Este estudio muestra un protocolo detallado para realizar microscopía de expansión de ultraestructura en tres etapas del ciclo de vida in vitro de Trypanosoma cruzi, el patógeno responsable de la enfermedad de Chagas. Incluimos la técnica optimizada para las proteínas del citoesqueleto y el marcaje panproteoma.
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Artículo de método
Microscopía de expansión ultraestructural en tres etapas del ciclo de vida in vitro de Trypanosoma cruzi
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En este artículo
Resumen
Resumen
Describimos aquí la aplicación de la microscopía de expansión de ultraestructura (U-ExM) en Trypanosoma cruzi, una técnica que permite aumentar la resolución espacial de una célula o tejido para la obtención de imágenes microscópicas. Esto se realiza expandiendo físicamente una muestra con productos químicos listos para usar y equipos de laboratorio comunes.
La enfermedad de Chagas es un problema de salud pública generalizado y apremiante causado por T. cruzi. La enfermedad es prevalente en América Latina y se ha convertido en un problema importante en regiones no endémicas debido al aumento de la migración. La transmisión de T. cruzi ocurre a través de insectos vectores hematófagos pertenecientes a las familias Reduviidae y Hemiptera. Después de la infección, los amastigotes de T. cruzi se multiplican dentro del huésped mamífero y se diferencian en tripomastigotes, la forma no replicativa del torrente sanguíneo. En el insecto vector, los tripomastigotes se transforman en epimastigotes y proliferan a través de la fisión binaria. La diferenciación entre las etapas del ciclo de vida requiere un reordenamiento extenso del citoesqueleto y se puede recrear completamente en el laboratorio utilizando diferentes técnicas de cultivo celular.
Describimos aquí un protocolo detallado para la aplicación de U-ExM en tres etapas del ciclo de vida in vitro de Trypanosoma cruzi, centrándose en la optimización de la inmunolocalización de las proteínas del citoesqueleto. También optimizamos el uso del éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), una etiqueta panproteoma que nos ha permitido marcar diferentes estructuras de parásitos.
Introducción
La microscopía de expansión (ExM) fue descrita por primera vez en 2015 por Boyden et al.1. Es un protocolo de imagen con el que un microscopio convencional puede alcanzar una resolución espacial por debajo del límite de difracción. Esta mayor resolución se obtiene debido a un aumento físico de la muestra. Para lograr esto, las moléculas marcadas con fluorescencia se entrecruzan con un hidrogel, que posteriormente se expande isotrópicamente con agua. Como resultado de esta expansión, las señales están separadas casi isotrópicamente en las tres dimensiones. Este método emplea productos químicos de bajo costo y pe....
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Protocolo
NOTA: La Figura 1 ilustra el diseño experimental completo.
Figura 1: Flujo de trabajo U-ExM para tres etapas del ciclo de vida in vitro de T. cruzi.
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Resultados
Si el protocolo se ha ejecutado correctamente (Figura 1), las muestras serán visibles como un gel plano y translúcido que puede expandirse hasta un factor de 4-4,5x en agua (Figura 3A). Esta expansión proporcionó una resolución efectiva de unos 70 nm, que puede variar dependiendo del factor de expansión final y del sistema de imagen empleado. Después del segundo proceso de expansión y adquisición de imágenes en un microscopio confocal, pudimos observar factores .......
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Discusión
La microscopía de expansión ultraestructural es una técnica que permite obtener imágenes de alta resolución de muestras biológicas mediante la expansión física de las mismas hasta varias veces su tamaño original. El protocolo U-ExM implica varios pasos críticos que deben ejecutarse cuidadosamente para lograr resultados óptimos4. En primer lugar, la muestra debe fijarse con un agente CP e incrustarse en una matriz de hidrogel hinchable. El formaldehído presente en .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Dolores Campos por ayudar con el cultivo de células Vero y a Romina Manarin por ayudar con el cultivo de T. cruzi . Este trabajo contó con el apoyo de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, el Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva de Argentina (PICT2019-0526), el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (PIBAA 1242) y el Consejo de Investigación del Reino Unido [MR/P027989/1].
