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Microscopía de expansión ultraestructural en tres etapas del ciclo de vida in vitro de Trypanosoma cruzi

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DOI:

10.3791/65381

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12 de mayo de 2023

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1Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, 2Area Biología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 3Area Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 4Unidad de Microscopía, Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este estudio muestra un protocolo detallado para realizar microscopía de expansión de ultraestructura en tres etapas del ciclo de vida in vitro de Trypanosoma cruzi, el patógeno responsable de la enfermedad de Chagas. Incluimos la técnica optimizada para las proteínas del citoesqueleto y el marcaje panproteoma.

Resumen

Describimos aquí la aplicación de la microscopía de expansión de ultraestructura (U-ExM) en Trypanosoma cruzi, una técnica que permite aumentar la resolución espacial de una célula o tejido para la obtención de imágenes microscópicas. Esto se realiza expandiendo físicamente una muestra con productos químicos listos para usar y equipos de laboratorio comunes.

La enfermedad de Chagas es un problema de salud pública generalizado y apremiante causado por T. cruzi. La enfermedad es prevalente en América Latina y se ha convertido en un problema importante en regiones no endémicas debido al aumento de la migración. La transmisión de T. cruzi ocurre a través de insectos vectores hematófagos pertenecientes a las familias Reduviidae y Hemiptera. Después de la infección, los amastigotes de T. cruzi se multiplican dentro del huésped mamífero y se diferencian en tripomastigotes, la forma no replicativa del torrente sanguíneo. En el insecto vector, los tripomastigotes se transforman en epimastigotes y proliferan a través de la fisión binaria. La diferenciación entre las etapas del ciclo de vida requiere un reordenamiento extenso del citoesqueleto y se puede recrear completamente en el laboratorio utilizando diferentes técnicas de cultivo celular.

Describimos aquí un protocolo detallado para la aplicación de U-ExM en tres etapas del ciclo de vida in vitro de Trypanosoma cruzi, centrándose en la optimización de la inmunolocalización de las proteínas del citoesqueleto. También optimizamos el uso del éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), una etiqueta panproteoma que nos ha permitido marcar diferentes estructuras de parásitos.

Introducción

La microscopía de expansión (ExM) fue descrita por primera vez en 2015 por Boyden et al.1. Es un protocolo de imagen con el que un microscopio convencional puede alcanzar una resolución espacial por debajo del límite de difracción. Esta mayor resolución se obtiene debido a un aumento físico de la muestra. Para lograr esto, las moléculas marcadas con fluorescencia se entrecruzan con un hidrogel, que posteriormente se expande isotrópicamente con agua. Como resultado de esta expansión, las señales están separadas casi isotrópicamente en las tres dimensiones. Este método emplea productos químicos de bajo costo y permite una resolución espacial de aproximadamente 65 nm utilizando microscopios convencionales (confocales), que es aproximadamente cuatro veces mejor que la resolución estándar de un microscopio confocal (aproximadamente 250 nm)1.

El siguiente hito, que ha permitido el uso de la microscopía de expansión en muchos campos biológicos, fue la adaptación del marcaje de inmunofluorescencia con anticuerpos convencionales2. Otra adaptación del protocolo ExM publicado inicialmente es el análisis ampliado del proteoma (MAP)3. Este método introdujo el uso de altas concentraciones de acrilamida y paraformaldehído antes de la inmersión en hidrogel de la muestra para evitar la reticulación intra e interproteica, lo que condujo a una mejor preservación del contenido de proteínas y la arquitectura subcelular de las muestras. Este protocolo alternativo se optimizó para obtener una mejor conservación de la ultraestructura general de los orgánulos aislados mediante la utilización de concentraciones más bajas de los agentes fijadores (formaldehído/paraformaldehído y acrilamida); este enfoque se denominó microscopía de expansión de ultraestructura (U-ExM)4.

Para obtener aún más resolución, también se ha informado de la combinación de ExM con técnicas de microscopía de superresolución, incluida la microscopía de agotamiento de emisiones estimulada o la microscopía de localización de una sola molécula, con el fin de alcanzar resoluciones inferiores a 20 nm5.

El uso de ExM ha sido ampliamente reportado en los campos de la neurociencia y la investigación del citoesqueleto6, pero solo se han realizado unos pocos estudios sobre protistas parásitos. Nuestro laboratorio fue el primero en reportar la aplicación de U-ExM en T. cruzi7. El protocolo de fundación se basa principalmente en los reportes previos de U-ExM en Toxoplasma gondii, Plasmodium ssp. y Trypanosoma brucei 8,9,10,11.

Una de las mayores ventajas de ExM es su naturaleza modular, que permite una gran flexibilidad para adaptarse a diferentes muestras biológicas. El protocolo se puede dividir en pasos (como la fijación, la prevención de la reticulación o la gelificación) que el usuario puede ajustar fácilmente para cumplir con sus requisitos experimentales. Además, esta tubería puede modificarse para mejorar la compatibilidad con el organismo modelo o para lograr una resolución específica. Como resultado, ExM ofrece un enorme potencial para sistemas ópticos avanzados y no avanzados, lo que garantiza aplicaciones más amplias en el futuro.

