Artículo de método

Actividad adyuvante de Mycobacterium paratuberculosis en la mejora de la inmunogenicidad de los autoantígenos durante la encefalomielitis autoinmune experimental

DOI:

10.3791/65422

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12 de mayo de 2023

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1Department of Neurology, Juntendo University, 2Biomedical Research Core Facilities, Juntendo University, 3Neurodegenerative Disorders Collaborative laboratory, RIKEN Center for Brain Science

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos un protocolo alternativo para inducir activamente encefalomielitis autoinmune experimental en ratones C57BL / 6, utilizando la glicoproteína oligodendrocitos de mielina inmunogénica epítopo (MOG) 35-55 suspendida en el adyuvante de Freund incompleto que contiene la subespecie paratuberculosis Mycobacterium avium muerta por calor.

Resumen

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La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inducida por la glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG) requiere la inmunización por un péptido MOG emulsionado en el adyuvante de Freund completo (CFA) que contiene Mycobacterium tuberculosis inactivada. Los componentes antigénicos de la micobacteria activan las células dendríticas para estimular a las células T a producir citoquinas que promueven la respuesta Th1 a través de receptores tipo toll. Por lo tanto, la cantidad y las especies de micobacterias presentes durante el desafío antigénico están directamente relacionadas con el desarrollo de EAE. Este documento de métodos presenta un protocolo alternativo para inducir EAE en ratones C57BL / 6 utilizando un adyuvante de Freund incompleto modificado que contiene la subespecie de paratuberculosis K-10 de Mycobacterium avium muerta por calor.

M. paratuberculosis, un miembro del complejo Mycobacterium avium, es el agente causal de la enfermedad de Johne en rumiantes y se ha identificado como un factor de riesgo para varios trastornos mediados por células T humanas, incluida la esclerosis múltiple. En general, los ratones inmunizados con Mycobacterium paratuberculosis mostraron un inicio más temprano y una mayor gravedad de la enfermedad que los ratones inmunizados con CFA que contenían la cepa de M. tuberculosis H37Ra a las mismas dosis de 4 mg / ml. Los determinantes antigénicos de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) cepa K-10 fueron capaces de inducir una fuerte respuesta celular Th1 durante la fase efectora, caracterizada por un número significativamente mayor de linfocitos T (CD4+ CD27+), células dendríticas (CD11c+ I-A/I-E+) y monocitos (CD11b+ CD115+) en el bazo en comparación con los ratones inmunizados con CFA. Además, la respuesta proliferativa de las células T al péptido MOG pareció ser más alta en ratones inmunizados con M. paratuberculosis. El uso de un encefalitógeno (por ejemplo, MOG35-55) emulsionado en un adyuvante que contiene M. paratuberculosis en la formulación puede ser un método alternativo y validado para activar las células dendríticas para preparar las células T CD4+ específicas del epítopo de mielina durante la fase de inducción de la EAE.

Introducción

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La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo común para el estudio de los trastornos desmielinizantes humanos1. Existen varios modelos de EAE: inmunización activa utilizando diferentes péptidos de mielina en combinación con potentes adyuvantes, inmunización pasiva mediante transferencia in vitro de linfocitos CD4+ específicos de mielina y modelos transgénicos de EAE2 espontánea. Cada uno de estos modelos tiene características específicas que permiten estudiar diferentes aspectos de EAE, como el inicio, la fase efectora o la fase crónica. El modelo de glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG) de EAE es un buen modelo para estudiar los mecanismos inmunomediados de la neuroinflamación crónica y la desmielinización, ya que se caracteriza por la infiltración inflamatoria mononuclear, la desmielinización en la sustancia blanca periférica y la reducción de la recuperación después del pico de la enfermedad1.

