Artículo de método

Un método mejorado para aislar los sitios de contacto mitocondrial

DOI:

10.3791/65444

⸱

16 de junio de 2023

 ,  , 
1Department of Cell Biology, Biomedical Center, Medical Faculty, Ludwig-Maximilians University Munich, 2Cardio-Metabolic Diseases, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los sitios de contacto mitocondrial son complejos proteicos que interactúan con las proteínas de la membrana interna y externa mitocondrial. Estos sitios son esenciales para la comunicación entre las membranas mitocondriales y, por lo tanto, entre el citosol y la matriz mitocondrial. Aquí, describimos un método para identificar candidatos que califican para esta clase específica de proteínas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las mitocondrias están presentes en prácticamente todas las células eucariotas y realizan funciones esenciales que van mucho más allá de la producción de energía, por ejemplo, la síntesis de grupos de hierro-azufre, lípidos o proteínas, la amortiguación de Ca2+ y la inducción de la apoptosis. Del mismo modo, la disfunción mitocondrial da lugar a enfermedades humanas graves como el cáncer, la diabetes y la neurodegeneración. Para realizar estas funciones, las mitocondrias tienen que comunicarse con el resto de la célula a través de su envoltura, que consta de dos membranas. Por lo tanto, estas dos membranas tienen que interactuar constantemente. Los sitios de contacto proteico entre las membranas interna y externa mitocondrial son esenciales a este respecto. Hasta el momento, se han identificado varios sitios de contacto. En el método descrito aquí, las mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae se utilizan para aislar los sitios de contacto y, por lo tanto, identificar candidatos que califican para proteínas del sitio de contacto. Utilizamos este método para identificar el complejo del sitio de contacto mitocondrial y el sistema organizador de crestas (MICOS), uno de los principales complejos formadores de sitios de contacto en la membrana interna mitocondrial, que se conserva de la levadura a los humanos. Recientemente, mejoramos aún más este método para identificar un nuevo sitio de contacto que consiste en Cqd1 y el complejo Por1-Om14.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las mitocondrias realizan una variedad de funciones diferentes en los eucariotas, siendo la más conocida la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa. Otras funciones incluyen la producción de grupos de hierro-azufre, la síntesis de lípidos y, en eucariotas superiores, la señalización de Ca2+ y la inducción de la apoptosis 1,2,3,4. Estas funciones están inseparablemente ligadas a su compleja ultraestructura.

La ultraestructura mitocondrial fue descrita por primera vez por microscopía electrónica5. Se demostró que las mitocondrias son orgánulos bastante complejos que constan de dos membranas: la membrana externa mitocondrial y la membrana interna mitocondrial. Así, estas membranas forman dos compartimentos acuosos: el espacio intermembrana y la matriz. La membrana interna mitocondrial se puede dividir aún más en diferentes secciones. La membrana límite interna permanece muy cerca de la membrana externa, y las crestas forman invaginaciones. Las llamadas uniones crista conectan la membrana límite interna y las crestas (Figura 1). Además, las micrografías electrónicas de mitocondrias osmóticamente encogidas revelan que existen sitios en los que las membranas mitocondriales están estrechamente conectadas 6,7. Estos llamados sitios de contacto están formados por complejos proteicos que abarcan las dos membranas (Figura 1). Se cree que estos sitios de interacción son esenciales para la viabilidad celular debido a su importancia para la regulación de la dinámica mitocondrial y la herencia, así como para la transferencia de metabolitos y señales entre el citosol y la matriz8.

El complejo MICOS en la membrana interna mitocondrial es probablemente el complejo formador de sitios de contacto mejor caracterizado y más versátil. MICOS fue descrito en levaduras en 2011, y consta de seis subunidades 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 y Mic10. Estos forman un complejo de aproximadamente 1,5 MDa que se localiza en las unionescrista 9,10,11. La deleción de cualquiera de las subunidades centrales, Mic10 o Mic60, conduce a la ausencia de este complejo 9,11, lo que significa que estas dos subunidades son esenciales para la estabilidad de MICOS. Curiosamente, MICOS forma no solo uno, sino múltiples sitios de contacto con varias proteínas y complejos de la membrana externa mitocondrial: el complejo TOM 11,12, el complejo TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, el complejo Fzo1-Ugo19,Por1 10, OM45 10 y Miro 17. Esto indica fuertemente que el complejo MICOS está involucrado en varios procesos mitocondriales, como la importación de proteínas, el metabolismo de los fosfolípidos y la generación de la ultraestructura mitocondrial18. Esta última función es probablemente la principal función de MICOS, ya que la ausencia del complejo MICOS inducida a través de la deleción de MIC10 o MIC60 conduce a una ultraestructura mitocondrial anormal que carece prácticamente por completo de crestas regulares. En cambio, las vesículas de membrana interna sin conexión con la membrana límite interna acumulan19, 20. Es importante destacar que MICOS se conserva en forma y función desde la levadura hasta el ser humano21. La asociación de mutaciones en subunidades MICOS con enfermedades humanas graves también enfatiza su importancia para los eucariotas superiores22,23. Aunque MICOS es muy versátil, deben existir sitios de contacto adicionales (según nuestras observaciones no publicadas). De hecho, se han identificado varios otros sitios de contacto, por ejemplo, las maquinarias de fusión mitocondrial Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 o Mdm31-Por1, que está involucrada en la biosíntesis del fosfolípido mitocondrial específico cardiolipina 27. Recientemente, mejoramos el método que nos llevó a la identificación de MICOS para identificar Cqd1 como parte de un nuevo sitio de contacto formado con el complejo de membrana externa Por1-Om1428. Curiosamente, este sitio de contacto también parece estar involucrado en múltiples procesos, como la homeostasis de la membrana mitocondrial, el metabolismo de los fosfolípidos y la distribución de la coenzima Q28,29.

