Detección de canales iónicos en células cancerosas

Las proteínas transportadoras de membrana son fundamentales para la comunicación entre las células, así como para mantener la homeostasis celular. Entre las proteínas transportadoras de membrana, los canales iónicos sirven para impulsar el crecimiento y desarrollo de las células y para mantener el estado de las células en entornos desafiantes y cambiantes. También se ha descrito que los canales iónicos impulsan y apoyan el desarrollo de tumores sólidos, tanto sistémicamente como en el sistema nervioso central (SNC)^1,2. Por ejemplo, los canales KCa3.1 son responsables de regular el potencial de membrana y controlar el volumen celular, lo cual es importante en la regulación del ciclo celular. Se ha descrito que los canales defectuosos de KCa3.1 contribuyen a la proliferación anormal de las células tumorales³. Además, los canales iónicos pueden contribuir a la diseminación metastásica de los cánceres. Los canales de potencial receptor transitorio (TRP), por ejemplo, están implicados en la entrada de Ca 2+ y Mg²⁺; Esta afluencia activa varias quinasas y proteínas de choque térmico que funcionan para regular la matriz extracelular que rodea a un tumor, lo que a su vez es importante para iniciar la metástasis del cáncer⁴.

Dado que los canales iónicos pueden contribuir al desarrollo de cánceres, también pueden ser objetivos para el tratamiento del cáncer relacionado con medicamentos. Por ejemplo, la resistencia a las modalidades de tratamiento, incluida la quimioterapia y la inmunoterapia novedosa, está relacionada con la desregulación de la función de los canales iónicos ^5,6,7. Además, los canales iónicos están emergiendo como importantes dianas farmacológicas para impedir el crecimiento y el desarrollo de cánceres, con fármacos de moléculas pequeñas reutilizados (aprobados por la FDA) que se están examinando, así como biopolímeros, incluidos los anticuerpos monoclonales 1,2,8,9. Si bien ha habido muchos avances en este frente, el descubrimiento de fármacos contra el cáncer por canales iónicos sigue estando poco desarrollado. Esto se debe en parte a los desafíos únicos de estudiar los canales iónicos en las células cancerosas. Por ejemplo, existen limitaciones técnicas en la configuración de ensayos electrofisiológicos para compuestos de acción lenta y diferencias temporales en la activación del canal y la acción del fármaco. Además, la solubilidad de los compuestos también puede impedir el progreso, ya que la mayoría de los sistemas de electrofisiología automatizados que se utilizan habitualmente hoy en día utilizan sustratos hidrófobos, que pueden contribuir a la formación de artefactos como resultado de la adsorción de los compuestos. Además, las terapias moleculares bioorgánicas de gran tamaño, como los productos naturales, los péptidos y los anticuerpos monoclonales, son técnicamente difíciles de cribar mediante ensayos de electrofisiología convencionales¹⁰. Por último, las propiedades bioeléctricas de las células cancerosas siguen siendo poco conocidas¹¹.

Mientras tanto, la tinción por inmunofluorescencia de los canales iónicos suele ser un reto. Esto se debe, en parte, a la complejidad de sus estructuras y su contexto en la membrana, que afectan a la capacidad de generar y emplear anticuerpos para estudios de microscopía. Es especialmente importante que los anticuerpos utilizados para teñir los canales iónicos sean validados en cuanto a especificidad, afinidad y reproducibilidad. Los anticuerpos comerciales para los canales iónicos deben considerarse en función de su estrategia de validación y su historial de publicación. Los experimentos deben incluir controles negativos para demostrar la falta de unión inespecífica por knockdown o knockout de la proteína diana. Alternativamente, las líneas celulares en las que la proteína diana está ausente o en baja abundancia en función de las determinaciones de ARNm o proteínas pueden servir como controles negativos. Por ejemplo, este estudio muestra la localización de la subunidad del receptor (GABA) Gabra5 en una línea celular de meduloblastoma (D283). Las células D283 con una eliminación de siRNA y las células Daoy, otra línea celular de meduloblastoma cerebeloso, se tiñeron para Gabra5 y no mostraron tinción apreciable (datos no mostrados).

Aquí, se presentan métodos para analizar y ensayar la función de los canales iónicos, así como el efecto de los moduladores de los canales iónicos en las células cancerosas. Se proporcionan protocolos para (1) teñir células para un canal iónico, (2) probar el estado polarizado de las mitocondrias, (3) establecer la función del canal iónico mediante electrofisiología y (4) validación in vitro del fármaco. Estos protocolos enfatizan los estudios del receptor 2,12,13,14,15,16 del ácido gamma-aminobutírico tipo ^A (GABA_A), un canal de anión cloruro y un receptor de neurotransmisor inhibidor mayor. Sin embargo, los métodos presentados aquí se aplican al estudio de muchas otras células cancerosas y canales iónicos.

