Este protocolo presenta una forma única de generar cultivos celulares del sistema nervioso central a partir de cerebros embrionarios de ratón del día 17 para la investigación neuro(inmuno)lógica. Este modelo se puede analizar utilizando varias técnicas experimentales, incluyendo RT-qPCR, microscopía, ELISA y citometría de flujo.
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Artículo de método
Establecimiento de cultivos mixtos de células neuronales y gliales a partir de cerebros embrionarios de ratones para estudiar la infección y la inmunidad innata
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Resumen
Resumen
Los modelos del sistema nervioso central (SNC) deben recapitular la compleja red de células interconectadas que se encuentran in vivo. El SNC consiste principalmente en neuronas, astrocitos, oligodendrocitos y microglía. Debido a los crecientes esfuerzos para reemplazar y reducir el uso de animales, se han desarrollado una variedad de sistemas de cultivo celular in vitro para explorar las propiedades celulares innatas, que permiten el desarrollo de terapias para infecciones y patologías del SNC. Si bien ciertas preguntas de investigación pueden ser abordadas por sistemas de cultivo celular basados en humanos, como las células madre pluripotentes (inducidas), trabajar con células humanas tiene sus propias limitaciones con respecto a la disponibilidad, los costos y la ética. Aquí, describimos un protocolo único para aislar y cultivar células de cerebros embrionarios de ratones. Los cultivos celulares neuronales mixtos resultantes imitan varias poblaciones celulares e interacciones que se encuentran en el cerebro in vivo. En comparación con los métodos equivalentes actuales, este protocolo imita más de cerca las características del cerebro y también obtiene más células, lo que permite investigar más condiciones experimentales de un ratón preñado. Además, el protocolo es relativamente fácil y altamente reproducible. Estos cultivos se han optimizado para su uso en varias escalas, incluidas las pantallas de alto rendimiento basadas en 96 pocillos, el análisis de microscopía de 24 pocillos y los cultivos de 6 pocillos para citometría de flujo y análisis de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR). Este método de cultivo es una herramienta poderosa para investigar la infección y la inmunidad dentro del contexto de algunas de las complejidades del SNC con la conveniencia de los métodos in vitro .
Introducción
Mejorar nuestra comprensión del sistema nervioso central (SNC) es fundamental para mejorar las opciones terapéuticas para muchas enfermedades neuroinflamatorias y neurodegenerativas. El SNC, una compleja red de células interconectadas dentro del cerebro, la médula espinal y los nervios ópticos, comprende neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y sus células inmunes innatas, la microglía1. Un enfoque in vitro a menudo puede reducir drásticamente el número de ratones necesarios para realizar una investigación significativa; sin embargo, la naturaleza compleja del SNC hace imposible recapitular la situación in vivo utilizando líneas celulares. Los cultivos celulares neuronales mixtos proporcionan una herramienta de investigación extremadamente valiosa para investigar cuestiones de neuro(inmuno)logía en un modelo relevante, en línea con los principios de Reemplazo, Reducción y Refinamiento (3R) 2,3.
Thomson et al. describieron un método de cultivo celular utilizando células de la médula espinal prenatal que se diferencian en todos los tipos principales de células del SNC antes mencionados4. Este sistema también tiene formación de sinapsis, axones mielinizados y nodos de Ranvier. La principal limitación de este método de cultivo es que, al ser la médula espinal, no modela de manera útil el cerebro, y los rendimientos celulares de la médula espinal del día embrionario 13 (E13) son constrictivos. Por lo tanto, esto limita el número de condiciones experimentales que se pueden investigar. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo desarrollar un nuevo sistema de cultivo celular que recapitule las características del cerebro con un mayor rendimiento celular para reducir los requisitos de los animales.
Usando Thomson et al. como punto de partida, desarrollamos un modelo de cultivo celular derivado puramente de cerebros de ratones prenatales. Estos cultivos tienen las mismas poblaciones celulares, interconectividad y opciones de tratamiento que los cultivos de la médula espinal, excepto que hay menos mielinización en comparación. Sin embargo, tener un modelo in vitro del SNC con un rendimiento celular aproximadamente tres veces mayor es más eficiente, ya que requiere menos ratones y menos tiempo procesando embriones. Optimizamos este sistema de cultivo único para múltiples aplicaciones y escalas aguas abajo, incluido el uso de cubreobjetos de vidrio para el análisis de microscopía y varios tamaños de placas de pozos de plástico, incluidas placas de 96 pocillos para investigación de alto rendimiento.