La enfermedad de Chagas, también llamada tripanosomiasis americana, es una enfermedad endémica en América Latina causada por Trypanosoma cruzi, un parásito protozoario. El ciclo de vida del parásito es complejo e involucra dos etapas de desarrollo en los mamíferos y dos en el insecto huésped (miembros de la familia Triatominidae), que es el vector biológico de esta enfermedad. La enfermedad de Chagas pertenece al grupo de enfermedades tropicales desatendidas listadas por la Organización Mundial de la Salud y representa un importante problema económico y social en América Latina. Los estudios epidemiológicos estiman que 8 millones de personas en todo el mundo viven con la enfermedad de Chagas y más de 10.000 muertes al año. Estas cifras ejemplifican la importancia de la enfermedad de Chagas como problema de salud pública en todo el mundo. La distribución geográfica de la enfermedad de Chagas ha cambiado en las últimas décadas, y muchos individuos infectados ahora residen en grandes áreas urbanas a nivel mundial debido al aumento de las migraciones, a diferencia de las áreas principalmente rurales de América Latina donde se encontró originalmente12.

Las etapas de desarrollo de T. cruzi difieren a lo largo de su ciclo de vida, que puede replicarse completamente in vitro. Los epimastigotes son formas replicativas en el insecto vector, y tienen un núcleo esférico en la región central del cuerpo celular y un cinetoplasto en forma de barra (una estructura mitocondrial que contiene ADN exclusiva de los cinetoplástidos) en la región anterior en relación con el núcleo, con un flagelo libre. Los tripomastigotes son la forma infecciosa, no replicativa, y tienen un núcleo alargado, un cinetoplasto posterior redondeado y un flagelo unido a la membrana plasmática a lo largo de toda la longitud del parásito. Los amastigotes son la forma replicativa intracelular; Tienen un núcleo en la región central, un cinetoplasto en forma de bastoncillo en la parte anterior del cuerpo celular y un flagelo reducido. La adaptabilidad del parásito a diferentes ambientes es un reflejo de estas variaciones morfológicas. También vale la pena mencionar que este ciclo de vida involucra una división simétrica y diferentes etapas de desarrollo transicionales13. Durante la diferenciación, el citoesqueleto de los tripanosomátidos desempeña un papel fundamental. Esta estructura está formada por un corsé de microtúbulos subpeliculares dispuestos en una matriz ordenada de microtúbulos estables por debajo de la membrana plasmática. Además, en estos organismos está presente un bastón paraflagelar, que es una estructura en forma de red que corre paralela y está unida al axonema flagelar14. La organización precisa del citoesqueleto y los cambios estructurales nucleares a lo largo de las etapas del ciclo celular involucran mecanismos de regulación génica únicos específicos de los tripanosomátidos, lo que los convierte en modelos interesantes para los estudios de biología celular.

Dado el pequeño tamaño de T. cruzi y otros parásitos protozoarios, U-ExM presenta una excelente herramienta para analizar las características estructurales de estos importantes patógenos. Como se mencionó anteriormente, la aplicabilidad de esta técnica en T. cruzi fue validada por primera vez por el Dr. Alonso7. Este informe detalla un protocolo U-ExM completo, con énfasis en la inmunolocalización de las proteínas del citoesqueleto durante las diferentes etapas del ciclo de vida de T. cruzi. Además, hemos optimizado el uso del éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), una etiqueta panproteoma que nos permite marcar varias estructuras de parásitos. Además, se describe una metodología in vitro para obtener las tres etapas del parásito.

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Protocolo

NOTA: La Figura 1 ilustra el diseño experimental completo.

Diagrama del ciclo de vida de la tripanosomiasis; preparación de microscopios; microscopía de expansión; inmunofluorescencia.
Figura 1: Flujo de trabajo U-ExM para tres etapas del ciclo de vida in vitro de T. cruzi. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Preparación de los cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina

  1. Coloque un cuadrado de 10 cm x 10 cm de película de sellado en una placa de Petri. Lave los cubreobjetos bañándolos en etanol absoluto en una placa de Petri de vidrio de 35 mm.
  2. Retire los cubreobjetos con pinzas del baño de etanol y escurra el exceso de líquido con papel de seda. Coloque los cubreobjetos sobre la película de sellado.
  3. Absorba el resto del etanol con papel apto para microscopía. Agregue una solución v/v al 0,1% de poli-D-lisina en el centro del cubreobjetos y extiéndala con la punta para cubrir aproximadamente el 80% de su superficie. Cerrar la placa de Petri e incubar durante 1 h a 37 °C.
    NOTA: Para cubreobjetos de22 mm 2 , use 200 μL de solución de poli-D-lisina; para cubreobjetos redondos de 12 mm, utilice 100 μL de solución de poli-D-lisina.
  4. Lave los cubreobjetos con agua ultrapura tres veces. Use la aspiración con una aspiradora para eliminar el agua entre cada lavado. Mantener a 4 °C hasta por 1 semana.