1. Inmunomarcaje de canales iónicos en células cultivadas

1. Preparación de las células y puesta en marcha experimental
   1. Mantener las células como un cultivo en crecimiento activo en matraces de^{75 cm2} de cultivo. Pase las células una vez hasta que se vuelvan 50%-90% confluentes, dependiendo del tiempo de duplicación de la línea celular que se esté utilizando.
      NOTA: Para el presente estudio, se utilizaron células D283, una línea celular de meduloblastoma del Grupo 3.
   2. Recoja las células del matraz de cultivo en un tubo de centrífuga (15 ml o 50 ml) y agregue 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25 % para separar las células adherentes. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Después de 5 minutos, golpee el matraz de tres a cinco veces para ayudar a separar las células. Recolectar las células en 10 mL de medio con FBS al 10% para detener la acción de la tripsina.
   3. Centrifugar a 480 x g durante 5 min a RT. Aspirar suavemente el medio. No perturbe el gránulo de la celda.
   4. Resuspender las células en 5 mL a 10 mL de medio, dependiendo de la densidad del cultivo.
      NOTA: La densidad debe ser consistente con las células en crecimiento activo y depende de la confluencia de células en el matraz. La evaluación visual debe utilizarse para aproximarse a la densidad celular óptima; En concreto, las células deben tener entre un 40% y un 90% de confluentes y estar distribuidas uniformemente.
   5. Extraer 100 μL de células y añadirlas a un tubo de 1,5 ml que contenga 100 μL de azul de tripano al 0,4% para marcar las células no viables. Incubar de 5 a 15 minutos en RT, dependiendo de la línea celular.
   6. Cuente las células manualmente con un hemocitómetro (consulte la Tabla de materiales) en 10 μL de solución. Cuente las células vivas sin teñir en cada una de las cuatro esquinas de los 16 cuadrados del hemocitómetro. Multiplique el número promedio de células por el factor de dilución y por 10,000 para obtener las células por mililitro (células/mL). Alternativamente, se puede utilizar un contador de celdas automatizado.
   7. Diluir las células a 1 x 10⁵ células/ml en el medio de cultivo especificado para cada línea celular. Semilla 1. 8 ml de células en cada pocillo de una placa de 6 pocillos que contiene un cubreobjetos de 22 mm x 22 mm prerrecubierto con 0,1 mg/ml de poli-D-lisina según las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: Es posible que desee probar el uso tanto de poli-D-lisina como de poli-L-lisina, ya que hay informes de preferencias específicas de líneas celulares^17,18. Algunas líneas celulares tienen proteasas que pueden descomponer la poli-L-lisina, mientras que hay informes de que la poli-D-lisina es tóxica para algunas líneas celulares. Por el contrario, se ha informado que las células neuronales, como PC12, son más saludables en superficies de poli-D-lisina.
   8. Cultive las células en una incubadora con un ambiente humidificado al 5% de_CO2 a 37 °C durante la noche para permitir que las células se adhieran al cubreobjetos. Examine la unión de las células bajo un microscopio invertido con un objetivo de 20x.
      NOTA: Las células deben estar completamente adheridas al cubreobjetos antes del tratamiento o la inmunotinción directa. En este momento, las células se pueden tratar con fármacos (o control de vehículos) mediante la adición de un stock concentrado (por ejemplo, 600 μL de una solución madre 4x) o la sustitución del medio con un medio fresco que contenga el fármaco a la concentración deseada de 1x; A continuación, las células pueden devolverse a la incubadora durante un máximo de 48 horas adicionales. Se incluyen células tratadas con disolventes para evaluar los efectos del fármaco a nivel y localización de la molécula diana. En el presente estudio, las células D283 fueron tratadas con 600 μL de una solución de 3,2 μM de un modulador alostérico positivo para el receptor GABA_A , QH-II-066¹⁴ (ver Tabla de Materiales), durante 48 h. Las células control fueron tratadas con un volumen equivalente de DMSO.
2. Preparación para el inmunomarcaje: fijación, permeabilización y bloqueo
   1. Enjuague las células con 2,5 mL de 1x PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 8 mM de Na 2 HPO 4,2 mM de KH₂PO₄, consulte la Tabla de Materiales) e inmediatamente aspire la solución.
   2. Fije las células usando 1 mL de PFA al 4% en 1x PBS durante 1 h en RT.
      NOTA: Si bien el PFA al 4% es el fijador estándar para la inmunotinción, el glutaraldehído o el glioxal también se pueden usar para fijar proteínas de membrana para inmunofluorescencia. Los métodos de fijación a base de alcohol, como los tratamientos con metanol helado, pueden conducir a una morfología peor conservada y a una pérdida de proteínas de membrana^19,20.
   3. Lavar seis veces con 2,0 ml de 1x PBS (5 min por lavado) agitando en una coctelera. Incubar durante 1 h a RT en un tampón de bloqueo compuesto por 1x PBS con 0,8% de Triton X-100 y 10% de suero normal que coincida con la especie huésped del anticuerpo primario (alternativamente, se puede utilizar BSA al 3% o albúmina de fracción V sérica bovina en lugar de suero normal).
      NOTA: Este paso se emplea para bloquear el enlace no específico.