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Protocolo
Todos los experimentos con animales cumplieron con las leyes y pautas locales para el uso de animales, y fueron aprobados por el Comité de Revisión Ética local de la Universidad de Glasgow. Los animales fueron alojados en condiciones específicas libres de patógenos de acuerdo con la Ley de Procedimientos Científicos de Animales del Reino Unido de 1986, bajo los auspicios de una Licencia de Proyecto del Ministerio del Interior del Reino Unido. Para este estudio, se utilizaron ratones adultos C57BL / 6J criados internamente. Se recomienda el uso de mujeres jóvenes (8-12 semanas) debido a la mayor tasa de éxito del embarazo; Los machos pueden ser reutilizados para múltiples rondas de reproducción. La Figura 1 representa una descripción esquemática del método descrito para generar cultivos neuronales y gliales mixtos.
1. Preparación de los consumibles de cultivo de tejidos
- Prepare los platos y/o platos que contengan cubreobjetos de microscopía dentro de un gabinete de seguridad de Clase 2. Esterilizar todos los reactivos o autoclaves para asegurar la esterilidad durante el período de cultivo.
- Agregue el volumen apropiado de BA-PLL (13.2 μg/mL poli-L-lisinahidrobromuro [PLL] en tampón de ácido bórico [BA] [50 mM de ácido bórico, 12.5 mM de tetraborato de sodio, pH 8.5]; ver Tabla de materiales) a cada pocillo (1,000 μL/pocillo en una placa de 6 pocillos, 100 μL/pocillo en una placa de 96 pocillos; los volúmenes se resumen en la Tabla 1). Para los cubreobjetos de microscopía, agregue 20 ml de BA-PLL a una placa de cultivo de tejidos de 9 cm de diámetro que contenga 200 cubreobjetos estériles y agite para distribuir uniformemente.
- Incubar a 37 °C durante 1-2 h.
- Retire la solución de BA-PLL de cada pocillo o plato que contenga cubreobjetos de microscopía y lávelos agregando 20 ml de agua estéril, agitando los cubreobjetos y luego retirando el agua. Repita este paso de lavado tres veces. Para un plato que contiene cubreobjetos, deje agua estéril en el plato de cultivo de tejidos en el lavado final para quitar fácilmente los cubreobjetos.
- Retire la mayor cantidad de líquido posible con una pipeta estéril y deje secar durante al menos 2 h durante toda la noche.
- Conservar las placas recubiertas a 4 °C durante un máximo de 2 meses.
NOTA: La solución de ácido bórico preparado con poli-l-lisina (BA-PLL) se puede reutilizar hasta tres veces, agregando nueva PLL cada vez. Conservar el BA-PLL a 4 °C. Los platos se tratan con BA-PLL, ya que el PLL permite que las células se peguen y crezcan. Sin este tratamiento, las células se levantarán después de aproximadamente 1 semana de cultivo y ya no podrán diferenciarse.
2. Disección de cerebros embrionarios E17
- Co-casa uno o varios ratones hembra con un ratón macho. Revise a las hembras diariamente para ver si hay un tapón de moco, lo que indica que se ha producido el apareamiento.
NOTA: Cualquier ratón hembra "tapado" debe separarse del macho para garantizar la fecha correcta de inicio de la gestación. Los ratones pueden ser pesados para confirmar el embarazo o monitoreados visualmente. - Sacrificar a la ratona preñada en E17 utilizando métodos apropiados de acuerdo con las directrices y leyes locales de bienestar animal, por ejemplo, aumentando la concentración de dióxido de carbono (CO2), una sobredosis de anestesia letal o la dislocación del cuello.