2. Preparación de la solución

  1. Prepare soluciones madre de acrilato de sodio (SA) al 38% (p/p).
    1. Agregue lentamente 19 g de SA a 31 mL de agua sin nucleasas mientras revuelve.
      NOTA: Esta solución es muy viscosa; Preste atención al pipetear.
    2. Una vez que el SA se haya disuelto por completo, guárdelo en un recipiente estéril. Manténgalo a 4 °C y cámbielo cada 6 meses.
      NOTA: SA a veces muestra signos de contaminación con poliacrilato de sodio dependiendo de la marca, lo que se nota al preparar la solución madre ya que se vuelve amarillenta y turbia. Úselo con precaución si este es el caso.
  2. Prepare una solución madre de acrilamida (AA) al 40% (p/v) y una solución madre de N, N'-metileno biacrilamida (BIS) al 2% (p/v). Disuelva cada compuesto en agua ultrapura y filtre con un filtro de jeringa estéril de 0,22 μm. Conservar en un recipiente estéril a 4 °C.
    PRECAUCIÓN: AA y BIS son sustancias altamente tóxicas. Trabaje bajo una campana extractora y use elementos de protección adecuados (guantes, ropa protectora, mascarilla y gafas de seguridad).
  3. Prepare la solución de prevención de reticulación de proteínas (CP) mezclando 38 μL de una solución de formaldehído (FA) al 37% con 50 μL de la solución madre de acrilamida al 40% (paso 2.2) en 912 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS; Tabla 1) para obtener una concentración final de 1,4% de formaldehído y 2% de acrilamida.
    NOTA: Prepare siempre la solución CP fresca y sea extremadamente preciso al pipetear. Por ejemplo, utilice una pipeta P1000 para tomar 900 μL de PBS y una pipeta P20 para tomar los 12 μL restantes de PBS.
  4. Preparar la solución monomérica
    NOTA: No use la solución inmediatamente después de estar preparada; almacenar a -20 °C al menos 24 h antes de su uso.
    1. Mezcle 500 μL de la solución de SA al 38% (paso 2.1), 250 μL de la solución de AA al 40% y 50 μL de la solución BIS (paso 2.2), así como 100 μL de PBS 10x (Tabla 1).
    2. Alícuota este volumen final de 900 μL en 10 tubos de microcentrífuga de 1,5 mL con 90 μL de solución monomérica cada uno. Almacenar a -20 °C durante un máximo de 2 semanas.
      NOTA: La solución SA puede permanecer en la punta durante el pipeteo porque es muy viscosa; Ten cuidado y dispensa todo.
  5. Preparar la solución desnaturalizante
    1. Mezclar 114,3 mL de una solución de dodecil sulfato de sodio (SDS) de 350 mM preparada en agua ultrapura con 10 mL de una solución de cloruro de sodio de 4 M preparada en agua ultrapura. Añade 12 g de Tris mientras remueves en un vaso de precipitados de 250 ml.
      PRECAUCIÓN: El SDS es altamente tóxico; Úselo debajo de una campana extractora con guantes, ropa protectora, una mascarilla y gafas de seguridad.
    2. Ajuste el pH a 9 con una solución concentrada de ácido clorhídrico. Enrasar hasta 200 ml con agua ultrapura y almacenar en un matraz estéril a 4 °C.
  6. Prepare una solución de persulfato de amonio (APS) al 10% y una solución TEMED al 10%.
    1. Disolver 0,1 g de APS en 1 mL de agua ultrapura.
    2. Prepare 1 mL de una solución TEMED al 10% en agua ultrapura.
    3. Prepare 100 μL de alícuotas de ambas soluciones en tubos estériles de microcentrífuga de 1,5 mL y guárdelos a -20 °C durante un máximo de 1 mes.
  7. Prepara la solución de paraformaldehído.
    1. Disolver 2 g de paraformaldehído en 40 mL de PBS agitando a 60 °C. Agregue 1 M de NaOH gota a gota hasta que la solución cambie de blanco a incoloro.
      PRECAUCIÓN: El formaldehído es altamente tóxico; Úselo debajo de una campana extractora con guantes, ropa protectora, una mascarilla y gafas de seguridad.
    2. Enfríe la solución a temperatura ambiente y ajuste el pH con NaOH a 7,2 en un volumen final de 50 mL. Filtre con un filtro de jeringa estéril de 0,22 μm y guárdelo en un recipiente estéril.
    3. Preparar alícuotas de 1 mL en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mL y almacenar a -20 °C.
  8. Prepare la solución de paraformaldehído/glutaraldehído.
    1. Añadir 0,2 g de paraformaldehído en 3,5 mL de agua ultrapura y 50 μL de solución de NaOH 16 M. Calentar la solución a 60 °C para disolver el paraformaldehído.
    2. Enfriar y añadir 300 μL de glutaraldehído al 70%. Aumente el volumen a 5 mL con agua ultrapura y finalmente a 10 mL con PBS.
      PRECAUCIÓN: El paraformaldehído y el glutaraldehído son altamente tóxicos; Úselos debajo de una campana extractora con guantes, ropa protectora, una mascarilla y gafas de seguridad.
    3. Preparar alícuotas de 1 mL en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mL y almacenar a -20 °C.

