Protocolo de ensayo de cizallamiento para la determinación de las propiedades del material unicelular

Resumen

Este protocolo describe la cuantificación de las propiedades mecánicas de líneas celulares cancerosas y no cancerosas in vitro. Las diferencias conservadas en la mecánica de las células cancerosas y normales pueden actuar como un biomarcador que puede tener implicaciones en el pronóstico y el diagnóstico.

Resumen

La biomecánica irregular es un sello distintivo de la biología del cáncer sujeto a un extenso estudio. Las propiedades mecánicas de una célula son similares a las de un material. La resistencia de una célula al estrés y la tensión, su tiempo de relajación y su elasticidad son propiedades que se pueden derivar y comparar con otros tipos de células. La cuantificación de las propiedades mecánicas de las células cancerosas (malignas) frente a las normales (no malignas) permite a los investigadores descubrir aún más los fundamentos biofísicos de esta enfermedad. Si bien se sabe que las propiedades mecánicas de las células cancerosas difieren consistentemente de las propiedades mecánicas de las células normales, falta un procedimiento experimental estándar para deducir estas propiedades de las células en cultivo.

Este documento describe un procedimiento para cuantificar las propiedades mecánicas de células individuales in vitro utilizando un ensayo de cizallamiento de fluidos. El principio detrás de este ensayo consiste en aplicar tensión de cizallamiento de fluido en una sola célula y monitorear ópticamente la deformación celular resultante a lo largo del tiempo. Las propiedades mecánicas celulares se caracterizan posteriormente mediante el análisis de correlación digital de imágenes (DIC) y el ajuste de un modelo viscoelástico apropiado a los datos experimentales generados a partir del análisis DIC. En general, el protocolo descrito aquí tiene como objetivo proporcionar un método más eficaz y específico para el diagnóstico de cánceres difíciles de tratar.

Introducción

El estudio de las diferencias biofísicas entre las células cancerosas y no cancerosas permite nuevas oportunidades diagnósticas y terapéuticas¹. Comprender cómo las diferencias en biomecánica / mecanobiología contribuyen a la progresión tumoral y la resistencia al tratamiento revelará nuevas vías para la terapia dirigida y el diagnóstico temprano².

Si bien se sabe que las propiedades mecánicas de las células cancerosas difieren de las células normales (por ejemplo, la viscoelasticidad de la membrana plasmática y la envoltura nuclear)^3,4,5,

Protocolo

1. Preparación para el ensayo de cizallamiento unicelular

1. Cultivo celular
   1. Sembrar aproximadamente 50.000 células individuales suspendidas en una placa de Petri de 35 mm x 10 mm que contenga 2 ml de medios de cultivo.
      NOTA: Vórtice las células suspendidas antes de la siembra para separar los agregados celulares.
   2. Incubar las células a 37 °C y dejar entre 10 y 48 h para la unión celular y la formación completa de proteínas citoesqueléticas.
      NOTA: Considere la duración de la unión celular, así como las tasas de proliferación y crecimiento, para garantizar un crecimiento y unión celular adecuados evitando la agregación cel....

Resultados

El protocolo de ensayo de cizallamiento junto con el análisis de deformación utilizando DIC y un modelo viscoelástico tiene éxito en la cuantificación de las propiedades mecánicas de una sola célula in vitro. Este método se ha probado en líneas celulares humanas y murinas, incluidas células mamarias humanas normales (MCF-10A)^3,4,9, células de cáncer de mama triple negativo menos metastásico (MDA-MB-468)3, células de cáncer de mama triple negativo (MDA-MB-231)3, células de osteosarcoma hum.......

Discusión

El método de ensayo de cizallamiento, que incluye la creación de un entorno pseudomecanobiológico para simular la interacción de las células con el microambiente mecánico circundante y sus respuestas a las tensiones mecánicas, ha producido un catálogo de propiedades mecánicas celulares, cuyos patrones muestran atipia física conservada entre líneas celulares cancerosas 3,4,5,7,8

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CÉLULAS FUERTES
,25%, EDTA 2,21 mM, bicarbonato de sodio 1x[-] Corning		25-053-CI	Para el desprendimiento celular del sustrato en cultivos celulares
15 mL Tubos de centrífuga	Falcon by Corning	05-527-90
Placas de Petri de 35 mm	Corning	430165
50 mL Tubos de	centrífugaFalcon by Corning	14-432-22
Centrífuga	cualquiera		Para cultivo de células estériles
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) 1x	Corning	10-013-cv	O cualquier otro medio para el cultivo de células. DMEM se utilizó para el cultivo de células U87
Guantes	: cualquiera		Para el cultivo de células estériles
: Heracell Vios 160i CO2 Incubadora	Thermo Scientific	51033770	Para la incubación durante el cultivo celular
Capucha	cualquiera		Para el cultivo de células estériles
Micropipeta	cualquiera		Para el cultivo de células estériles
Puntas de micropipeta	cualquiera		Para cultivo celular estéril
Microscopio	Leica/any		Para cultivo celular estéril
Solución salina tamponada con fosfato sin calcio y magnesio PBS, 1x	Corning	21-040-CM
Pipetman	cualquiera		Para cultivo celular estéril
Puntas de pipeta	cualquiera		Para cultivo celular estéril
Precision GP 10 incubadora de líquidos	Matraz Thermo Scientific	TSGP02
T25 Corning		430639
T75	Corning	430641U
CORTE FUERTE
100 mL Vaso de precipitados	cualquiera		Para crear DMEM + metilcelulosa medios de cizallamiento viscosos
DMEM	Corning
Cámara de flujo + junta de goma	Glycotech	31-001 Kit de cámara de	flujo circular (para placas de cultivo de tejidos de 35 mm)
Reómetro híbrido	HR-2 Discovery Reómetro		Para la determinación de la viscosidad del fluido de cizallamiento
Barra de agitación magnética	cualquiera		Para crear medios de cizallamiento viscosos DMEM + metilcelulosa
Placa de agitación magnética	cualquiera		Para crear DMEM + metilcelulosa medios de cizallamiento viscosos
Metilcelulosa	cualquiera		Para aumentar la viscosidad de DMEM en medios de flujo Bomba de
jeringa	KD Scientific Geminin 88 plus	788088	Para programar la infusión y extracción de fluidos
Jeringas, tubos y conectores			Para la configuración del aparato de cizallamiento
SOFTWARE
Software ABAQUS	Software de
	LaVision, Alemania	DAVIS 10.1.2
Software de imagen	Leica/cualquier software
MATLAB	MATLAB MATLAB_R2020B

híbrido correlación de imágenes digitales Simulia de microscopio