Este protocolo presenta una forma única de generar cultivos celulares del sistema nervioso central a partir de cerebros embrionarios de ratón del día 17 para la investigación neuro(inmuno)lógica. Este modelo se puede analizar utilizando varias técnicas experimentales, incluyendo RT-qPCR, microscopía, ELISA y citometría de flujo.
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Artículo de método
Establecimiento de cultivos mixtos de células neuronales y gliales a partir de cerebros embrionarios de ratones para estudiar la infección y la inmunidad innata
En este artículo
Resumen
Resumen
Los modelos del sistema nervioso central (SNC) deben recapitular la compleja red de células interconectadas que se encuentran in vivo. El SNC consiste principalmente en neuronas, astrocitos, oligodendrocitos y microglía. Debido a los crecientes esfuerzos para reemplazar y reducir el uso de animales, se han desarrollado una variedad de sistemas de cultivo celular in vitro para explorar las propiedades celulares innatas, que permiten el desarrollo de terapias para infecciones y patologías del SNC. Si bien ciertas preguntas de investigación pueden ser abordadas por sistemas de cultivo celular basados en humanos, como las células madre pluripotentes (inducidas), trabajar con células humanas tiene sus propias limitaciones con respecto a la disponibilidad, los costos y la ética. Aquí, describimos un protocolo único para aislar y cultivar células de cerebros embrionarios de ratones. Los cultivos celulares neuronales mixtos resultantes imitan varias poblaciones celulares e interacciones que se encuentran en el cerebro in vivo. En comparación con los métodos equivalentes actuales, este protocolo imita más de cerca las características del cerebro y también obtiene más células, lo que permite investigar más condiciones experimentales de un ratón preñado. Además, el protocolo es relativamente fácil y altamente reproducible. Estos cultivos se han optimizado para su uso en varias escalas, incluidas las pantallas de alto rendimiento basadas en 96 pocillos, el análisis de microscopía de 24 pocillos y los cultivos de 6 pocillos para citometría de flujo y análisis de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR). Este método de cultivo es una herramienta poderosa para investigar la infección y la inmunidad dentro del contexto de algunas de las complejidades del SNC con la conveniencia de los métodos in vitro .
Introducción
Mejorar nuestra comprensión del sistema nervioso central (SNC) es fundamental para mejorar las opciones terapéuticas para muchas enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas. El SNC, una compleja red de células interconectadas dentro del cerebro, la médula espinal y los nervios ópticos, comprende neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y sus células inmunes innatas, la microglía1. Un enfoque in vitro a menudo puede reducir drásticamente el número de ratones necesarios para realizar una investigación significativa; sin embargo, la naturaleza compleja del SNC hace imposible recapitular la situación in vivo utilizando líne....
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Protocolo
Todos los experimentos con animales cumplieron con las leyes y pautas locales para el uso de animales, y fueron aprobados por el Comité de Revisión Ética local de la Universidad de Glasgow. Los animales fueron alojados en condiciones específicas libres de patógenos de acuerdo con la Ley de Procedimientos Científicos de Animales del Reino Unido de 1986, bajo los auspicios de una Licencia de Proyecto del Ministerio del Interior del Reino Unido. Para este estudio, se utilizaron ratones adultos C57BL / 6J criados internamente. Se recomienda el uso de mujeres jóvenes (8-12 semanas) debido a la mayor tasa de éxito del embarazo; Los machos pueden ser reutilizados para múltip....
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Resultados
Microscopia
Los cultivos cultivados en cubreobjetos de vidrio son ideales para analizar por microscopía. Para visualizar el desarrollo de los cultivos, los cubreobjetos se fijaron en paraformaldehído al 4% (PFA) en múltiples puntos de tiempo desde DIV0 (una vez que las células se unieron) hasta DIV28. Los cultivos se tiñeron para imágenes de inmunofluorescencia como se describió anteriormente5 utilizando tres combinaciones de tinción diferentes: NG2 (oligodendrocitos inmaduros).......