3. Preparación de los cultivos de parásitos

  1. Cultivo de epimastigotes de T. cruzi .
    1. Utilizar un cultivo axénico en un matraz T-25 (25cm2 de área de crecimiento) y mantener los cultivos en la fase logarítmica mediante subcultivo cada 48-72 h en medio de infusión hepática de triptosa (LIT) con suero fetal de ternero (FCS) al 10%; Tabla 1).
    2. Asegúrese de que la tapa esté bien cerrada y mantenga el matraz de cultivo verticalmente a 28 °C para la incubación. Monitoree el crecimiento del parásito mediante el recuento de células en una cámara de Neubauer durante cada subcultivo.
      NOTA: Para la cepa Dm28c utilizada en este estudio, la concentración de epimastigotes en cultivos en fase logarítmica está entre 1-5 x 107 parásitos/mL.
    3. Preparar una suspensión de 2 x 106 epimastigotes/mL a partir de un cultivo en fase logarítmica en medio LIT suplementado con FCS al 10%. Centrifugar la suspensión a 5.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT). Lavar con PBS una o dos veces y volver a suspender en 200 μL de PBS.
    4. Se adhiere al cubreobjetos redondo de 12 mm previamente recubierto con poli-D-lisina (sección 1). Incubar en RT durante 15-20 min. Continúe con el paso de prevención de reticulación (sección 4).
      NOTA: Alternativamente, fije los epimastigotes con metanol frío durante 7 min o solución de paraformaldehído/glutaraldehído (paso 2.8) durante 10 min a RT antes de la adherencia de los parásitos al cubreobjetos. Es posible almacenar los parásitos fijados a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
  2. Obtén los amastigotes de células Vero infectadas.
    1. Coloque un cubreobjetos redondo estéril de 12 mm en la parte inferior de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Prepare una suspensión de 2 x 105 células Vero/mL en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con un 2% de suero fetal de ternero (FCS). Siembra 500 μL de la suspensión por pocillo.
      NOTA: Este estudio utiliza DMEM con 2% de FCS para permitir que las células crezcan más lentamente.
    2. Incubar durante la noche (ON; 12-16 h) a 37 °C y 5% de CO2 para asegurar la adhesión de la célula.
    3. Después de la incubación, lavar las células dos veces con 500 μL de PBS estéril. Agregue tripomastigotes de T. cruzi en las células a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 en 100 μL de DMEM con 2% de FCS por pocillo, lo que corresponde a un millón de tripomastigotes por pocillo. Incubar a 37 °C y 5% de CO2 durante 6 h.
    4. Después de la incubación, enjuague las placas dos veces con PBS. Añadir 500 μL de DMEM suplementado con FCS al 2%. En este punto, continúe con el paso de prevención de reticulación (sección 4).
      NOTA: Los amastigotes intracitoplasmáticos serán visibles a través de un microscopio óptico invertido 2 días después de la infección (Figura suplementaria 1). Alternativamente, fije los tripomastigotes con metanol frío durante 7 min a -20 °C, o paraformaldehído/glutaraldehído durante 10 min a RT, antes de la adherencia de los parásitos al cubreobjetos.
  3. Obtener tripomastigotes de células Vero infectadas.
    1. Recoja el sobrenadante de una monocapa de células Vero (30%-40% de confluencia) infectada con tripomastigotes (MOI 1:10; ON incubación) 4 días después de la infección.
      NOTA: Para un matraz T-25, la concentración inicial de células Vero utilizadas es de 800.000 células, y para un matraz T-75 es de dos millones de células.
    2. Determine la concentración de tripomastigote utilizando una cámara de Neubauer para el recuento de células. Centrifugar 4 x 106 tripomastigotes a 7.000 x g a RT durante 10 min.
    3. Enjuague con PBS dos veces y vuelva a suspender en 200 μL de PBS. Aplicar sobre un cubreobjetos redondo de 12 mm recubierto de poli-D-lisina (sección 1). Incubar durante 10-15 min en RT. Proceda con el paso de prevención de reticulación (sección 4).
      NOTA: Alternativamente, fije los tripomastigotes con metanol frío durante 7 min a -20 °C o paraformaldehído/glutaraldehído durante 10 min a RT antes de la adherencia de los parásitos al cubreobjetos.