MOG-EAE es inducida por inmunización de ratones susceptibles con el péptido MOG35-55 en adyuvante de Freund completo (CFA), seguido de una inyección intraperitoneal de toxina pertussis. Esto aumenta la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y permite que las células T específicas de mielina activadas en la periferia lleguen al sistema nervioso central (SNC), donde serán reactivadas3. La CFA juega un papel clave en la inducción de EAE al mejorar la captación de antígenos por las células presentadoras de antígenos y la expresión de citoquinas relacionadas con las respuestas humorales y mediadas por células4. Este mecanismo se debe principalmente a la presencia de Mycobacterium tuberculosis muerta emulsionada en aceite, cuyos componentes proporcionan un fuerte estímulo para el sistema inmune5. De hecho, la inducción de EAE está directamente relacionada con la cantidad de micobacterias presentes durante el desafío antigénico6.

La adición de otras micobacterias muertas, como Mycobacterium butyricum, al adyuvante incompleto de Freund 7, así como el efecto de combinaciones adyuvantes8, pueden modular el curso clínico de la EAE y, en consecuencia, influir en la reproducibilidadde los resultados. Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP), el agente etiológico de la enfermedad de Johne en rumiantes, se ha asociado con trastornos inflamatorios del SNChumano 9, ya que sus componentes antigénicos son capaces de provocar una fuerte respuesta humoral y mediada por células en pacientes con esclerosis múltiple y trastorno del espectro de neuromielitis óptica9. Por lo tanto, en este protocolo, mostramos un método alternativo y reproducible para inducir MOG-EAE mediante la sustitución de M. tuberculosis en CFA por M. paratuberculosis.

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Protocolo

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Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Juntendo (Número de Aprobación 290238) y se llevaron a cabo de acuerdo con las Pautas de los Institutos Nacionales de Salud para la Experimentación Animal.

1. Observaciones generales sobre el experimento

  1. Alojar a los ratones en jaulas individuales en la instalación animal en condiciones controladas y libres de patógenos a 23 °C ± 2 °C con 50% ± 10% de humedad, y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con acceso ad libitum a alimentos y agua.
  2. Inyecte a los ratones con solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin antígeno y CFA, y utilícelos como controles negativos y positivos, respectivamente.

2. Preparación de antígenos micobacterianos

  1. Cultivar la cepa M. paratuberculosis K-10 en medio líquido Middlebrook 7H9 enriquecido con 10% de OADC (ácido oleico, albúmina, dextrosa, catalasa), 0,005% de Tween 80 y 2 mg/L de micobactina J durante 2 semanas en matraces de cultivo de tejidos T25 a 37 °C. Evalúe el crecimiento de la colonia regularmente mediante inspección visual.
    PRECAUCIÓN: Manipule M. paratuberculosis en una instalación de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2).
  2. Cultivar el matraz Erlenmeyer de 500 ml de enriquecimiento con una suspensión de 1,7 × 105 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml en un volumen final de 200 ml (mismo medio que el paso 2.1) en una incubadora agitadora durante 1 semana.
    NOTA: Como los organismos contaminantes pueden afectar los resultados, las bacterias deben ser inoculadas en medios sólidos Middlebrook 7H10 para determinar la morfología de la colonia y verificar la pureza mediante kits de detección convencionales de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para M. paratuberculosis.
  3. Inactivar las suspensiones bacterianas durante 5-10 min a 70 °C y centrifugar a 3.000 × g durante 10 min. Lavar el pellet pesado en PBS dos veces, interrumpir por sonicación y almacenar a -20 °C.
  4. Transfiera el pellet a un recipiente estéril y congélelo con hielo seco o nitrógeno líquido. Transfiera inmediatamente a una cámara de liofilización.
  5. Liofilización (4 h a -50 °C al vacío) M. paratuberculosis según el manual de la máquina.
  6. Al final de la liofilización, retire el recipiente de acero inoxidable del liofilizador y transfiéralo a un banco de biolimpieza. Use una espátula de acero inoxidable para desalojar los grumos secos de MAP adheridos a la pared interna del recipiente de acero inoxidable y pulverifíquelos lo más finamente posible.
  7. Pesar las células pulverizadas con una balanza electrónica y colocarlas manualmente en un vial aséptico de 10 ml a una concentración de 10 mg/ml.
    NOTA: La densidad celular se cuantificó como gramos de peso seco por litro de muestra. Después de 3 semanas, 1 mg (peso húmedo) de pellet de células bacterianas contiene aproximadamente 2,5 × 108 UFC.

