La preparación ex vivo del corte de la médula espinal para el registro de patch-clamp de células enteras en neuronas motoras durante la estimulación de la médula espinal

Resumen

Este protocolo describe un método que utiliza una pinza de parche para estudiar las respuestas eléctricas de las neuronas motoras a la estimulación de la médula espinal (SCS) con alta resolución espacio-temporal, lo que puede ayudar a los investigadores a mejorar sus habilidades para separar la médula espinal y mantener la viabilidad celular simultáneamente.

Resumen

La estimulación de la médula espinal (SCS, por sus siglas en inglés) puede restaurar eficazmente la función locomotora después de una lesión de la médula espinal (SCI, por sus siglas en inglés). Debido a que las neuronas motoras son la unidad final para ejecutar los comportamientos sensoriomotores, el estudio directo de las respuestas eléctricas de las neuronas motoras con SCS puede ayudarnos a comprender la lógica subyacente de la modulación motora espinal. Para registrar simultáneamente diversas características de estímulos y respuestas celulares, un patch-clamp es un buen método para estudiar las características electrofisiológicas a escala de una sola célula. Sin embargo, todavía existen algunas dificultades complejas para lograr este objetivo, incluido el mantenimiento de la viabilidad celular, la separación rápida de la médula espinal de la estructura ósea y el uso del SCS para inducir con éxito potenciales de acción. Aquí, presentamos un protocolo detallado que utiliza patch-clamp para estudiar las respuestas eléctricas de las neuronas motoras al SCS con alta resolución espacio-temporal, lo que puede ayudar a los investigadores a mejorar sus habilidades para separar la médula espinal y mantener la viabilidad celular al mismo tiempo para estudiar sin problemas el mecanismo eléctrico del SCS en la neurona motora y evitar pruebas y errores innecesarios.

Introducción

La estimulación de la médula espinal (SCS, por sus siglas en inglés) puede restaurar eficazmente la función locomotora después de una lesión de la médula espinal (SCI, por sus siglas en inglés). Andreas Rowald et al. informaron que el SCS permite la función locomotora y troncal de las extremidades inferiores en un solo día¹. La exploración del mecanismo biológico del SCS para la recuperación locomotora es un campo de investigación crítico y de tendencia para desarrollar una estrategia de SCS más precisa. Por ejemplo, el equipo de Grégoire Courtine demostró que la interneurona excitadora Vsx2 y las neuronas Hoxa10 en la médula espinal son las ne....

Protocolo

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales aprobó todos los experimentos con animales y los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con las normas pertinentes de bienestar animal.

1. Preparación de los animales

1. Animales
   1. Información sobre el alojamiento: Aloje ratas macho Sprague-Dawley (Postnatal 10-14 días, P10-P14) en un ambiente específico libre de patógenos.
      NOTA: Las condiciones de la habitación se mantuvieron a 20 °C ± 2 °C, humedad: 50%-60%, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Los animales tenían libre acceso a comida y agua.
   2. Etiquetar las neuronas motoras retrógradamente: I....

Resultados

Gracias al riguroso mantenimiento a baja temperatura durante la operación fina (Figura suplementaria 1, Figura suplementaria 2 y Figura 1), la viabilidad de la celda fue lo suficientemente buena como para realizar registros electrofisiológicos posteriores. Para simular al máximo el escenario clínico, utilizamos la micromanipulación para colocar el cátodo y el ánodo del SCS cerca de la línea media dorsal y el DREZ, respectivamente (Figura 2), lo .......

Discusión

La información de movimiento modulada por el SCS finalmente converge a las neuronas motoras. Por lo tanto, tomar las neuronas motoras como objetivo de investigación puede simplificar el diseño del estudio y revelar el mecanismo de neuromodulación del SCS de manera más directa. Para registrar simultáneamente diversas características de estímulos y respuestas celulares, un patch-clamp es un buen método para estudiar las características electrofisiológicas a escala de una sola célula. Sin embargo, todavía existen algunas di.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Adenosina 5'-trifosfato sal de magnesio	Sigma	A9187
Ácido ascórbico	Sigma	A4034
CaCl2· 2H2O	Sigma	C5080
Cloruro de colina	Sigma	C7527
Pinzas deslizantes de cubierta	VETUS	36A-SA	Clip una rebanada
D-Glucosa	Sigma	G8270
EGTA	Sigma	E4378
Tijeras finas	RWD Life Science	S12006-10	Cortar el diafragma
Fuente de luz de fluorescencia	Olympus	U-HGLGPS
Fluoro-Oro	Fluorocromo Fluorocromo		Etiquete la neurona motora
Guanosina 5′-trifosfato sodio sal hidrato	Sigma	G8877
HEPES	Sigma	H3375
cámara CCD infrarroja	Dage-MTI	IR-1000E
KCl	Sigma	P5405
K-gluconato	Sigma	P1847
Agarosa de bajo punto de fusión	Sigma	A9414
MgSO4· 7H2O	Sigma	M2773
Micromanipulador	Instrumento Sutter	MP-200
Extractor de micropipetas	Instrumento Sutter	P1000
Microtijeras	Jinzhong	wa1020	laminectomía
para anatomía	Olympus	SZX10
Microscopio para ecletrofisiología	Olympus	BX51WI
Pinzas microdentadas	RWD Life Science	F11008-09	Levanta el cuerpo vertebral cortado
NaCl	Sigma	S5886
NaH2PO4	Sigma	S8282
NaHCO3	Sigma	V900182
Na-Fosfocreatina	Sigma	P7936
Lente objetivo para ecletrofisiología	Olympus	LUMPLFLN60XW	distancia de trabajo 2 mm
Osmómetro	Avanzado	FISKE 210
Amplificador de pinza de parche	Axon	Multiclamp 700B
Digitalizador de pinza de parche	Axon	Digidata 1550B
	Mettler Toledo	FE28
Anclaje de corte	Sistema multicanal	SHD-27H
Estimulador de la médula espinal	PINS	T901
Pinza dentada	RWD Life Science	F13030-10	Levanta el xifoide
Vibratome	Leica	VT1200S
Filtro de excitación ultravioleta de banda ancha	Olympus	U-MF2

Microscopio de Medidor de pH