3. Inmunomarcaje
   NOTA: Después de añadir los anticuerpos conjugados a los fluoróforos, se deben realizar mediciones pronto para evitar el fotoblanqueo. Las incubaciones con anticuerpos conjugados deben protegerse de la luz. El uso de un medio de montaje que contenga agentes que eliminen los radicales libres reducirá el fotoblanqueo. Guarde los portaobjetos en un recipiente hermético a la luz y opaco (a 4 °C) después de sellar los cubreobjetos. Al obtener imágenes, el fotoblanqueo se puede minimizar limitando la intensidad de la iluminación de excitación y los tiempos de exposición.
   1. Prepare una cámara humidificada forrando el fondo de una placa de cultivo de 150 mm con papel de filtro. Humedece el papel de filtro con agua destilada estéril. Dibuje una cuadrícula de 3 x 2 en un trozo de película de laboratorio cortada para que quepa en la parte superior del papel de filtro y etiquétela para preservar la orientación de los cubreobjetos en la placa de 6 pocillos. Coloque la película de laboratorio encima del papel de filtro, exponiendo los bordes superior e inferior para humedecer la cámara.
   2. Preparar 100 μL por cubreobjetos de la dilución deseada del anticuerpo primario en 1x PBS con BSA al 3%. Para detectar el producto proteico del gen GABRA , utilice el anticuerpo primario monoclonal recombinante de conejo a una dilución de 1:200 (anticuerpo Gabra5, región media; véase la tabla de materiales).
      NOTA: Para determinar empíricamente la concentración de anticuerpos primarios que produce la señal óptima sobre el fondo, utilice una serie de diluciones del anticuerpo primario mientras mantiene constante la concentración secundaria. Se recomiendan diluciones de 1:100, 1:250, 1:500, 1:750 y 1:1.000 para establecer concentraciones óptimas de anticuerpos primarios.
   3. Transfiera el cubreobjetos de la solución en bloque en la placa de 6 pocillos a la ubicación adecuada en la cuadrícula dibujada en la película de laboratorio. Deseche la solución en bloque de la placa de 6 pocillos y conserve la placa para los pasos de lavado.
   4. Agregue con cuidado 100 μL de anticuerpo primario diluido en el centro de cada cubreobjetos. Evite colocar la solución sobre el borde del cubreobjetos. Incubar durante 1 hora en RT.
   5. Agregue 2.5 ml de 1x PBS a cada pocillo de la placa de 6 pocillos. Transfiera el cubreobjetos de nuevo a la ubicación adecuada en la placa de 6 pocillos.
   6. Realice seis lavados durante 5 minutos cada uno con 2,5 ml de 1x PBS.
      NOTA: No permita que los cubreobjetos se sequen durante los pasos de enjuague, ya que esto puede contribuir a una señal de fluorescencia de fondo.
   7. Vuelva a colocar los cubreobjetos en el lugar adecuado de la película de laboratorio. Para cada cubreobjetos, añadir 100 μL de anticuerpo secundario diluido en 1x PBS + 1%-5% BSA.
      NOTA: Inicialmente, los anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488 (consulte la Tabla de materiales) se utilizan en una dilución de 1:1,000 en 1x PBS + 3% BSA. La concentración secundaria de anticuerpos puede optimizarse aumentando la concentración para detectar proteínas diana de baja abundancia o disminuyendo la concentración para reducir el fondo, si es necesario.
   8. Para los pasos restantes, minimice la exposición a la luz para evitar el fotoblanqueo del anticuerpo secundario conjugado. Cubra la placa de cultivo con papel de aluminio e incube durante 1 h a RT.
   9. Transfiera los cubreobjetos de nuevo a la placa de 6 pocillos. Con una coctelera, realice seis lavados durante 5 minutos cada uno con 2,5 ml de 1x PBS. Retire el PBS invirtiendo el plato sobre el fregadero o un recipiente de desechos. Después del último lavado, deje el PBS en el pozo para facilitar la extracción del cubreobjetos.
   10. Etiquete un portaobjetos de microscopio para cada cubreobjetos. Agregue una gota de medio de montaje que contenga glicerol con DAPI (para teñir los núcleos) (consulte la Tabla de materiales) en el centro del portaobjetos.
   11. Con unas pinzas, retire el cubreobjetos del pocillo y colóquelo suavemente sobre la gota de medio de montaje en el centro del portaobjetos.
       NOTA: Evite la formación de burbujas de aire en el medio de montaje.
   12. Utilice pequeños trozos de papel de filtro para eliminar el exceso de medio de montaje. Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas y deje que el esmalte se seque por completo antes de tomar imágenes. Guarde los portaobjetos de vidrio a 4 °C en una caja de plástico opaco.
4. Obtención de imágenes y análisis
   1. Adquiera imágenes con un microscopio de fluorescencia bajo un objetivo de 40x con aceite de inmersión (consulte la Tabla de materiales).
   2. Visualice las imágenes de fluorescencia con los filtros adecuados.
   3. NOTA: Para Alexa Fluor 488, utilice una excitación/emisión de 496 nm/519 nm; para DAPI, utilice una excitación/emisión de 358 nm/461 nm.
   4. Capture y guarde los archivos de imagen digital. Se utiliza un valor de discretización de 4 x 4 para facilitar las tasas de recopilación de imágenes y reducir el fondo.
   5. Prepara las imágenes finales. Las imágenes se pueden procesar con ImageJ o con software disponible en el mercado. Los resultados se ilustran en la Figura 1.