En este caso, se utilizó una variación del fraccionamiento de mitocondrias descrito anteriormente 9,30,31,32,33. El tratamiento osmótico de las mitocondrias conduce a la ruptura de la membrana externa mitocondrial y a una contracción del espacio de la matriz, dejando las dos membranas solo muy cerca en los sitios de contacto. Esto permite la generación de vesículas que consisten exclusivamente en la membrana externa mitocondrial o en la membrana interna mitocondrial o en los sitios de contacto de ambas membranas a través de una sonicación suave. Debido a que la membrana interna mitocondrial posee una proporción proteína-lípidos mucho más alta, las vesículas de la membrana interna mitocondrial exhiben una mayor densidad en comparación con las vesículas de la membrana externa mitocondrial. La diferencia de densidad se puede utilizar para separar las vesículas de membrana a través de la centrifugación en gradiente de densidad de flotación de sacarosa. Por lo tanto, las vesículas de la membrana externa mitocondrial se acumulan a bajas concentraciones de sacarosa, mientras que las vesículas de la membrana interna mitocondrial se enriquecen a altas concentraciones de sacarosa. Las vesículas que contienen los sitios de contacto se concentran en concentraciones intermedias de sacarosa (Figura 2). El siguiente protocolo describe en detalle este método mejorado, que requiere menos equipo especializado, tiempo y energía en comparación con el establecido anteriormente32, y proporciona una herramienta útil para la identificación de posibles proteínas en el sitio de contacto.

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Protocolo

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1. Tampones y soluciones madre

  1. Prepare una solución de ácido 3-morfolinopropano-1-sulfónico (MOPS) 1 M en agua desionizada, pH 7,4. Conservar a 4 °C.
  2. Preparar 500 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en agua desionizada, pH 8,0. Almacenar a temperatura ambiente.
  3. Preparar sorbitol 2,4 M en agua desionizada. Almacenar a temperatura ambiente después de esterilizarlo en autoclave.
  4. Preparar 2,5 M de sacarosa en agua desionizada. Almacenar a temperatura ambiente después de esterilizarlo en autoclave.
  5. Prepare 200 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) en isopropanol. Conservar a -20 °C.
    PRECAUCIÓN: El PMSF es tóxico si se ingiere y causa quemaduras graves en la piel y daños oculares. No respire el polvo y use guantes y gafas protectoras.
  6. Preparar ácido tricloroacético (TCA) al 72% en agua desionizada. Conservar a 4 °C.
    PRECAUCIÓN: El TCA puede causar irritación respiratoria, quemaduras graves en la piel y daño ocular. No respire el polvo y use guantes y gafas protectoras.
  7. Preparar el tampón SM: 20 mM MOPS y 0,6 M de sorbitol, pH 7,4.
  8. Prepare el tampón de hinchamiento: 20 mM de MOPS, 0,5 mM de EDTA, 1 mM de PMSF y cóctel de inhibidores de la proteasa, pH 7,4.
  9. Prepare los tampones de gradiente de sacarosa: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M y 1,3 M de sacarosa en 20 mM de MOPS y 0,5 mM de EDTA, pH 7,4.
    NOTA: Todos los tampones se pueden almacenar a 4 °C; sin embargo, se recomienda almacenar los tampones que contienen sacarosa a -20 °C para evitar el crecimiento de hongos. Los inhibidores de la proteasa deben añadirse de nuevo antes de su uso.