NOTA: El método elegido no debe interrumpir los embriones. Para este estudio, la exposición a una concentración creciente de gas de dióxido de carbono seguida de la confirmación de la muerte por corte de la arteria femoral se utilizó para sacrificar a las madres embarazadas. - Coloque el ratón preñado sacrificado sobre su espalda en una tabla de disección; Si bien no es necesario fijarlo, podría hacerlo más fácil para los investigadores sin experiencia. Pellizque la línea media del abdomen con fórceps. Con unas tijeras afiladas, abra el abdomen a través de la piel y el peritoneo sobre la línea media desde los genitales hasta la caja torácica, teniendo cuidado de no perforar el útero.
- El útero del ratón tiene dos cuernos, cada uno típicamente contiene de uno a cinco embriones. Retire el útero que contiene los embriones de la madre e inmediatamente colóquelo en hielo.
- Corte a través del saco vitelino en el lado de las placentas, teniendo cuidado de no dañar los embriones, y retire los embriones de su saco vitelino.
- Decapitar inmediatamente los embriones. Agregue las cabezas decapitadas en un plato con la solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) sin calcio (Ca 2+) y magnesio (Mg2+) (HBSS-/-) en hielo.
NOTA: Si se requiere genotipado, se puede quitar la cola en esta etapa para el análisis genético. Cuando se esperan múltiples genotipos, las cabezas de cada embrión deben mantenerse separadas para el cultivo. - Usando pinzas en ángulo, coloque la cabeza de lado mirando hacia la izquierda.
- Perfore el ojo con un borde de los fórceps, sujetando firmemente la barbilla con el otro.
- Comenzando en la nuca, rasgue suavemente la piel del cuero cabelludo a lo largo de la línea media hacia la punta del hocico.
- Al entrar a través de la médula espinal, notable como un óvalo blanco, use los fórceps en ángulo para abrir el cráneo a lo largo de la línea media, exponiendo el cerebro.
- Despegue suavemente el cráneo del lado hacia arriba, exponiendo el cerebro.
- Levante el cerebro fuera del cráneo, desechando el cráneo una vez que el cerebro se haya eliminado por completo.
- Usando los fórceps, retire las meninges, que se notan como una membrana delgada con vasos sanguíneos densos.
- Coloque los cerebros en una joya (consulte la Tabla de materiales) que contenga 2 ml de HBSS-/- en hielo.
- Repita los pasos 2.6 a 2.13 con los cerebros restantes, sumando hasta cuatro cerebros por bisutería.
- Agregue 250 μL de tripsina 10x a la bisutería y triture los cerebros agitando la bisutería. Incubar durante 15 min a 37 °C.
NOTA: Todos los pasos a partir de este punto en adelante deben realizarse en una campana de cultivo de tejido estéril. - Descongele 2 ml de inhibidor de la tripsina de soja (SD) (Leibovitz L-15, 0,52 mg/ml inhibidor de tripsina de soja, 40 μg/ml DNasa I, 3 mg/ml de albúmina sérica bovina [BSA] fracción V; ver Tabla de materiales) de -20 °C colocándola a 37 °C.
- Agregue 2 ml de inhibidor SD a cada bisutería que contenga cerebros (por bisutería que contenga hasta cuatro cerebros), agitando la bisutería nuevamente para dispersarla uniformemente.
NOTA: El inhibidor de SD disminuye la actividad de la tripsina para evitar la digestión innecesaria de las muestras y preservar la viabilidad celular. - Sin centrifugación, retire 2 ml del sobrenadante de cada bisutería y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 15 ml, teniendo cuidado de no transferir grupos celulares.
- Triturar las células restantes en la bisutería con una aguja de 19 G conectada a una jeringa de 5 ml aspirando la suspensión dos veces. Esto creará una mezcla espesa similar al moco.
- Repita dos veces más con una aguja de 21 G. Si quedan grumos, triturar una vez más con la aguja de 21 G.
- Transfiera las células de la bisutería al mismo tubo centrífugo de 15 ml (a partir del paso 2.18) utilizando una aguja de 23 G.
- Centrifugar a 200 x g a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
- Retirar todo el sobrenadante con una pipeta serológica de 5 ml y transferirlo a otro tubo de centrífuga de 15 ml, teniendo cuidado de no alterar el pellet suelto en el fondo que contiene las células requeridas.
- Centrifugar de nuevo el sobrenadante a 200 x g a RT durante 5 min.