2. Probar el estado polarizado de las mitocondrias

NOTA: Este protocolo utiliza el ensayo TMRE (tetrametilrodamina, éster etílico) para marcar el potencial de membrana en mitocondrias activas, manteniendo una carga negativa^21,22. TMRE es un colorante permeable a las células, de color rojo anaranjado y cargado positivamente que se acumula en las mitocondrias activas debido a su carga negativa relativa. Las mitocondrias inactivas o despolarizadas tienen un potencial de membrana reducido y no logran secuestrar proporcionalmente TMRE. El FCCP (cianuro de carbonilo 4-[trifluorometoxi]fenilhidrazona), un ionóforo desacoplador de la fosforilación oxidativa (OXPHOS), despolariza las membranas mitocondriales, evitando así la acumulación y el secuestro de TMRE²³. Esto se ilustra en la Figura 2.

1. Preparación de las células y puesta en marcha experimental
   1. Mantener las células en^{matraces de cultivo de 75 cm2} . Aspirar el medio de cultivo y enjuagar las células con 1x PBS sin calcio ni magnesio.
   2. Añadir 2 mL de tripsina-EDTA al 0,25% para separar las células adherentes. Incubar durante 5 min a RT y resuspender las células en 10 mL de medio.
   3. Recoja las células del matraz de cultivo en un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 480 x g durante 5 min a RT. Aspirar el medio.
   4. Resuspender las células en 5 mL a 10 mL de medio, dependiendo de la confluencia original del cultivo, de modo que la concentración celular sea de 50-100 células por cuadrado en el hemocitómetro. Ajuste el volumen, si es necesario, para proporcionar la densidad celular necesaria para un conteo preciso.
   5. Retire 100 μL de células y agréguelas a un tubo de 1,5 ml que contenga 100 μL de azul de tripano al 0,4%. Cuente las células con un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Diluir las células a 3 x 10⁴ células/mL en medio de cultivo sin rojo de fenol.
      NOTA: Se utiliza un medio DMEM que carece de rojo de fenol porque la exposición al rojo de fenol inhibe la permeabilidad de la membrana y puede contribuir a la autofluorescencia de fondo.
   6. Siembre 2,5 ml de la suspensión celular (75.000 células) por pocillo en una placa de 6 pocillos que contenga un cubreobjetos de 22 x 22 mm prerrecubierto con poli-D-lisina según las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
   7. Cultive las células en una incubadora con 5% de CO₂ humidificado a 37 °C durante la noche para permitir que las células se adhieran al cubreobjetos.
   8. Examine la unión de las células bajo un microscopio invertido con un objetivo de 20x. Las celdas deben estar completamente adheridas al cubreobjetos antes de continuar.
2. Preparación de soluciones madre
   1. Para preparar una solución madre de 1 mM (1.000x) de TMRE (MW = 514,96 g/mol) (véase la Tabla de Materiales), disolver 1 mg de TMRE en 1,94 mL de DMSO. Alícuota y almacenar a -20 °C protegido de la luz. Evite los ciclos repetidos de congelación/descongelación.
   2. Para preparar una solución madre de 50 mM (2.500x) de FCCP (MW = 254,17 g/mol) (desacoplador de fosforilación oxidativa mitocondrial), disolver 10 mg de FCCP en 786,9 μL de DMSO. Alícuota y almacenar a -20 °C protegido de la luz. Evite los ciclos repetidos de congelación/descongelación.
   3. NOTA: Las soluciones madre preparadas forman parte del kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial TMRE (consulte la Tabla de materiales).
3. Establecimiento de la concentración de TMRE para las líneas celulares
   1. Preparar una solución TMRE de trabajo de 500 nM en medio de cultivo celular. Proteja la solución de trabajo de la luz.
   2. Agregue TMRE a las células cultivadas en los cubreobjetos en un rango de concentración medio a final entre 50-200 nM. Para ello, aspire primero el medio de cultivo y reemplácelo por un medio de cultivo que contenga TMRE.
   3. Incubar durante 20 min a 37 °C. Asegúrese de escalonar los tiempos de tratamiento para permitir la obtención de imágenes, ya que las células se ven en vivo.
   4. Lave las células dos veces con 1x PBS e invierta el cubreobjetos en un portaobjetos de microscopio etiquetado con la concentración final de TMRE.
   5. Obtenga inmediatamente imágenes de las células vivas (pico E_x/E_m = 549 nm/575 nm).
      NOTA: Tome inmediatamente imágenes de las muestras una vez retiradas de las condiciones de cultivo, ya que la salud mitocondrial se ve comprometida una vez que las células se retiran del medio y se colocan en un portaobjetos de microscopio. Como alternativa a los cubreobjetos, las células se pueden visualizar en platos con fondo de vidrio.
   6. Capture las imágenes con el microscopio y el software disponibles.
      NOTA: Establezca parámetros experimentales de imágenes de microscopía durante el proceso de optimización de la concentración de TMRE y mantenga las mismas condiciones en experimentos posteriores para garantizar una comparación precisa de los datos. El protocolo detallado empleó un microscopio confocal y un software compatible (ver la Tabla de Materiales).
   7. Seleccione la concentración óptima de TMRE, que depende de la línea celular.
      NOTA: La concentración de TMRE que proporciona la mejor señal para resolver los cambios en los niveles de TMRE mitocondrial es generalmente la concentración de TMRE más baja, lo que proporciona una señal de fluorescencia uniforme y fácilmente detectable.
4. Comprobación del estado polarizado de una célula
   1. Preparación del ensayo
      1. Prepare las soluciones madre de tratamiento en las concentraciones deseadas y prepare los medios con la concentración final del compuesto que se va a ensayar. Para FCCP, la solución madre debe ser de 20 mM (preparada con DMSO a partir de una solución madre de 50 mM).
      2. Trabajando en un solo cubreobjetos a la vez, agregue 1,8 ml de medio más el compuesto de prueba a las celdas.
      3. Incubar las células con el compuesto problema a 37 °C y 5% de CO₂ en un ambiente humidificado durante el período de tiempo deseado.
         NOTA: Los tiempos de tratamiento variarán en función del mecanismo por el cual el compuesto problema pueda alterar el potencial de membrana mitocondrial. Los protonóforos potentes como el FCCP que despolarizan rápida y directamente los potenciales de membrana mitocondrial requieren análisis poco después del tratamiento (en cuestión de minutos). Por el contrario, los efectos del tratamiento con compuestos que afectan indirectamente a la función de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, como los que alteran la activación o el recambio proteico o requieren la síntesis de proteínas, pueden tardar más en mostrar un efecto.
      4. Durante la incubación, encienda el microscopio y configúrelo en los parámetros de imagen óptimos predeterminados, incluidos los términos de ganancia, intensidad del láser, velocidad de captura de imágenes, promedio y tiempo de exposición.
      5. Después del período de tratamiento farmacológico, añadir 200 μL de TMRE 10x (concentración óptima determinada anteriormente) a las células de control y tratadas con fármaco.
      6. Incubar durante 15-30 min a 37 °C en 5% de CO₂ en un ambiente humidificado. Aspire suavemente el medio y enjuague las células una vez con 1x PBS.
      7. Repita el paso de enjuague 1x PBS para evitar el fondo causado por el medio de cultivo celular o los compuestos de tratamiento, e invierta el cubreobjetos en un portaobjetos de microscopio etiquetado con las condiciones de tratamiento.
      8. Imagine que las células viven a E_x/E_m = 549 nm/575 nm. Usando un microscopio confocal, recoja varios campos de pila z con captura de imágenes de alta velocidad (512 píxeles x 512 píxeles, promedio = 4) antes de la pérdida de la integridad celular.
      9. Guarde y almacene el archivo de imagen para su análisis. El procedimiento se repite para la siguiente condición experimental.
   2. Controles experimentales
      1. Utilizar un testigo sin tratamiento (negativo), realizado como se ha indicado anteriormente (pasos 3.1.1-3.1.8), sin el compuesto problema en el medio.
      2. Utilice un control de disrupción del potencial de membrana mitocondrial (positivo) que consiste en el compuesto protonóforo FCCP. Agregue 1,8 mL de 20 μM de FCCP (ver la Tabla de Materiales) en medio a las células. Como se ha descrito anteriormente (pasos 3.1.1-3.1.2; y la obtención de imágenes celulares, como se indica en los pasos 3.1.3-3.1.8), incubar durante 10 min a 37 °C con CO₂ al 5 % en un ambiente humidificado antes de teñir con TMRE.
         NOTA: Se requieren controles positivos y negativos para estos experimentos.
   3. Cuantificación
      1. Mida las intensidades de píxeles capturadas de celdas individuales a partir de una única imagen representativa de la región central de cada pila z. En este trabajo, se seleccionó un único plano de enfoque para facilitar el análisis.
      2. Analice las intensidades de píxeles de al menos 30 celdas (en su totalidad) por tratamiento. Utilice Excel o Prism para promediar las intensidades de píxeles para cada tratamiento, y presente en formato de gráfico de barras con el error estándar de la media.
         NOTA: ImageJ también se puede utilizar para la cuantificación de fluorescencia. Alternativamente, la fluorescencia de tinción de TMRE se puede cuantificar con plataformas de software comerciales.

