Aquí, presentamos un protocolo alternativo para inducir activamente encefalomielitis autoinmune experimental en ratones C57BL / 6, utilizando la glicoproteína oligodendrocitos de mielina inmunogénica epítopo (MOG) 35-55 suspendida en el adyuvante de Freund incompleto que contiene la subespecie paratuberculosis Mycobacterium avium muerta por calor.
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Artículo de método
Actividad adyuvante de Mycobacterium paratuberculosis en la mejora de la inmunogenicidad de los autoantígenos durante la encefalomielitis autoinmune experimental
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Resumen
Resumen
La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inducida por la glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG) requiere la inmunización por un péptido MOG emulsionado en el adyuvante de Freund completo (CFA) que contiene Mycobacterium tuberculosis inactivada. Los componentes antigénicos de la micobacteria activan las células dendríticas para estimular a las células T a producir citoquinas que promueven la respuesta Th1 a través de receptores tipo toll. Por lo tanto, la cantidad y las especies de micobacterias presentes durante el desafío antigénico están directamente relacionadas con el desarrollo de EAE. Este documento de métodos presenta un protocolo alternativo para inducir EAE en ratones C57BL / 6 utilizando un adyuvante de Freund incompleto modificado que contiene la subespecie de paratuberculosis K-10 de Mycobacterium avium muerta por calor.
M. paratuberculosis, un miembro del complejo Mycobacterium avium, es el agente causal de la enfermedad de Johne en rumiantes y se ha identificado como un factor de riesgo para varios trastornos mediados por células T humanas, incluida la esclerosis múltiple. En general, los ratones inmunizados con Mycobacterium paratuberculosis mostraron un inicio más temprano y una mayor gravedad de la enfermedad que los ratones inmunizados con CFA que contenían la cepa de M. tuberculosis H37Ra a las mismas dosis de 4 mg / ml. Los determinantes antigénicos de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MAP) cepa K-10 fueron capaces de inducir una fuerte respuesta celular Th1 durante la fase efectora, caracterizada por un número significativamente mayor de linfocitos T (CD4+ CD27+), células dendríticas (CD11c+ I-A/I-E+) y monocitos (CD11b+ CD115+) en el bazo en comparación con los ratones inmunizados con CFA. Además, la respuesta proliferativa de las células T al péptido MOG pareció ser más alta en ratones inmunizados con M. paratuberculosis. El uso de un encefalitógeno (por ejemplo, MOG35-55) emulsionado en un adyuvante que contiene M. paratuberculosis en la formulación puede ser un método alternativo y validado para activar las células dendríticas para preparar las células T CD4+ específicas del epítopo de mielina durante la fase de inducción de la EAE.
Introducción
La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo común para el estudio de los trastornos desmielinizantes humanos1. Existen varios modelos de EAE: inmunización activa utilizando diferentes péptidos de mielina en combinación con potentes adyuvantes, inmunización pasiva mediante transferencia in vitro de linfocitos CD4+ específicos de mielina y modelos transgénicos de EAE2 espontánea. Cada uno de estos modelos tiene características específicas que permiten estudiar diferentes aspectos de EAE, como el inicio, la fase efectora o la fase crónica. El modelo de glicoproteína oligodendrocitos de....
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Protocolo
Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Juntendo (Número de Aprobación 290238) y se llevaron a cabo de acuerdo con las Pautas de los Institutos Nacionales de Salud para la Experimentación Animal.
1. Observaciones generales sobre el experimento
- Alojar a los ratones en jaulas individuales en la instalación animal en condiciones controladas y libres de patógenos a 23 °C ± 2 °C con 50% ± 10% de humedad, y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con acceso ad libitum a alimentos y agua.
- Inye....
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Resultados
Grupos de ratones C57BL/6 (total n = 15/grupo) fueron inmunizados con MOG35-55 en una emulsión que contenía M. paratuberculosis o por el método común con CFA. Todos los grupos de ratones manifestaron una enfermedad monofásica aguda caracterizada por un único pico de discapacidad observado a los 14-17 días, seguido de una recuperación parcial de los síntomas durante los siguientes 10 días (Figura 1A). Los ratones inmunizados con el adyuvant.......
