Medición del consumo de O2 en Drosophila melanogaster mediante microrrespirometría coulométrica

Resumen

La respirometría coulométrica es ideal para medir la tasa metabólica de pequeños organismos. Cuando se adaptó para Drosophila melanogaster en el presente estudio, el consumo de O₂ medido estuvo dentro del rango reportado para D. melanogaster de tipo salvaje en estudios previos. El consumo de_O2 por mosca por parte de los mutantes CASK, que son más pequeños y menos activos, fue significativamente menor que el de los mutantes salvajes .

Resumen

La microrrespirometría coulométrica es un método sencillo y económico para medir el consumo de_O2 de organismos pequeños mientras se mantiene un entorno estable. Un microrrespirómetro culombométrico consiste en una cámara hermética en la que se consume_O2 y el CO₂ producido por el organismo se elimina mediante un medio absorbente. La disminución de presión resultante desencadena la producción electrolítica de_O2 , y la cantidad de_O2 producida se mide registrando la cantidad de carga utilizada para generarla. En el presente estudio, el método se ha adaptado a Drosophila melanogaster probado en pequeños grupos, con la sensibilidad del aparato y las condiciones ambientales optimizadas para una alta estabilidad. La cantidad de_O2 consumida por las moscas silvestres en este aparato es consistente con la medida por estudios previos. El consumo de O₂ específico de masa por parte de los mutantes CAST , que son más pequeños y se sabe que son menos activos, no fue diferente de los controles congénitos. Sin embargo, el pequeño tamaño de los mutantes CASK resultó en una reducción significativa en el consumo de O₂ por mosca. Por lo tanto, el microrrespirómetro es capaz de medir el consumo de_O2 en D. melanogaster, puede distinguir diferencias modestas entre genotipos y agrega una herramienta versátil para medir las tasas metabólicas.

Introducción

La capacidad de medir la tasa metabólica es crucial para una comprensión completa de un organismo en su contexto ambiental. Por ejemplo, es necesario medir la tasa metabólica para comprender su papel en la esperanza de vida¹, el papel de la dieta en el metabolismo² o el umbral de estrés hipóxico³.

Existen dos enfoques generales para medir la tasa metabólica⁴. La calorimetría directa mide directamente el gasto energético midiendo la producción de calor. La calorimetría indirecta mide la producción de energía a través de otros medios, a menudo a tr....

Protocolo

1. Cría y recolección de moscas

1. Mantener las moscas a 25 °C en viales estrechos que contengan alimento estándar para Drosophila .
   NOTA: El tamaño de la muestra para cada genotipo debe comprender al menos nueve réplicas, cada una de las cuales consta de una sola cámara de respirómetro que contiene de 15 a 25 moscas, configurada como se describe a continuación.
2. Transfiere las moscas cada 2-3 días.
3. Anestesiar moscas con CO₂, recolectar grupos de 15 a 25 machos de cada genotipo y colocar cada grupo en viales de alimentos frescos y sin levadura.
   NOTA: Se utilizaron machos para reducir la variabilidad ....

Resultados

Las salidas de presión y corriente del controlador del respirómetro se muestran para una cámara en un experimento en la Figura 3A. El primer pulso de corriente larga presurizó la cámara desde la presión ambiente (aproximadamente 992 hPa) hasta el umbral de apagado preestablecido de 1017 hPa. A medida que las moscas consumían O2 y se absorbía_CO2, la presión disminuía lentamente hasta alcanzar el umbral de ON de 1016 hPa, que activaba la corriente a través del generador de_O2

Discusión

El procedimiento anterior demuestra la medición del consumo de_O2 en D. melanogaster utilizando un microrespirómetro coulométrico electrónico. Los datos resultantes para el consumo de_O2 en D. melanogaster de tipo silvestre estuvieron dentro de los rangos descritos en la mayoría de las publicaciones previas utilizando diversos métodos (Tabla 1), aunque algo más bajos que los reportados por otros ^3,6.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
19/22 Adaptador de Termómetro	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Tapón de sensor
2 ml Tubos de tapón de rosca	Fisher	3464	O2
Conector de 2 pines	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 generador: cortado a 2 pines
Conector hembra de 4 pines	TE Connectivity	215299-4	Enchufe de sensor
5 ml Tubo de polipropileno	Falcon	352063	Corte a 5,5 cm y perforado;
50 ml Tubo Schlenk 19/22 Junta	Laboy		Cámara de HMF050804
Cable de 6 Conductores	Zenith	6 Conductores 26
Cable Conector de mamparo hembra de 6 pines	Switchcraft	17982-6SG-300	Controlador
Conector hembra de 6 pines	Switchcraft	18982-6SG-522	Enchufe de sensor
Conector macho de 6 pines	Switchcraft	16982-6PG-522	Cable
800 ul tubo de centrífuga	Fisher	05-408-120	Cartucho de cal
soda Carcasa de plástico ABS	Industries	PS-11533-G	Controlador
Arduino Nano Todos	Arduino LLC		Controlador
ABX00028 BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	de enchufe de sensor
	Lheng	5 X 7 cm	Controlador
Sulfato de Cobre	BioPharm	BC2045	O2 Ordenador Azulle
		Byte4	Adquisición de Datos
Rollos de Algodón Kajukajudo		#2	Cortado por la mitad para tapar los tubos de mosca Cortado en cuartos para la humedad
Cámara	Ambiental Percival	I30 VLC8	Fly
Care Epoxi	la pegada de plástico	soldadura JB	en el generador O2
Fly Food	Lab Express	Tipo R	Cuidado de moscas
Abrazaderas Keck	uxcell	A20092300UX0418	Asegura la unión de vidrio de la cámara al tapón Enchufe de
sensor	Loctite	E-30CL	epoxi de baja viscosidad
Pantalla OLED Controlador	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3
Alambre de platino 24	ga uGems	14349	Generador O2
Grasa de silicona	Sellos de grasa de alto vacío	Dow-Corning	Conexión de tapón
Soda	Cal Soda Jorvet	JO553	Absorción 2
Interruptor de palanca	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH
Controlador Cable USB	Sabrent	CB-UM63	Controlador
USB Hub	Atolla	Hub 3.0	Conecte los controladores a la computadora
Baño de agua	Amersham	56-1165-33	Tanque
	Jaulas de vidrio	acrílico sin borde de 15 litros	para respirómetros

ga Bud Placa de circuito Electrodos de seguridad de de de de la cámara de baño de agua con control de temperatura Baño