3. Establecimiento de la función del canal iónico mediante electrofisiología

NOTA: El procedimiento de esta sección describe el uso de un ensayo electrofisiológico automatizado para detectar compuestos de prueba en una línea celular cancerosa (Figura 3).

1. Preparación de las células
   1. Recolectar células de un cultivo sano que carezca de células muertas y/o sobrecrecimiento celular. Utilice la solución química de desprendimiento de células TrypLE o un raspador celular manual para recolectar células adherentes y agrupadas. Disociar las células que crecen en grupos o esferas, que son particularmente comunes entre las células cancerosas del SNC.
      NOTA: La disociación suave de las células ayuda a mantener la integridad de las proteínas de membrana esenciales para la conductancia iónica.
   2. Centrifugar las células a 561 x g durante 10 min a RT. Deseche el sobrenadante y suspenda el gránulo en DMEM (sin rojo de fenol), HEPES y penicilina/estreptomicina con 20% de FBS y 4 mM de L-glutamina (ver la Tabla de Materiales) mantenido a 37 °C.
      NOTA: Se utiliza un medio DMEM que carece de rojo de fenol porque la exposición al rojo de fenol inhibe la permeabilidad de la membrana.
   3. Coloque las células en un cubreobjetos recubierto de poli-L-lisina a baja densidad, de modo que haya separación entre las células individuales.
      NOTA: Aquí se usa poli-L-lisina, y no poli-D-lisina, ya que la poli-L-lisina tiene mejores propiedades de recubrimiento.
   4. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO₂ en una cámara humidificada durante 12 h a 24 h (será necesario establecer un momento óptimo) antes de realizar un registro.
2. Registro electrofisiológico
   1. Retire el medio de los cubreobjetos. Lave suavemente las células dos veces con 1x PBS. Agregue ~ 300 μL de solución de TrypLE. Con la pipeta, pipetee suavemente hacia arriba o hacia abajo cuatro o cinco veces hasta que las células se desprendan.
   2. Agregue medio libre de suero (DMEM) (sin rojo de fenol) y mantenga un recuento final de células por volumen de al menos 1 millón de células/ml. Con una pipeta de 1 ml, despeje las células para obtener una suspensión celular que carezca de grupos celulares.
   3. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 1 ml. Incubar las células a 4 °C durante 10 min para estabilizar la membrana celular. Mantenga las células girando en un agitador (ciclo suave) para evitar la formación de grumos celulares.
   4. Prepare la configuración de Port-a-Patch (consulte la Tabla de materiales). Encienda la computadora, el amplificador y el sistema de perfusión. Abra el software Patch-Master y cree un nuevo archivo.
   5. Lleve los tampones (extracelulares e internos) a RT y, a continuación, cargue los tampones en los tubos de perfusión respectivos.
      NOTA: Los registros del receptor GABA_A requieren tanto una "solución extracelular (baño)" que contenga 161 mM de NaCl, 3 mM de KCl, 1 mM de MgCl 2, 1,5 mM de CaCl 2, 10 mM de HEPES y 6 mM de D-glucosa (pH ajustado a 7,4 usando NaOH) y una "solución interna" que contenga 120 mM de KCl, 2 mM de MgCl ₂, 10 mM de EGTA, y 10 mM HEPES (pH ajustado a 7,2 utilizando NaOH).
   6. Llene la parte inferior de un chip de electrodo (proporcionado por el fabricante) con 5 μL de solución interna y coloque el chip de electrodo en la parte superior de Faraday del Port-a-Patch. Agregue 10 μL de solución externa al chip y observe el pulso rectangular en el osciloscopio usando el software Patch-Master (consulte la Tabla de materiales).
      NOTA: La resistencia puede estar en el rango de 2-3 MΩ, pero esto depende de la línea celular.
   7. Comience a grabar una vez que el pulso rectangular sea visible, después de los ajustes electrónicos iniciales y después de que el software solicite al usuario que agregue celdas.
   8. Agregue suavemente 20 μL de suspensión de una sola celda en la parte central del electrodo y espere el parche de la celda seguido de un sello de Giga-Ohm observando los valores de resistencia en el software.
   9. El progreso en vivo de la aplicación de parches celulares se puede observar en la columna izquierda del software. Una vez que la celda se "mantiene en modo de celda completa", comience las grabaciones abriendo un protocolo dentro del software.
   10. Ajuste el potencial de retención a -80 mV. Ejecute un protocolo de grabación continua sin interrupciones utilizando el software Patch-Master para registrar la corriente de la celda.
   11. Obtenga una línea de base estable y cambie a un ligando y a la aplicación del compuesto respectivo durante un período específico utilizando la pestaña de perfusión automatizada en el panel izquierdo del software.
   12. Adquiera datos utilizando el software Patch-Master.
       NOTA: Los datos se filtran de paso bajo a 1 kHz y se digitalizan a 100 kHz.
   13. Realice análisis de datos calculando la amplitud máxima de la respuesta actual utilizando el software Nest-o-Patch (consulte la Tabla de materiales).