4. Realización de la prevención de reticulación (DÍA 1)

  1. Sumerja el cubreobjetos de 12 mm con los parásitos adheridos o las células infectadas (mirando hacia arriba) en una placa de 24 pocillos con 0,5 mL de solución de CP (paso 2.3) en cada pocillo.
  2. Llene los pozos vacíos con agua para reducir la evaporación. Selle la placa con una película de sellado. Incubar durante 5 h a 37 °C. Este paso puede extenderse hasta una incubación ON a 4 °C.
    NOTA: Sumerja siempre el cubreobjetos en la solución; No pipetee la solución fijadora sobre los cubreobjetos.

5. Realización de la gelificación de la muestra

  1. Ensamble una cámara húmeda en una placa de Petri con una película de sellado sobre papel de seda (Figura 2A). Agregue agua al papel de seda e incube a -20 °C durante 20 minutos para que se enfríe. Descongele una alícuota TEMED y una alícuota APS en hielo durante 20 minutos (paso 2.6).
    NOTA: No congele ni descongele el APS más de tres veces.
  2. Coloque la cámara fría y húmeda sobre hielo (Figura 2A). Saque de la incubadora la placa de 24 pocillos preparada en la sección 4. Aspire la solución CP con una pipeta Pasteur de 3 mL, dejando un poco de solución, de lo contrario, los cubreobjetos serán difíciles de eliminar.
  3. Retire los cubreobjetos de 12 mm de la solución fijadora con pinzas y colóquelos sobre papel de seda con los parásitos hacia arriba.
    NOTA: Es útil usar una aguja estéril para levantar el cubreobjetos y luego sujetarlo con las pinzas.
  4. A una alícuota de 90 μL de solución monomérica (paso 2.4), añadir 5 μL de TEMED y 5 μL de APS previamente descongelados. Mezcle con un mezclador de vórtice durante no más de 2-3 s; No es necesario cerrar el tubo con la tapa.
    NOTA: Siempre agregue TEMED primero y APS al final. La adición de APS primero y TEMED al final a la solución monomérica hace que el proceso de gelificación sea más rápido, sin dar tiempo para manipularlo.
  5. Coloque rápidamente una gota de 35 μL sobre la película de sellado de la cámara húmeda para cada cubreobjetos. Levante inmediatamente el cubreobjetos con pinzas y colóquelo sobre la gota (Figura 2B) con los parásitos hacia abajo.
    NOTA: Haga un máximo de dos cubreobjetos a la vez; Es crucial no retrasar este paso porque la solución polimeriza muy rápidamente.
  6. Incubar la cámara húmeda durante 5 min en hielo y luego durante 1 h a 37 °C. Encienda un bloque calefactor a 95 °C para garantizar la temperatura correcta para el siguiente paso.

Encapsulación celular en gel; A-B: placa de Petri sobre hielo; C: diagrama de celdas bajo gel, configuración de cubreobjetos.
Figura 2: Detalles de la etapa de gelificación. (A) Montaje de la cámara húmeda. (B) Dejar caer los cubreobjetos sobre la solución de monómero con TEMED y APS para la gelificación. (C) Representación esquemática del gel ensamblado para la obtención de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Desnaturalización de las muestras gelificadas y realización de la expansión isotrópica

  1. Retirar la solución de desnaturalización (paso 2.5) a 4 °C. Si se precipita, póngalo en un baño de agua caliente hasta que se disuelva por completo.
  2. Agregue 2 mL de la solución desnaturalizante a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Transfiera los cubreobjetos del paso 5.3 a la placa con la solución de desnaturalización. Incubar durante 15 min a RT agitando suavemente para que el gel se desprenda del cubreobjetos.
  3. Transfiera con cuidado el gel (retirándolo del cubreobjetos de 12 mm) con una espátula metálica a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml con 1 ml de solución desnaturalizante. Use cerraduras de tapa para asegurar los tubos. Incubar durante 1 h y 30 min a 95 °C en un bloque calefactor.
    NOTA: Los geles comienzan a expandirse durante este paso; tenga cuidado al transferir el gel al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    PRECAUCIÓN: Después de la incubación, el tubo que contiene el gel está a 95 °C, lo que puede ser peligroso. Use guantes protectores y deje que los tubos se enfríen antes de manipularlos para evitar quemaduras y proyecciones.
  4. Realizar la primera ronda de expansión
    1. Aspire la solución desnaturalizante del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con el gel con una pipeta P1000. Transfiera el gel del tubo de microcentrífuga de 1,5 mL a una placa de Petri con 10 mL de agua ultrapura durante 30 min con una espátula pequeña.
    2. Cambie el agua ultrapura con una pipeta Pasteur desechable de 3 mL. Incubar ON en RT.
      NOTA: Sea cuidadoso con los geles porque, después de los primeros 30 minutos de incubación, se volvieron frágiles.
    3. Cambie el agua ultrapura con una pipeta Pasteur desechable de 3 ml una vez más.
      NOTA: Tres incubaciones de agua de 30 min cada una son suficientes, pero por practicidad, es mejor dejar la segunda incubación encendida.