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Discusión
El SNC es una red compleja que se extiende desde el cerebro hasta la médula espinal y consta de muchos tipos de células, predominantemente neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y microglía1. Como cada célula tiene un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis y la generación de respuestas apropiadas a los desafíos en el SNC 9,10,11, un sistema de cultivo que contenga todos estos tipos de células es una herramienta .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a los miembros de los laboratorios de Edgar y Linington, en particular al Prof. Chris Linington, la Dra. Diana Arseni y la Dra. Katja Muecklisch, por sus consejos, comentarios útiles y asistencia para alimentar las culturas mientras establecemos estas culturas. Un agradecimiento especial al Dr. Muecklisch por proporcionar los puntos de partida para las tuberías de Cell Profiler. Este trabajo fue apoyado por la Sociedad de EM (subvención 122) y la fundación Yuri y Lorna Chernajovsky a MP; Financiación de la Universidad de Glasgow a JC y MP; y Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) y Medical Research Council (MRV0109721) a GJG.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10x Tripsina | Sigma | T4549-100ML | Para digerir tejidos |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Poner 8 platos de 35 mm por 1 plato de 140 mm |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | Para recoger células en pellets para su resuspensión en medios de enchapado |
| Aguja de 18 G | Henke Sass Wolf | 4710012040 | Para la trituración de muestras |
| Aguja de 21 G | BD | 304432 | Para la trituración de la muestra Aguja de |
| 23 G | Henke Sass Wolf | 4710006030 | Para la trituración de la muestra TC de |
| 35 mm Plato | Corning | 430165 | Placa de salida 3 cubreobjetos recubiertos de PLL por 1 plato de 35 mm |
| Jeringa de 5 mL | Fisher 15869152 | Para la trituración de la muestra | |
| Placa de 6 pocillos | Corning | 3516 | Para enchapar células para RT-qPCR, y flujo citometría |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | Para poner cerebros intp |
| 96 placa de pocillos | Corning | 3596 | Para enchapar células para pruebas de alto rendimiento |
| ACSA-2 Anticuerpo, anti-ratón, PE | Miltenyi | 130-123-284 | Para la tinción por citometría de flujo de astrocitos |
| Pinzas angulares | Dumont | 0108-5/45-PO | Para disección |
| Biotina | Sigma | B4501 | para DM+/- |
| Ácido bórico | Sigma | B6768-500G | Para tampón de ácido bórico |
| Brilliant Violet 421 anti-ratón Anticuerpo CD24, clon M1-69 | Biolegend | 101825 | Para la tinción por citometría de flujo de neuronas y astrocitos |
| Brilliant Violet 605 anti-ratón Anticuerpo CD45, clon 30-F11 | Biolegend | 103139 | Para la tinción de microglía |
| por citometría de flujoBrilliant Violet 785 anti-ratón/humano Anticuerpo CD11b, clon M1/70 | Biolegend | 101243 | Para la tinción por citometría de flujo de microglía |
| BSA Fracción V | Sigma | A3059-10G | Para inhibidor de SD |
| CNP | Abcam | AB6319 | Oligodendrocitos maduros |
| Cubreobjetos | VWR | 631-0149 | Para extraer células para microscopía |
| Tijeras de disección | Sigma | S3146-1EA | Para disección |
| DMEM Glucosa alta, piruvato de sodio, L-glutamina | Gibco | 21969-035 | Para DM+/-, y para medios de recubrimiento |
| DNasa I | Thermofisher 18047019 | para inhibidor de SD, puede usar esta u otra Dnasa de sigma | |
| DNasa I | Sigma | D4263 | para inhibidor de SD, puede usar esta u otra Dnasa de thermofisher |
| eBioscience Tinte de viabilidad fijable eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Mancha viva / muerta |
| Pinzas finas | Dumont | 0102-SS135-PO | Para disección |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocitos |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | Para medios de recubrimiento |
| HBSS sin Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | Para que los cerebros se agreguen al |
| suero | de caballoGibco | 26050-070 | Para medios de recubrimiento |
| Hidrocortisona | Sigma | H0396 | Para DM+/- |
| IBA1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulina | Sigma | I1882 | Para DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | Para inhibidor de SD |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | mielina |
| Ratón CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | Kit ELISA para cuantificar la concentración de CCL5 en sobrenadantes de placa de 96 pocillos |
| N1 suplemento de medios | Sigma | N6530-5ML | para DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Células madre/progenitoras neuronales |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Cuerpo de células neuronales |
| NG2 | Sigma | AB5320 | oligodendrocitos inmaduros |
| , antihumano/ratón/rata, APC | Miltenyi | 130-119-155 | Para la tinción por citometría de flujo de oligodendrocitos |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | Para DM+/-, y para medios de recubrimiento |
| Poly-L-Lisinahidrobromuro | Sigma | P1274 | Para ácido bórico / solución de poli-L-lisina para recubrir cubreobjetos |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axones |
| Tetraborato de sodio | Sigma | 221732-100G | Para tampón de ácido bórico |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | Para lisar células para RT-qPCR |
| Inhibidor de tripsina de soja | Sigma | T9003-100MG | para inhibidor de SD |
Referencias
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E.
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Reimpresiones y permisos