4. Potencia in vitro

NOTA: Este procedimiento detalla un ensayo MTS para determinar la potencia del fármaco. El ensayo de proliferación celular de una solución combina todos los reactivos de ensayo necesarios en una solución preparada que se puede agregar en un solo paso a los pocillos de cultivo celular para evaluar la viabilidad y proliferación celular después del tratamiento con compuestos experimentales. El reactivo se reconstituye según las recomendaciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales), se alícuota y se almacena a -20 °C. En la sección se describe el uso del ensayo para determinar el IC₅₀ de los compuestos de ensayo en una línea celular concreta (Figura 4). Este reactivo MTS también se puede utilizar para el cribado de alto rendimiento de un gran número de compuestos en concentraciones conocidas.

1. Preparación de las células
   NOTA: El número de células depende del crecimiento y metabolismo de cada línea celular individual. Determinar experimentalmente el número óptimo de células antes de utilizar el ensayo para evaluar cualquier tratamiento en investigación.
   1. Recolectar células adherentes del cultivo por tripsinización y usar Accutase (ver la Tabla de Materiales) para disociar las células que crecen en grupos o esferas.
      NOTA: Las líneas celulares de glioblastoma y meduloblastoma primario a menudo requieren Accutase, ya que tienden a crecer en grupos o esferas.
   2. Cuente las células y haga una solución celular con 10.000 células por pocillo en un volumen de 75 μL. Realice diluciones del stock para los números de celda que se van a probar. Preparar al menos 1 ml por dilución.
   3. Coloque 75 μL de cada dilución en conjuntos de cinco pocillos consecutivos en una placa de 96 pocillos. Incubar a 37 °C y 5% de_CO2 durante la noche en un ambiente humidificado (es decir, una incubadora).
      NOTA: Las líneas celulares con crecimiento o metabolismo lento (que acidifican su medio de crecimiento en más de 3 días) pueden requerir más de 10,000 células como el rango superior de número de células, mientras que las líneas celulares que crecen rápidamente (generalmente más rápido que 20 horas de tiempo de duplicación) requieren menos células. Las líneas celulares con un metabolismo alto pueden requerir menos de 1.000 células por pocillo. El rango de celdas se puede ajustar para determinar la densidad óptima de siembra para el ensayo MTS para estas líneas celulares.
2. Control de tratamiento simulado
   1. Añadir 25 μL de medio por pocillo para simular la adición del compuesto de ensayo en el ensayo MTS.
      NOTA: En el ensayo MTS propiamente dicho, se añadirán a las células 25 μL de una cepa 4x de la concentración de tratamiento elegida para el compuesto de ensayo (en este caso, un modulador del receptor GABA_A , QH-II-066) para obtener la concentración de tratamiento final 1x en un volumen total de 100 μL por pocillo.
   2. Incubar a 37 °C y 5 % de_CO2 en un ambiente humidificado durante 48 h. Esto simula la incubación estándar en presencia de un fármaco.
3. Ensayo MTS
   1. Descongele las alícuotas requeridas del reactivo MTS. Añadir 20 μL de reactivo MTS por pocillo. Incubar a 37 °C y 5 % de_CO2 en un ambiente humidificado durante 1 h.
   2. Centrifugar la placa (1.350 x g durante 5 min) a temperatura ambiente para eliminar las burbujas que pueden interferir con la lectura de absorbancia.
      NOTA: Retire las burbujas con una aguja de calibre fino.
   3. Lea la absorbancia a 490 nm. Guarde los datos como un archivo de Excel.
   4. Vuelva a colocar las placas a 37 °C en CO₂ al 5 % y léalas repetidamente dentro del período de rango lineal de 4 h del ensayo.
      NOTA: No es necesario volver a centrifugar antes de leer la absorbancia. Los datos de lecturas posteriores, especialmente la lectura de 2 h, pueden ser importantes para examinar la rapidez con la que una línea celular metaboliza el reactivo MTS y son útiles para seleccionar el número de células en la placa para el ensayo.
   5. Grafique la densidad óptica de absorbancia (OD) a 490 nm (OD₄₉₀) frente al número de celda plateada utilizando Excel o Prism.
   6. Seleccione el número de celda para el ensayo. El número óptimo de celdas estará en el rango lineal y por debajo de la saturación (OD₄₉₀ = 1).
      NOTA: Para células con crecimiento lento, el número de células más alto sembrado se puede ajustar a 20.000 células por pocillo, y 500 células por pocillo se pueden dejar fuera del ensayo.
4. Determinación del CI₅₀
   1. Día 1: Placa de las células para el ensayo MTS
      1. Registre el nombre de la línea celular y el número de paso de cada línea en el estudio. Para contrarrestar la evaporación durante el ensayo, como mínimo, llene las filas superior e inferior del perímetro exterior y las columnas perimetrales izquierda y derecha de los extremos de la placa de 96 pocillos con 1x PBS, 100 μL por pocillo, para contrarrestar la evaporación durante el ensayo.
      2. Coloque el número óptimo de células para cada línea celular según lo determinado antes del inicio del ensayo. Coloque las células en 75 μL por pocillo de medio libre de rojo de fenol y antibiótico que no contenga tampón HEPES. El FBS se puede aumentar al 20% para apoyar el crecimiento de las líneas celulares.
         NOTA: Se utiliza un medio que carezca de rojo de fenol porque la exposición al rojo de fenol inhibe la permeabilidad de la membrana.
      3. Coloque la muestra en al menos un quíntuple para la concentración del tratamiento. Cuente las células con un hemocitómetro manual o automatizado.