7. Realización del marcaje de fluorescencia de las proteínas diana (DÍA 2)

  1. Retire el agua de la placa de Petri con el gel con una pipeta Pasteur desechable de 3 mL. Mida el diámetro del gel con un calibrador para calcular la expansión (entre cuatro y cinco veces).
  2. Lavar dos veces con 10 mL de PBS durante 15 min. Corta el gel con una cuchilla de afeitar en cuadrados de aproximadamente 10 mm x 10 mm en el centro del gel circular. Utilice un cuadrado por cada condición que se va a probar.
    NOTA: El gel se encoge después de las incubaciones de PBS. Los geles se pueden almacenar en PBS a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
  3. Transfiera cada cuadrado a una placa de 12 pocillos e incube con 500 μL de anticuerpo primario diluido en PBS-albúmina sérica bovina (BSA) al 2% durante 2 h y 30 min a 37 °C con agitación.
    NOTA: La incubación alternativa de anticuerpos se puede realizar ON a 4 °C. El volumen mínimo de anticuerpos que se puede utilizar es de 300 μL en una placa de 24 pocillos. Como regla general, utilice el doble de la concentración de anticuerpos utilizada para el inmunomarcaje convencional.
  4. Lavar tres veces con 2 mL de PBS con polisorbato 20 al 0,1% durante 10 min mientras se agita en una placa de 6 pocillos.
  5. Transfiera el gel a una placa de 12 pocillos e incube con 500 μL de anticuerpo secundario en PBS con DAPI y 10 μg/mL de éster NHS conjugado con el fluoróforo deseado durante 2 h y 30 min a 37 °C con una suave agitación.
    NOTA: Como regla general, utilice el doble de la concentración de anticuerpos utilizada para el inmunomarcaje convencional. Alternativamente, esta incubación se puede realizar en ON a 4 °C.
  6. Lavar tres veces con 2 mL de PBS con polisorbato 20 al 0,1% durante 10 min mientras se agita en una placa de 6 pocillos.
  7. Transfiera el gel a una placa de Petri con agua ultrapura. Incubar durante 30 min. Cambie el agua dos veces con una pipeta Pasteur desechable de 3 ml, como se hace en el paso 6.4.

8. Imagen y procesamiento de imágenes (DÍA 3)

  1. Retire el agua de las placas de Petri con una pipeta Pasteur desechable de 3 mL y mida el diámetro del gel con un calibrador para calcular el factor de expansión.
  2. Corta un trozo pequeño de ~10 mm x 10 mm con una cuchilla de afeitar y colócalo en un plato con fondo de cristal de 35 mm.
    NOTA: Como alternativa, coloque el gel entre un portaobjetos y un cubreobjetos (sin poli-D-lisina). El portaobjetos debe tener dos piezas más pequeñas cortadas con un cuchillo de diamante unido a los lados para formar una cámara del grosor del gel.
  3. Compruebe la orientación con un aumento de 10x o 20x. Para enfocar correctamente, asegúrese de que los parásitos estén frente al cubreobjetos; de lo contrario, hay que darle la vuelta al gel y volver a comprobarlo (Figura 2C).
  4. Una vez que se encuentre la orientación adecuada, seque el gel restante con papel de microscopía. Cubra el gel con un cubreobjetos recubierto de poli-D-lisina.
  5. Añade una pequeña gota de agua ultrapura al gel para visualizar con un microscopio confocal.
    NOTA: Para garantizar una imagen adecuada, es crucial mantener la orientación del gel durante todo el proceso, de modo que el lado del gel que contiene células cerca de su superficie quede orientado hacia el plato con fondo de vidrio en el extremo. Cuando se utilizan platos de 35 mm, la adición de poli-D-lisina al cubreobjetos colocado en la parte inferior reduce el desplazamiento del gel durante la adquisición de la imagen.
  6. Parámetros de adquisición de imágenes
    1. Obtenga imágenes de las muestras en un microscopio confocal (Tabla de materiales) utilizando un objetivo de apertura numérica (NA) de 1,4 grados de inmersión en aceite de 63x.
    2. Adquiera pilas Z, el ancho de cada paso z y un tiempo de exposición por píxel, que se determinará empíricamente en función de la muestra, la intensidad de la señal y la optimización de los tiempos de adquisición. Utilice el zoom de escaneo para obtener una ampliación efectiva si lo desea.
    3. Abra la pila Z utilizando un software de procesamiento de imágenes (Tabla de materiales). Para cada canal, agrupe las imágenes apiladas mediante la opción Agrupar proyecto Z . Seleccione la proyección de intensidad máxima.
    4. Para fusionar imágenes, utilice la herramienta Fusionar canales y seleccione el color de cada canal. Agregue una barra de escala con la herramienta Barra de escala en el software de procesamiento.
      NOTA: Alternativamente, se puede colorear cada canal como se desee (ver ejemplos en los resultados representativos).