3. Preparación de la emulsión MOG 35-55

  1. Moler el contenido de un vial de M. paratuberculosis seca (10 mg) hasta obtener un polvo fino con un mortero y añadir 10 ml al adyuvante de Freund incompleto para obtener una solución madre de 10 mg/ml. Conservar a -4 °C.
  2. Antes de la inmunización, diluir la solución madre hasta una concentración final de 4 mg/ml.
  3. Diluir el péptido MOG35-55 enddH2Ohasta una concentración final de 2 mg/ml y almacenar a -20 °C.
  4. Con un homogeneizador, mezclar la solución MOG35-55 (2 mg/ml) con un volumen igual de adyuvante (4 mg/ml) desde el paso 3.2 en un tubo de 5 ml hasta que se forme una emulsión espesa. Después de cada 10 s de mezcla, coloque la solución en hielo durante 20 s y gire el tubo para recuperar toda la solución.
  5. Transfiera la emulsión a una jeringa de 1 ml, retire todo el aire y agregue una aguja de 27 G. La emulsión ya está lista para la inyección.
    NOTA. Dado que se produce cierta pérdida de la emulsión viscosa de MOG35-55 durante la preparación, es mejor preparar 1,5 veces la cantidad necesaria.

4. Inmunización animal

  1. Anestesiar a los animales con inhalación de isoflurano para minimizar el estrés en los animales.
  2. Inyectar la emulsión (200 μL que contiene 200 μg/ratón de MOG35-55) por vía subcutánea en la parte baja de la espalda.
  3. Administrar una dosis de toxina pertussis (100 μL que contienen 200 ng/ratón) por vía intraperitoneal los días 0 y 2 después de la inmunización.
    PRECAUCIÓN: La toxina pertussis tiene un efecto supresor múltiple sobre el sistema inmunológico; Evite la ingestión y el contacto con los ojos y la piel.

5. Evaluación clínica

  1. Controle a los ratones diariamente para determinar el peso y los signos clínicos. Utilice el siguiente sistema de puntuación: 0 = sin signos clínicos; 1 = cola flácida; 2 = deterioro del reflejo de enderezamiento y debilidad de las extremidades posteriores; 3 = parálisis completa de las extremidades posteriores; 4 = parálisis completa de las extremidades posteriores con parálisis parcial de las extremidades anteriores; 5 = moribundo.
    NOTA: Tras la observación inicial de los signos clínicos, los animales reciben un mayor acceso al agua y los alimentos. La comida para roedores se ablanda y humedece, luego se coloca en el piso de la jaula desde la tolva de alimentos. En el caso de animales deshidratados, se administra una suplementación de líquidos subcutáneos, o se administra una suspensión de comida de roedores a través de sonda nasogástrica oral. Si un ratón necesita este tipo de asistencia durante más de 3 días, se realizará la eutanasia.
  2. Para evitar o minimizar el dolor y la angustia de los animales, utilice los siguientes criterios de valoración humanos: pérdida de peso corporal superior al 20%, puntuación clínica ≥4,0, ausencia del reflejo de enderezamiento en la puntuación 3 y cuando el animal no pueda acceder al alimento o al agua durante 24 h.
    NOTA: Los ratones fueron sacrificados el día 30 después de la inducción de EAE mediante inyecciones intraperitoneales de pentobarbital (≥150 mg/kg).

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Resultados

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Grupos de ratones C57BL/6 (total n = 15/grupo) fueron inmunizados con MOG35-55 en una emulsión que contenía M. paratuberculosis o por el método común con CFA. Todos los grupos de ratones manifestaron una enfermedad monofásica aguda caracterizada por un único pico de discapacidad observado a los 14-17 días, seguido de una recuperación parcial de los síntomas durante los siguientes 10 días (Figura 1A). Los ratones inmunizados con el adyuvant...