         NOTA: Para usar un hemocitómetro manual, (1) prepare una dilución 1:1 de células resuspendidas en medio en azul de tripán; (2) incubar de 5 a 15 minutos, dependiendo de la línea celular; (3) cargue 10 μL de las células en azul de tripano en la cámara de recuento del hemocitómetro; (4) contar las células viables en las cuatro esquinas y los cuadrados centrales, y determinar el número promedio de células por cuadrado; (5) Calcule las células viables por mililitro de la siguiente manera:
         Células viables por ml = Promedio de células viables × 2 (factor de dilución) × 10⁴
      4. Utilice un volumen suficiente para preparar la concentración deseada de células en un medio libre de rojo de fenol y antibiótico que no contenga tampón HEPES (es decir, 75 μL por pocillo x 60 pocillos por placa = 4,5 ml de células por placa).
         NOTA: Cada placa debe tener un control de solo medio para la resta de fondo. El control del medio puede reemplazar los pocillos PBS si es necesario.
   2. Día 2: Adición del compuesto de tratamiento
      1. Preparar los tratamientos de los experimentos a 4 veces la concentración final deseada para dar la concentración final deseada cuando se añaden 25 μL de soluciones de tratamiento a las células sembradas en 75 μL de medio (= 100 μL de volumen total por pocillo).
      2. Preparar las soluciones de ensayo (en este caso, el modulador del receptor GABA_A QH-II-066) mediante dilución en serie de las cepas de mayor concentración. Por ejemplo, si las concentraciones finales del fármaco van a ser de 5,0 μM, 2,5 μM, 1,25 μM, 0,625 μM y 0,3125 μM, prepare diluciones seriadas 1:1 que comiencen con 20 μM para obtener concentraciones de 10 μM, 5 μM, 2,5 μM y 1,25 μM, respectivamente.
         NOTA: Cada placa requiere dos controles basados en células, además del control de solo medio: células no tratadas (medio solo) y células tratadas con disolvente (a menudo DMSO) a una concentración conocida. Es una buena práctica asegurarse de que el vehículo no afecte a la proliferación celular en el rango activo del compuesto.
      3. Una vez añadido el compuesto problema, incubar las células a 37 °C y 5 % de_CO2 en un ambiente humidificado durante 48 h.
   3. Día 3: Realización del ensayo de proliferación celular (MTS)
      1. Calcule el volumen de reactivo MTS necesario (20 μL por cada 100 μL de cultivo de prueba) y descongele el volumen requerido de reactivo MTS alícuota (consulte la Tabla de materiales).
      2. Vortex, y asegúrese de que el reactivo esté completamente en solución antes de su uso. Pipetear el reactivo descongelado en un depósito de reactivo estéril de 25 ml.
      3. Pipetear 20 μL de reactivo MTS (utilizando una pipeta multicanal) en cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene muestras en 100 μL de medio de cultivo.
      4. Incubar la placa a 37 °C y 5% de CO₂ en un ambiente humidificado durante 1 h a 4 h. Las placas se pueden leer en varios puntos de tiempo. Generalmente, las placas se leen a la 1 h y a las 2 h o 3 h.
      5. Las burbujas en el medio pueden dar lugar a resultados erróneos. Antes de leer en el lector de placas, gire la placa a 1.350 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se puede utilizar una aguja o una punta de pipeta para eliminar las burbujas que quedan después de la centrifugación.
      6. Mida la absorbancia a 490 nm utilizando un lector de microplacas o espectrofotómetro adecuado (consulte la Tabla de materiales).
      7. Guarde los datos como un archivo de Excel.
         NOTA: El tiempo de incubación en presencia del compuesto de prueba variará en función de la tasa de metabolismo y del crecimiento de la línea celular en estudio, además del compuesto que se esté probando. Un período de incubación de 48 h es un buen punto de partida para la mayoría de las líneas celulares y compuestos de prueba.
5. Análisis de datos
   1. Transfiera los datos en un archivo de Excel y organice los datos de cada réplica aumentando la concentración del compuesto de prueba. Promedie el valor de control de solo medio y reste este valor de los datos experimentales.
   2. Determine el porcentaje de proliferación celular en los pocillos de tratamiento en comparación con los pocillos de vehículo (o pocillos de control tratados con solvente) estableciendo el control en 100% de proliferación para cada réplica.
   3. Transfiera los datos generados en Excel a un programa de su elección. Por lo general, los autores utilizan el software Prism (ver la Tabla de Materiales) para determinar la concentración del fármaco que inhibe la proliferación celular en un 50% (IC₅₀).
   4. En el software Prism, cree una tabla de datos con la columna X como números de celda y la columna Y como el OD promedio para cinco valores replicados en subcolumnas una al lado de la otra.
   5. Introduzca los valores de concentración del tratamiento en la columna X al analizar un tratamiento farmacológico. Etiquete el eje x con el nombre del compuesto de tratamiento y las unidades de concentración.
   6. Introduzca los valores de viabilidad de celda replicada calculados del análisis de Excel en las subcolumnas Y. Etiquete el eje Y como proliferación celular (%).
   7. Con la herramienta de análisis, seleccione Regresión no lineal (ajuste de curva) en Análisis XY.
   8. Seleccione dosis-respuesta [inhibición] frente a respuesta normalizada-pendiente variable.
   9. Realice la función de análisis. Consulte la tabla de resultados para ver los valores de mejor ajuste calculados para IC₅₀ y el gráfico de ajuste de curva. El eje x del gráfico se puede cambiar a una escala logarítmica si se desea.