NOTA: Este paso no es esencial, pero si uno requiere muchas células o tiene pocos embriones, se podría realizar este paso para recuperar tantas células como sea posible del sobrenadante. - Usando 10 ml de medios de recubrimiento (PM) (49% de medio de águila modificado de Dulbecco [DMEM], 1% de penicilina/estreptomicina [Pen/Strep], 25% de suero de caballo, 25% de HBSS con Ca 2+ y Mg2 + [HBSS+ /+]; ver Tabla de materiales), combine y resuspenda los dos gránulos juntos para crear una suspensión de células completas.
- Contar las células usando azul de tripano y un hemocitómetro o contador celular digital, y diluir la suspensión celular con PM a una concentración de 1.8 x 106 células/ml.
3. Recubrimiento de las células
- Agregue el volumen requerido de la suspensión celular al formato requerido como se detalla en la Tabla 1: 1,000 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 50 μL por pocillo en formato de 96 pocillos o 100 μL por cubreobjetos.
- Incubar durante 2-4 h a 37 °C con 5%-7% deCO2. Verifique que las células se hayan adherido con un microscopio invertido.
- Retire el medio y rellene con un nuevo medio de diferenciación (DM+: DM- incluyendo insulina de 10 μg/ml. DM-: DMEM, 1% Pen/Strep, 50 nM hidrocortisona, 10 ng/mL de biotina, 2.5 mL 100x N1 suplemento de medios; véase la Tabla de materiales). Los volúmenes se detallan en la Tabla 1. Presione cualquier cubreobjetos flotantes con una punta de pipeta estéril.
4. Mantener las culturas
NOTA: Estos cultivos requieren alimentación tres veces por semana para apoyar el crecimiento y la diferenciación óptimos. Los cultivos alcanzarán una salud y madurez óptimas para experimentos en DIV (días in vitro) 21. Las células se pueden mantener en cultivo hasta por 28 días, después de lo cual los cultivos degeneran rápidamente.
- Tres veces por semana hasta DIV12, sustituir parte del sobrenadante por DM+ fresca eliminando 500 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 50 μL por pocillo en formato de 96 pocillos o 500 μL por plato que contenga tres cubreobjetos, y añadiendo 600 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 60 μL por pocillo en formato de 96 pocillos, o 600 μL por plato de cubreobjetos (Tabla 1).
- Tres veces por semana a partir de la DIV13, sustituir parte del sobrenadante por DM- fresca eliminando 500 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 50 μL por pocillo en formato de 96 pocillos o 500 μL por plato que contenga tres cubreobjetos, y añadiendo 600 μL por pocillo en formato de 6 pocillos, 60 μL por pocillo en formato de 96 pocillos, o 600 μL por plato de cubreobjetos (Tabla 1).
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Resultados
Microscopia
Los cultivos cultivados en cubreobjetos de vidrio son ideales para analizar por microscopía. Para visualizar el desarrollo de los cultivos, los cubreobjetos se fijaron en paraformaldehído al 4% (PFA) en múltiples puntos de tiempo desde DIV0 (una vez que las células se unieron) hasta DIV28. Los cultivos se tiñeron para imágenes de inmunofluorescencia como se describió anteriormente5 utilizando tres combinaciones de tinción diferentes: NG2 (oligodendrocitos inmaduros)...