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Discusión

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Demostramos un protocolo alternativo robusto para inducir activamente EAE severa en ratones C57BL / 6J utilizando el péptido MOG35-55 emulsionado en un adyuvante que contiene M. paratuberculosis10. La inducción de EAE por este método resultó en una enfermedad más grave que la inducida por el protocolo común con CFA. Esta diferencia podría deberse a los diferentes componentes lipídicos en la pared celular de las micobacterias11. De hecho, a diferencia de ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo recibió apoyo de una subvención de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (subvención no. JP 23K14675).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
anticuerpo CD115 de ratónBiolegend, EE. UU.135505para citoforimetría 1:1.000
anticuerpo CD11b de ratónBiolegend, EE. UU.101215para citofluorimetría 1:1.000
anticuerpo anti-ratón CD11cBiolegend, EE. UU.117313para citoforimetría 1:1.000
anti-ratón CD16/32  anticuerpoBiolegend, EE. UU101302para citofluorimetría 1:1.000
anticuerpo anti-CD4  de ratónBiolegend, EE.UU.116004para citofluorimetría 1:1.000
anticuerpo anti-ratón CD8a Biolegend, EE.UU.100753para citoforimetría 1:1.000
anticuerpo anti-ratón I-A/I-E Biolegend, EE. UU.107635para citofluorimetría 1:1.000
anti-ratón anti-anti-ratón Ly-6C Biolegend, EE. UU.128023para citofluorimetría 1:1.000
BBL Middlebrook OADC EnrichmentThermo Fisher Scientific, EE. UU.BD 211886para el aislamiento y cultivo de
micobacterias C57BL/6JCharles River Laboratory, Japón3 semanas de edad, macho y hembra
FBS 10279-106Gibco Life Techologies, EE. UU42F9155Kpara cultivo celular, caliente a 37 & grados; C antes
de usar Máquina liofilizadoraEyela, Tokio, JapónFDU-1200para la liofilización de bacterias
incompleta e Freund' s adyuvanteDifco Laboratories, MD, EE. UU263810para uso en coadyuvante
Caldo Middlebrook 7H9Difco Laboratories, MD, EE. UU90003-876ayuda en el crecimiento de micobacterias
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10ATCC, EE. UUBaa-968bacterias de origen bovino
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, desecadoBD Biosciences, EE. UU743-26880-EApara uso adyuvante
Mycobactina JAllied Laboratory, MO, EE. UU.Promotor de crecimiento
Mielina Oligodendrocito Glicolípido (MOG) 35-55AnaSpec, EE. UUAS-60130-10péptido encefalotigénico
Ovoalbúmina (257-264)Sigma-Aldrich, EE. UUS7951-1MGantígeno de control negativo  para ensayo proliferativo
solución de toxina para la tos ferinaFujifilm Wako, Osaka Japón168-22471De la bacteria gramnegativa Bordetella pertussi, aumenta la permeabilidad de la barrera hematoencefálica
Homogeneizador Polytron PT 3100Kinematicapara mezclar el antígeno con el adyuvante
RPMI 1640 con L-glutaminaGibco Life Techologies, EE. UU.11875093Para cultivo celular
Timidina, [Metil-3H], en etanol al 2%, 1 mCiPerkinElmer, Waltham, MA, EE.UU. NET027W001MCpara el ensayo de proliferación, uso (1 μ Ci/well)
Zombie NIR Fixable Kit de Viabilidad Biolegend, EE. UU.423105  citofluorimetría, para la viabilidad celular
. ratones . . . . . . .

Referencias

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  2. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  3. Lu, C., et al. Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).
  4. Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G. Mechanisms of action of adjuvants. Frontiers in Immunology. 4, 114(2013).
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P ptido MOGadyuvante incompleto de Freundactivaci n de c lulas dendr ticasrespuesta Th1proliferaci n de linfocitos Tmodelo de neuroinflamaci nproducci n de citocinas

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