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Resultados

Si el protocolo se ha ejecutado correctamente (Figura 1), las muestras serán visibles como un gel plano y translúcido que puede expandirse hasta un factor de 4-4,5x en agua (Figura 3A). Esta expansión proporcionó una resolución efectiva de unos 70 nm, que puede variar dependiendo del factor de expansión final y del sistema de imagen empleado. Después del segundo proceso de expansión y adquisición de imágenes en un microscopio confocal, pudimos observar factores ...

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Discusión

La microscopía de expansión ultraestructural es una técnica que permite obtener imágenes de alta resolución de muestras biológicas mediante la expansión física de las mismas hasta varias veces su tamaño original. El protocolo U-ExM implica varios pasos críticos que deben ejecutarse cuidadosamente para lograr resultados óptimos4. En primer lugar, la muestra debe fijarse con un agente CP e incrustarse en una matriz de hidrogel hinchable. El formaldehído presente en ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Dolores Campos por ayudar con el cultivo de células Vero y a Romina Manarin por ayudar con el cultivo de T. cruzi . Este trabajo contó con el apoyo de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, el Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva de Argentina (PICT2019-0526), el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (PIBAA 1242) y el Consejo de Investigación del Reino Unido [MR/P027989/1].

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Filtros de jeringa estériles de 0,22 micrómetros PESSoluciones de membranaSFPES030022S
vaso de precipitados de 1 LSchott Duran10005227
1,5 mL Tubo de microcentrífuga SPINWINTarsonT38-500010
10 mL serynge estéril desechableNP66-32
10 mL pipeta serológica estérilJet BiofilGSP211010
Cubreobjetos de 12 mmMerienfeld GmbH01 115 20Cubrecubreobjetos redondos
Placas de 12 pocillosJet BiofilTCP011012
cubreobjetos de 22 mmCorning2845-22Cubreobjetos cuadrados
Placas de 24 pocillosJet BiofilTCP-011-024
Vaso de precipitados de 250 mLSchott DuranC108.1
3 mL Pasteur pipetaDeltalab200037
platos con fondo de vidrio de 35 mmMatsunami glass indD11130H
4′,6-Diamidine-2′-fenilindol diclorhidratoSigma AldrichD9542DAPI
5 ml pipeta serológica estérilJet BiofilGSP010005
placas de 6 pocillosSarstedt83.3920
AcrilamidaBioRad1610101
Persulfato de amonioSigma AldrichA3678-25GAPS
ATTO 647 NHS esterBOC SciencesF10-0107Para el etiquetado panproteoma
Biosafty CabinetTelstarBio II A/P
Albúmina sódica bovinaSigma AldrichA7906BSA
Incubadora de CO2SanyoMCO-15A
Microscopio ConfocalZeissLSM 880
Placa de Petris DesechableTarsons46009590 mm de diámetro
DMEM, Alta GlucosaPolvo de 12100046 Fisher Cientific
Calibrador digital electrónicoRadarRADAR-SLIDE-CALIPER
Etanol AbsolutoSupelco1,00,98,31,000
Suero de pantorrilla fetalInternegocios SAFCS FRA 500Estéril e inactivado por calor
Paquete de procesamiento de imágenes FijiImageJdoi:10.1038/nmeth.2019
Formaldehído 37%Sigma AldrichF8775FA
Vidrio PetridishMarienfeld SuperiorPM-340030060 mm de diámetro
Glucosa D(+)Cicarelli
Glutaraldehído 70%Sigma AldrichG7776
Anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra Alexa Fluor 555InvitrogenA-21422
Anticuerpo secundario IgG anti-conejo de cabra FICTJackson Immunoresearch115-095-003
Cilindro graduadoNalgene3663-1000
Matrazde vidrio graduadoGlasscoGL-274.202.01100 mL
Bloque calefactorIBRHecho en casa
HeminFrontier ScientificH651-9
Ácido clorhídrico 36.8-38.0%Ciccarelli918110
Cubitera Corning1167U68
IncubadoraTecno DalvoTOC130
Infusión de hígadoDifco226920
Agitador y calentador magnéticoCompañero de laboratorioHP-3000
Espátula metálicaSALTTECH200MM
Pinzas metálicasMarienfeld SuperiorPM-6633002
Metanol absolutCicarelli897110
Tubo de microcentrífuga 1,5 mLTarson500010-N
Papel de grado microscópico KimWipesKimtech ScienceB0013HT2QW
Sistema de agua Milli-QMerk MilliporeIQ-7003
clon anti-alfa tubulina de ratón DM1ASigma AldrichT9026
anti-PFR de ratón AnticuerposDonados por el Dr. Ariel Silber (USP)
N,N´-metilenabiracrilamidaICN193997bis
Na2HPO4Cicarelli834214
Cámara NeubauerBoecoBOE 01
p1000 pipetaGilsonPIPETMAN P1000
p1000 puntas de pipetaTarsonTAR-521020B
pipeta p20GilsonPIPETMAN P20
p20 puntas de pipetaTarsonTAR-527108
p200 pipetaGilsonPIPETMAN P200
p200 puntas de pipetaTarsonTAR-521010Y
ParaformaldehídoSigma AldrichP6148PFA
pH / ORP / ° Medidor de CHANNA InstrumentsHI 2211
Poly-D-Lisina 0.1%Sigma AldrichP8920
Cloruro de potasioCicarelli867212KCl
Hoja de afeitarPrintexBS 2982:1992
Película de sellado "Parafilm M"BemisPM996
Acrilato de sodioSigma Aldrich408220-25GSA
Bicarbonato de sodioCicarelli929211NaHCO3
Cloruro de sodioCicarelli750214NaCl
Dodecil sulfato de sodioBioRad 1610302SDS
Hidróxido de sodioMerk1-06498NaOH
Sorvall ST 16 CentrífugaThermo Fisher Scientific75004380
Matraces T-25Corning430639
TEMEDInvitrogen15524-010
Papel tisúElite
Triptosa Merck1106760500
TrisBioRad1610719
Tween-20Biopack2003-07Polisorbato 20
Bombade vacíoSilfabN33-A Celdas
VeroATCCCRL-1587
Vortex MIxerDragon LabMX-S
716214 purificados