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Discusión
El SNC es una red compleja que se extiende desde el cerebro hasta la médula espinal y consta de muchos tipos de células, predominantemente neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y microglía1. Como cada célula tiene un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis y la generación de respuestas apropiadas a los desafíos en el SNC 9,10,11, un sistema de cultivo que contenga todos estos tipos de células es una herramienta ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a los miembros de los laboratorios de Edgar y Linington, en particular al Prof. Chris Linington, la Dra. Diana Arseni y la Dra. Katja Muecklisch, por sus consejos, comentarios útiles y asistencia para alimentar las culturas mientras establecemos estas culturas. Un agradecimiento especial al Dr. Muecklisch por proporcionar los puntos de partida para las tuberías de Cell Profiler. Este trabajo fue apoyado por la Sociedad de EM (subvención 122) y la fundación Yuri y Lorna Chernajovsky a MP; Financiación de la Universidad de Glasgow a JC y MP; y Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) y Medical Research Council (MRV0109721) a GJG.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10x Tripsina | Sigma | T4549-100ML | Para digerir tejidos |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Poner 8 platos de 35 mm por 1 plato de 140 mm |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | Para recoger células en pellets para su resuspensión en medios de enchapado |
| Aguja de 18 G | Henke Sass Wolf | 4710012040 | Para la trituración de muestras |
| Aguja de 21 G | BD | 304432 | Para la trituración de la muestra Aguja de |
| 23 G | Henke Sass Wolf | 4710006030 | Para la trituración de la muestra TC de |
| 35 mm Plato | Corning | 430165 | Placa de salida 3 cubreobjetos recubiertos de PLL por 1 plato de 35 mm |
| Jeringa de 5 mL | Fisher 15869152 | Para la trituración de la muestra | |
| Placa de 6 pocillos | Corning | 3516 | Para enchapar células para RT-qPCR, y flujo citometría |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | Para poner cerebros intp |
| 96 placa de pocillos | Corning | 3596 | Para enchapar células para pruebas de alto rendimiento |
| ACSA-2 Anticuerpo, anti-ratón, PE | Miltenyi | 130-123-284 | Para la tinción por citometría de flujo de astrocitos |
| Pinzas angulares | Dumont | 0108-5/45-PO | Para disección |
| Biotina | Sigma | B4501 | para DM+/- |
| Ácido bórico | Sigma | B6768-500G | Para tampón de ácido bórico |
| Brilliant Violet 421 anti-ratón Anticuerpo CD24, clon M1-69 | Biolegend | 101825 | Para la tinción por citometría de flujo de neuronas y astrocitos |
| Brilliant Violet 605 anti-ratón Anticuerpo CD45, clon 30-F11 | Biolegend | 103139 | Para la tinción de microglía |
| por citometría de flujoBrilliant Violet 785 anti-ratón/humano Anticuerpo CD11b, clon M1/70 | Biolegend | 101243 | Para la tinción por citometría de flujo de microglía |
| BSA Fracción V | Sigma | A3059-10G | Para inhibidor de SD |
| CNP | Abcam | AB6319 | Oligodendrocitos maduros |
| Cubreobjetos | VWR | 631-0149 | Para extraer células para microscopía |
| Tijeras de disección | Sigma | S3146-1EA | Para disección |
| DMEM Glucosa alta, piruvato de sodio, L-glutamina | Gibco | 21969-035 | Para DM+/-, y para medios de recubrimiento |
| DNasa I | Thermofisher 18047019 | para inhibidor de SD, puede usar esta u otra Dnasa de sigma | |
| DNasa I | Sigma | D4263 | para inhibidor de SD, puede usar esta u otra Dnasa de thermofisher |
| eBioscience Tinte de viabilidad fijable eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Mancha viva / muerta |
| Pinzas finas | Dumont | 0102-SS135-PO | Para disección |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocitos |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | Para medios de recubrimiento |
| HBSS sin Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | Para que los cerebros se agreguen al |
| suero | de caballoGibco | 26050-070 | Para medios de recubrimiento |
| Hidrocortisona | Sigma | H0396 | Para DM+/- |
| IBA1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulina | Sigma | I1882 | Para DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | Para inhibidor de SD |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | mielina |
| Ratón CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | Kit ELISA para cuantificar la concentración de CCL5 en sobrenadantes de placa de 96 pocillos |
| N1 suplemento de medios | Sigma | N6530-5ML | para DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Células madre/progenitoras neuronales |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Cuerpo de células neuronales |
| NG2 | Sigma | AB5320 | oligodendrocitos inmaduros |
| , antihumano/ratón/rata, APC | Miltenyi | 130-119-155 | Para la tinción por citometría de flujo de oligodendrocitos |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | Para DM+/-, y para medios de recubrimiento |
| Poly-L-Lisinahidrobromuro | Sigma | P1274 | Para ácido bórico / solución de poli-L-lisina para recubrir cubreobjetos |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axones |
| Tetraborato de sodio | Sigma | 221732-100G | Para tampón de ácido bórico |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | Para lisar células para RT-qPCR |
| Inhibidor de tripsina de soja | Sigma | T9003-100MG | para inhibidor de SD |
Referencias
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