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Filtros de jeringa estériles de 0,22 micrómetros PES | Soluciones de membrana | SFPES030022S | |
| vaso de precipitados de 1 L | Schott Duran | 10005227 | |
| 1,5 mL Tubo de microcentrífuga SPINWIN | Tarson | T38-500010 | |
| 10 mL serynge estéril desechable | NP | 66-32 | |
| 10 mL pipeta serológica estéril | Jet Biofil | GSP211010 | |
| Cubreobjetos de 12 mm | Merienfeld GmbH | 01 115 20 | Cubrecubreobjetos redondos |
| Placas de 12 pocillos | Jet Biofil | TCP011012 | |
| cubreobjetos de 22 mm | Corning | 2845-22 | Cubreobjetos cuadrados |
| Placas de 24 pocillos | Jet Biofil | TCP-011-024 | |
| Vaso de precipitados de 250 mL | Schott Duran | C108.1 | |
| 3 mL Pasteur pipeta | Deltalab | 200037 | |
| platos con fondo de vidrio de 35 mm | Matsunami glass ind | D11130H | |
| 4′,6-Diamidine-2′-fenilindol diclorhidrato | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| 5 ml pipeta serológica estéril | Jet Biofil | GSP010005 | |
| placas de 6 pocillos | Sarstedt | 83.3920 | |
| Acrilamida | BioRad | 1610101 | |
| Persulfato de amonio | Sigma Aldrich | A3678-25G | APS |
| ATTO 647 NHS ester | BOC Sciences | F10-0107 | Para el etiquetado panproteoma |
| Biosafty Cabinet | Telstar | Bio II A/P | |
| Albúmina sódica bovina | Sigma Aldrich | A7906 | BSA |
| Incubadora de CO2 | Sanyo | MCO-15A | |
| Microscopio Confocal | Zeiss | LSM 880 | |
| Placa de Petris Desechable | Tarsons | 460095 | 90 mm de diámetro |
| DMEM, Alta Glucosa | Polvo de 12100046 Fisher Cientific | ||
| Calibrador digital electrónico | Radar | RADAR-SLIDE-CALIPER | |
| Etanol Absoluto | Supelco | 1,00,98,31,000 | |
| Suero de pantorrilla fetal | Internegocios SA | FCS FRA 500 | Estéril e inactivado por calor |
| Paquete de procesamiento de imágenes Fiji | ImageJ | doi:10.1038/nmeth.2019 | |
| Formaldehído 37% | Sigma Aldrich | F8775 | FA |
| Vidrio Petridish | Marienfeld Superior | PM-3400300 | 60 mm de diámetro |
| Glucosa D(+) | Cicarelli | ||
| Glutaraldehído 70% | Sigma Aldrich | G7776 | |
| Anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21422 | |
| Anticuerpo secundario IgG anti-conejo de cabra FICT | Jackson Immunoresearch | 115-095-003 | |
| Cilindro graduado | Nalgene | 3663-1000 | |
| Matraz | de vidrio graduadoGlassco | GL-274.202.01 | 100 mL |
| Bloque calefactor | IBR | Hecho en casa | |
| Hemin | Frontier Scientific | H651-9 | |
| Ácido clorhídrico 36.8-38.0% | Ciccarelli | 918110 | |
| Cubitera Corning | 1167U68 | ||
| Incubadora | Tecno Dalvo | TOC130 | |
| Infusión de hígado | Difco | 226920 | |
| Agitador y calentador magnético | Compañero de laboratorio | HP-3000 | |
| Espátula metálica | SALTTECH | 200MM | |
| Pinzas metálicas | Marienfeld Superior | PM-6633002 | |
| Metanol absolut | Cicarelli | 897110 | |
| Tubo de microcentrífuga 1,5 mL | Tarson | 500010-N | |
| Papel de grado microscópico KimWipes | Kimtech Science | B0013HT2QW | |
| Sistema de agua Milli-Q | Merk Millipore | IQ-7003 | |
| clon anti-alfa tubulina de ratón DM1A | Sigma Aldrich | T9026 | |
| anti-PFR de ratón Anticuerpos | Donados por el Dr. Ariel Silber (USP) | ||
| N,N´-metilenabiracrilamida | ICN | 193997 | bis |
| Na2HPO4 | Cicarelli | 834214 | |
| Cámara Neubauer | Boeco | BOE 01 | |
| p1000 pipeta | Gilson | PIPETMAN P1000 | |
| p1000 puntas de pipeta | Tarson | TAR-521020B | |
| pipeta p20 | Gilson | PIPETMAN P20 | |
| p20 puntas de pipeta | Tarson | TAR-527108 | |
| p200 pipeta | Gilson | PIPETMAN P200 | |
| p200 puntas de pipeta | Tarson | TAR-521010Y | |
| Paraformaldehído | Sigma Aldrich | P6148 | PFA |
| pH / ORP / ° Medidor de C | HANNA Instruments | HI 2211 | |
| Poly-D-Lisina 0.1% | Sigma Aldrich | P8920 | |
| Cloruro de potasio | Cicarelli | 867212 | KCl |
| Hoja de afeitar | Printex | BS 2982:1992 | |
| Película de sellado "Parafilm M" | Bemis | PM996 | |
| Acrilato de sodio | Sigma Aldrich | 408220-25G | SA |
| Bicarbonato de sodio | Cicarelli | 929211 | NaHCO3 |
| Cloruro de sodio | Cicarelli | 750214 | NaCl |
| Dodecil sulfato de sodio | BioRad 1610302 | SDS | |
| Hidróxido de sodio | Merk | 1-06498 | NaOH |
| Sorvall ST 16 Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | |
| Matraces T-25 | Corning | 430639 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | |
| Papel tisú | Elite | ||
| Triptosa Merck | 1106760500 | ||
| Tris | BioRad | 1610719 | |
| Tween-20 | Biopack | 2003-07 | Polisorbato 20 |
| Bomba | de vacíoSilfab | N33-A Celdas | |
| Vero | ATCC | CRL-1587 | |
| Vortex MIxer | Dragon Lab | MX-S |
Referencias
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al.
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Reimpresiones y permisos