Arriba se presentan procedimientos seleccionados que se pueden emplear para caracterizar los canales iónicos en las células cancerosas. El primer protocolo destaca la tinción de un canal iónico. Como se ha detallado, existen muchos retos a la hora de teñir un canal iónico o, para el caso, cualquier proteína que esté presente en la membrana extracelular. En la Figura 1 se muestra la tinción de una subunidad del receptor pentámero GABAA. El segundo protocolo destaca los resultados de probar el estado polarizado de las mitocondrias en células cancerosas. Las mitocondrias desempeñan funciones esenciales para la viabilidad y proliferación celular, así como para la muerte celular. En las células de mamíferos, las mitocondrias activan la apoptosis en respuesta al estrés celular a través de la liberación de las proteínas de la familia Bcl-2 que se encuentran entre las membranas interna y externa mitocondrial. En el citosol, las proteínas de la familia Bcl-2 activan las caspasas proteasas, que median la muerte celular programada. Las alteraciones en la función del canal iónico de la membrana plasmática pueden dar lugar a una alteración de la homeostasis iónica intracelular, incluso en términos de los niveles de iones dentro de las mitocondrias, lo que puede conducir a una pérdida de potencial de membrana, desencadenando así la apoptosis14. Los niveles de Ca2+, K+, Na+ y H+ son determinantes importantes en los eventos de señalización que pueden desencadenar la muerte celular iniciada por la mitocondria. En la Figura 2 se muestra la tinción con el colorante permeable a las células y cargado positivamente TMRE para marcar e obtener imágenes del potencial de membrana en mitocondrias activas, que mantienen una carga negativa21,22. TMRE es un colorante rojo-anaranjado que se une a las mitocondrias activas debido a su carga negativa relativa. Las mitocondrias despolarizadas o inactivas tienen un potencial de membrana reducido y, por lo tanto, no logran secuestrar TMRE. En este experimento, el desacoplador ionóforo FCCP es un control importante, ya que despolariza las membranas mitocondriales, evitando así la acumulación de TMRE23. El tercer protocolo destaca la electrofisiología de patch-clamp de una sola célula. En la Figura 3 se muestran registros representativos de un rastro registrado de la línea celular D283 de meduloblastoma derivada del paciente. Por último, el cuarto protocolo destaca un ensayo para determinar el estado de proliferación de las células cancerosas. En la Figura 4 se muestran detalles sobre cómo funciona el ensayo MTS y una ilustración de la placa y la lectura cuando se incuba con un agente que perjudica la viabilidad de las células cancerosas en estudio (en este caso, DAOY).

Figura 1: Tinción de células para canales iónicos. (A) Tinción de la proteína Gabra5, una subunidad del receptor GABAA, en células cancerosas de meduloblastoma D283. (B) Células fijas tratadas con la tinción fluorescente 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), que se une al ADN. (C) Fusión de células cancerosas de meduloblastoma teñidas tanto para Gabra5 como para DAPI. Barras de escala = 10 μm. La figura es una adaptación de Kallay et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Prueba del estado polarizado de las mitocondrias . (A) Las células cancerosas vivas de meduloblastoma D283 se tratan con concentraciones crecientes del fármaco QH-II-066. A continuación, las células se tratan con TMRE (tetrametilrodamina, éster etílico) cargado positivamente y permeable a las células, que se acumula en las mitocondrias activas (cargadas negativamente). Las mitocondrias despolarizadas o inactivas tienen un potencial de membrana reducido y, por lo tanto, no logran retener el colorante TMRE; Como resultado, muestran una señal de fluorescencia baja. Obtención de imágenes por microscopía de fluorescencia; FCCP (cianuro de carbonilo 4-[trifluorometoxi] fenilhidrazona). Pico: λex, 549 nm; λem, 575 nm. Barras de escala = 10 μm. (B) Cuantificación de la tinción de TMRE (imágenes mostradas en el panel A) utilizando la plataforma de software. Los datos se presentan como la media y el error estándar de la media. La figura es una adaptación de Kallay et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Establecimiento de la función del canal iónico mediante electrofisiología. (A) Se muestra una configuración o equipo Port-a-Patch, que consta de una jaula de Faraday (a), una cámara de registro (b) y una unidad de succión (c, derecha). (B) Vista superior del equipo Port-a-Patch destacando la cámara de registro equipada con una entrada de perfusión (a), una salida (b) y un electrodo de referencia (c). (C) El Port-a-Patch está conectado a un sistema de perfusión de intercambio rápido de soluciones con modos de operación automatizados y manuales y depósitos de solución. (D) Traza de corriente representativa de un registro electrofisiológico de pinza de parche de célula completa utilizando una plataforma Port-a-Patch (Nanion) y células cancerosas de meduloblastoma D283. Se aplicó GABA (10 μM) durante 5 s con un potencial de retención de −80 mV. (E) Traza de corriente representativa de un registro electrofisiológico de pinza de parche de célula completa utilizando una plataforma Port-a-Patch (Nanion) y células cancerosas de meduloblastoma D283 con la aplicación conjunta de GABA (1 μM) y el agonista del receptor GABAA (anestésico general) propofol (50 μM), que potencia la corriente inducida por GABA solo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Ensayo MTS para evaluar la potencia del fármaco. (A) Reacciones químicas subyacentes al "ensayo MTS" utilizado para evaluar la potencia de un agente, reflejado por una reducción en la proliferación celular. Reducción de tetrazolio MTS por células que son viables, generando el colorante formazan. (B) Una placa de 96 pocillos que muestra los resultados colorimétricos de un ensayo MTS con concentraciones crecientes del fármaco. En este experimento, las células cancerosas de meduloblastoma DAOY se tratan con concentraciones crecientes de un fármaco preclínico, KRM-II-08, un modulador alostérico positivo del receptor GABAA . (C) Una curva dosis-respuesta generada con el ensayo MTS (a partir de la cuantificación de la placa de 96 pocillos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Comparación de configuraciones de electrofisiología manuales versus semiautomáticas y/o totalmente automatizadas.

D.A.P.K. es cofundador, presidente y director ejecutivo de Amlal Pharmaceuticals Inc. S.S. es cofundador de Amlal Pharmaceuticals Inc. y forma parte de la Junta de Supervisión de la Seguridad de los Medicamentos de Bexion Pharmaceuticals, Inc.