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Discusión
Demostramos un protocolo alternativo robusto para inducir activamente EAE severa en ratones C57BL / 6J utilizando el péptido MOG35-55 emulsionado en un adyuvante que contiene M. paratuberculosis10. La inducción de EAE por este método resultó en una enfermedad más grave que la inducida por el protocolo común con CFA. Esta diferencia podría deberse a los diferentes componentes lipídicos en la pared celular de las micobacterias11. De hecho, a diferencia de .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo recibió apoyo de una subvención de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (subvención no. JP 23K14675).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| anticuerpo CD115 de ratón | Biolegend, EE. UU. | 135505 | para citoforimetría 1:1.000 |
| anticuerpo CD11b de ratón | Biolegend, EE. UU. | 101215 | para citofluorimetría 1:1.000 |
| anticuerpo anti-ratón CD11c | Biolegend, EE. UU. | 117313 | para citoforimetría 1:1.000 |
| anti-ratón CD16/32 anticuerpo | Biolegend, EE. UU | 101302 | para citofluorimetría 1:1.000 |
| anticuerpo anti-CD4 de ratón | Biolegend, EE.UU. | 116004 | para citofluorimetría 1:1.000 |
| anticuerpo anti-ratón CD8a | Biolegend, EE.UU. | 100753 | para citoforimetría 1:1.000 |
| anticuerpo anti-ratón I-A/I-E Biolegend | , EE. UU. | 107635 | para citofluorimetría 1:1.000 |
| anti-ratón anti-anti-ratón Ly-6C | Biolegend, EE. UU. | 128023 | para citofluorimetría 1:1.000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, EE. UU. | BD 211886 | para el aislamiento y cultivo de |
| micobacterias C57BL/6J | Charles River Laboratory, Japón | 3 semanas de edad, macho y hembra | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, EE. UU | 42F9155K | para cultivo celular, caliente a 37 & grados; C antes |
| de usar Máquina liofilizadora | Eyela, Tokio, Japón | FDU-1200 | para la liofilización de bacterias |
| incompleta e Freund' s adyuvante | Difco Laboratories, MD, EE. UU | 263810 | para uso en coadyuvante |
| Caldo Middlebrook 7H9 | Difco Laboratories, MD, EE. UU | 90003-876 | ayuda en el crecimiento de micobacterias |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, EE. UU | Baa-968 | bacterias de origen bovino |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, desecado | BD Biosciences, EE. UU | 743-26880-EA | para uso adyuvante |
| Mycobactina J | Allied Laboratory, MO, EE. UU. | Promotor de crecimiento | |
| Mielina Oligodendrocito Glicolípido (MOG) 35-55 | AnaSpec, EE. UU | AS-60130-10 | péptido encefalotigénico |
| Ovoalbúmina (257-264) | Sigma-Aldrich, EE. UU | S7951-1MG | antígeno de control negativo para ensayo proliferativo |
| solución de toxina para la tos ferina | Fujifilm Wako, Osaka Japón | 168-22471 | De la bacteria gramnegativa Bordetella pertussi, aumenta la permeabilidad de la barrera hematoencefálica |
| Homogeneizador Polytron PT 3100 | Kinematica | para mezclar el antígeno con el adyuvante | |
| RPMI 1640 con L-glutamina | Gibco Life Techologies, EE. UU. | 11875093 | Para cultivo celular |
| Timidina, [Metil-3H], en etanol al 2%, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, EE.UU | . NET027W001MC | para el ensayo de proliferación, uso (1 μ Ci/well) |
| Zombie NIR Fixable Kit de Viabilidad Biolegend | , EE. UU. | 423105 | citofluorimetría, para la viabilidad celular |
Referencias
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275(2014).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B.
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Reimpresiones y permisos
