a fondo mediante microscopía confocal o electrónica⁴², como se explica más adelante.

En nuestro laboratorio, los nuevos péptidos antimicrobianos, que también pueden tener actividades inmunomoduladoras, se evalúan con frecuencia mediante este conjunto de ensayos de cribado para guiar mejor el análisis posterior de los efectos de algunos péptidos en los neutrófilos humanos, ya que algunos muestran interesantes propiedades de ROS⁴³, fagocitosis, migración y/o modulación de NET.

En conclusión, el NeutroFun Screen ofrece una valiosa herramienta para identificar posibles moduladores de la actividad de los neutrófilos de densidad normal a partir de un gran número de compuestos no probados. Sin embargo, es importante tener en cuenta que este método solo sirve como una evaluación preliminar. Después de esta selección inicial, las metodologías más costosas, avanzadas y que requieren mucho tiempo se pueden dirigir a funciones o vías específicas sugeridas por estos primeros resultados para la validación de datos. Para la producción de ROS, la fagocitosis y la formación de NET, existen métodos alternativos para la validación de datos y para obtener resultados cuantitativos adicionales. La visualización y cuantificación de los NET se puede realizar mediante análisis de microscopía de inmunofluorescencia, que determina la presencia y superposición de ADN extracelular y proteínas granulosas, como la mieloperoxidasa y la elastasa de neutrófilos, como se describió en detalle recientemente⁴². Las ROS desempeñan diferentes papeles cruciales en muchos procesos biológicos, por lo que su estudio está muy extendido y es diverso. Entre las metodologías más establecidas se encuentran las que hacen uso de anticuerpos, como el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y la inmunotransferencia de luminiscencia, o la detección de fluorescencia -como la citometría de flujo de células bajo diferentes marcajes- a través de DCFDA, espectroscopía EPR y mediciones de actividad enzimática⁴⁴. Del mismo modo, la evaluación robusta de la fagocitosis también se realiza de varias maneras; Los métodos alternativos incluyen la citometría de flujo sola^45,46 o combinada con microscopía de fluorescencia⁴⁷. La migración celular en tiempo real descrita es un ensayo robusto y suficiente que no requiere mayor validación y presenta parámetros que otras metodologías no pueden contemplar. Otras combinaciones de estos métodos podrían adaptarse mejor a escenarios específicos, pero en resumen, esto representa una combinación rápida y asequible que abarca muchas actividades de neutrófilos.

En resumen, este estudio tiene como objetivo proporcionar un conjunto de ensayos que consisten en metodologías simples, rápidas y de bajo costo para evaluar múltiples respuestas de neutrófilos a nuevas moléculas y condiciones como una forma de dirigir mejor los esfuerzos hacia metodologías avanzadas. Como limitaciones importantes, los resultados de los ensayos ROS, NET y fagocitosis deben considerarse preliminares y necesitan una validación adicional mediante ensayos más específicos y elaborados, y aquellos que se basan en el recuento celular de microscopía no automatizada son propensos a sesgos inconscientes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CIM-Placa 16	Agilent
Lector de placas CLARIOstar	BMG LABTECH		US 9,733,124 Detalles del producto: Software de análisis de datos MARS
Dimethyl sulfoxide	Dinâ mica	1582
DNAse I	Sigma - Aldrich	DN 25
Ácido etilendiaminotetraacético sal disódica dihidratada	Sigma - Aldrich	E5134
Tinción panóptica rápida	Laborclin	620529
Portaobjetos de vidrio	Exacta	7102
Hank' s Solución salina equilibrada con calcio, con magnesio, sin rojo fenol.	Sigma - Aldrich	55037C
Hank' s Solución salina equilibrada sin cloruro de calcio, sulfato de magnesio y bicarbonato de sodio.	Sigma - Aldrich	H4641
Heparina	Blau
Cabina de flujo laminar	Veco	VLFS-12
Microscopio	Zeiss	415501-0101-002	Puntos Clave: Bloque de mezcla Primostar 1
	BIOER	MB-102
Neubauer mejorado de líneas brillantes	Nuevo Optik	1110000
N-formil-metionil-leucil-fenilalanina	Sigma - Aldrich	F3506
Nitroblue tetrazolio	Neon	CAS 298-83-9
Percoll	Cytiva	17089101	medios
de separación Phorbol 12-miristato 13-acetato	Sigma - Aldrich	P8139
Comprimido de solución salina tamponada con fosfato	Sigma - Aldrich	P4417
ROTOFIX 32 A	Hettich	1206
Saccharomyces cerevisiae	Fleischmann
Safranina	Sigma - Aldrich	50240
Dodecil sulfato de sodio	Cytiva	17-1313-01
Sonicator	Qsonica	Q125
Solución de azul de tripán	Vetec	C.I. 23850
Vortex Genie 2	Scientific Industries, Inc.	0K-0500-902
xCELLigence Análisis de células en tiempo real (RTCA) DP (doble propósito)	Agilent	380601050	Detalles del producto: Sistema RTCA compuesto por hardware de detección, placas de celda y software