Referencias

  1. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  2. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  3. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  4. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2018).
  5. Tillberg, P. W., Chen, F. Expansion microscopy: Scalable and convenient super-resolution microscopy. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 35, 683-701 (2019).
  6. Jurriens, D., van Batenburg, V., Katrukha, E. A., Kapitein, L. C. Mapping the neuronal cytoskeleton using expansion microscopy. Methods in Cell Biology. 161, 105-124 (2021).
  7. Alonso, V. L. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM) in Trypanosoma cruzi: localization of tubulin isoforms and isotypes. Parasitology Research. 121 (10), 3019-3024 (2022).
  8. Kalichava, A., Ochsenreiter, T. Ultrastructure expansion microscopy in Trypanosoma brucei. Open Biology. 11 (10), 210132(2021).
  9. Amodeo, S., et al. Characterization of the novel mitochondrial genome segregation factor TAP110 in Trypanosoma brucei. Journal of Cell Science. 134 (5), (2021).
  10. Liffner, B., Absalon, S. Expansion microscopy reveals plasmodium falciparum blood-stage parasites undergo anaphase with a chromatin bridge in the absence of mini-chromosome maintenance complex binding protein. Microorganisms. 9 (11), 2306(2021).
  11. Dos Santos Pacheco, N., Soldati-Favre, D. Coupling auxin-inducible degron system with ultrastructure expansion microscopy to accelerate the discovery of gene function in Toxoplasma gondii. Methods in Molecular Biology. 2369, 121-137 (2021).
  12. Lidani, K. C. F., et al. Chagas disease: From discovery to a worldwide health problem. Frontiers in Public Health. 7, 166(2019).
  13. Carrea, A., Diambra, L. Systems biology approach to model the life cycle of Trypanosoma cruzi. PloS One. 11 (1), e0146947(2016).
  14. Vidal, J. C., De Souza, W. Morphological and Functional Aspects of Cytoskeleton of Trypanosomatids. Cytoskeleton - Structure, Dynamics, Function and Disease. , InTech. (2017).
  15. Kunz, T. C., Götz, R., Gao, S., Sauer, M., Kozjak-Pavlovic, V. Using expansion microscopy to visualize and characterize the morphology of mitochondrial cristae. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 617(2020).
  16. Laporte, M. H., Klena, N., Hamel, V., Guichard, P. Visualizing the native cellular organization by coupling cryofixation with expansion microscopy (Cryo-ExM). Nature Methods. 19 (2), 216-222 (2022).
  17. Sahabandu, N., et al. Expansion microscopy for the analysis of centrioles and cilia. Journal of Microscopy. 276 (3), 145-159 (2019).
  18. Wen, G., Leen, V., Rohand, T., Sauer, M., Hofkens, J. Current progress in expansion microscopy: chemical strategies and applications. Chemical Reviews. 123 (6), 3299-3323 (2023).
  19. Trinks, N., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging of immunological synapse formation between NK cells and A. fumigatus by expansion microscopy. Communications Biology. 4 (1), 1151(2021).
  20. White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
  21. Steib, E., et al. TissUExM enables quantitative ultrastructural analysis in whole vertebrate embryos by expansion microscopy. Cell Reports Methods. 2 (10), 100311(2022).
  22. Shaib, A. H., et al. Visualizing proteins by expansion microscopy. bioRxiv. , (2023).
  23. M'Saad, O., et al. All-optical visualization of specific molecules in the ultrastructural context of brain tissue. bioRxiv. , (2022).

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