2. Generación de vesículas submitocondriales

  1. Aislar las mitocondrias crudas de levadura frescas de acuerdo con los protocolos establecidos34,35.
    NOTA: Para este experimento, se aislaron mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae. No es necesaria la generación de mitocondrias puras en gradiente desprovistas de otros orgánulos.
  2. Resuspender 10 mg de mitocondrias recién aisladas en 1,6 ml de tampón SM (4 °C) mediante pipeteo (Figura 2, paso 1).
  3. Transfiera la suspensión mitocondrial a un matraz Erlenmeyer de 100 ml preenfriado.
  4. Agregue lentamente 16 ml de tampón de hinchazón con una pipeta de vidrio de 20 ml. Aplique una agitación suave constante sobre hielo durante la adición. Este tratamiento osmótico da como resultado la absorción de agua en el espacio de la matriz. La hinchazón de la membrana interna mitocondrial alterará la membrana externa. Sin embargo, ambas membranas permanecerán en contacto en los sitios de contacto9 (Figura 2, paso 2).
  5. Incubar las muestras bajo agitación suave constante durante 30 minutos en hielo.
  6. Agregue lentamente 5 ml de solución de sacarosa 2,5 M con una pipeta de vidrio de 5 ml para aumentar la concentración de sacarosa en las muestras a aproximadamente 0,55 M. Este tratamiento osmótico da como resultado un flujo de agua de la matriz36. La contracción de la membrana interna tiene como objetivo maximizar su distancia a los fragmentos residuales de la membrana externa. Esto disminuye la probabilidad de generar vesículas híbridas artificiales de membranas internas y externas a través de la sonicación (Figura 2, paso 3).
  7. Incubar las muestras bajo una agitación suave durante 15 minutos en hielo.
  8. Sométase las mitocondrias a sonicación para generar vesículas de membrana submitocondrial (Figura 2, paso 4).
    1. Transfiera la suspensión mitocondrial a una celda roseta preenfriada.
    2. Sonicar la suspensión mitocondrial a una amplitud del 10% durante 30 s mientras se enfría la célula roseta en un baño de hielo.
    3. Deje reposar la suspensión durante 30 s en un baño de hielo.
    4. Repita los pasos 2.8.2 y 2.8.3 tres veces más.
      NOTA: Las condiciones de sonicación variarán según el sonicador utilizado. La optimización será necesaria para máquinas individuales. La sonicación demasiado dura conducirá a la formación artificial de vesículas formadas por membranas internas y externas mitocondriales.

3. Separación de vesículas submitocondriales

  1. Separar las vesículas generadas de las mitocondrias intactas restantes mediante centrifugación a 20.000 x g durante 20 min a 4 °C. Las mitocondrias intactas se granularán mientras que las vesículas permanecerán en el sobrenadante.
  2. Concentra la mezcla de vesículas.
    1. Transfiera el sobrenadante a tubos de ultracentrifugación nuevos.
    2. Cargue una almohadilla de 0,3 ml de solución de sacarosa 2,5 M en el fondo del tubo utilizando una jeringa de 1 ml equipada con una cánula de 0,8 mm x 120 mm.
    3. Centrifugar a 118.000 x g durante 100 min a 4 °C.
      NOTA: En este caso, se utilizó un rotor de cangilón basculante con un radio máximo de 153,1 mm. Las condiciones de centrifugación dependen en gran medida del rotor y tendrán que adaptarse cuando se utilice otro rotor.
  3. Las vesículas aparecerán como un disco en la parte superior de la almohadilla de sacarosa después de la centrifugación. Deseche aproximadamente el 90% del sobrenadante. Ahora, recoja las vesículas concentradas resuspendiéndolas en el tampón restante, incluida la sacarosa de 2,5 M, pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la suspensión a un homogeneizador Dounce helado.
  4. Homogeneizar la suspensión con al menos 10 pasadas utilizando un alfarero de politetrafluoroetileno.
  5. Prepara el degradado de sacarosa.
    1. Para un gradiente escalonado de 11 mL con cinco pasos (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M y 0,8 M de sacarosa en 20 mM de MOPS y 0,5 mM de EDTA, pH 7,4), cada capa tiene 2,2 mL de solución de sacarosa.
      NOTA: Se recomienda un refractómetro para medir y ajustar las concentraciones de sacarosa; sin embargo, no es esencial. Aplique 10 μL del tampón al refractómetro y detecte los respectivos índices de refracción. El cálculo de la concentración de sacarosa es el siguiente:
      Ecuación de concentración de sacarosa en molaridad; Diagrama para el análisis de medición del índice de refracción.
      1.3333 representa el índice de refracción del agua. 0,048403 es un índice de conversión específico de sacarosa obtenido a partir del escalado lineal de la refractividad molar a la concentración de sacarosa en soluciones acuosas 37.
    2. Agregue la concentración más alta de sacarosa al tubo de centrifugación y coloque el tubo a -20 °C. Espere hasta que la capa esté completamente congelada antes de aplicar la siguiente. Proceda en consecuencia hasta que se agregue la última capa y almacene los degradados a -20 °C.
      NOTA: Recuerde transferir los gradientes congelados a 4 °C al iniciar el experimento para permitir que los gradientes se descongelen. Esto tomará aproximadamente 3 h. Para la centrifugación se utilizó un rotor de cangilón basculante con una capacidad de 13,2 ml. Cuando se utiliza un rotor diferente, los volúmenes de paso de gradiente deben adaptarse en consecuencia.
  6. Mida la concentración de sacarosa de las muestras con un refractómetro. Si no hay acceso a un refractómetro, se podría suponer alternativamente que la concentración de sacarosa es de 2 M. Esta supuesta concentración de sacarosa será la base para el siguiente paso.
  7. Ajuste la concentración de sacarosa a 0,6 M mediante la adición de una cantidad adecuada de 20 mM de MOPS, 0,5 mM de EDTA, 1 mM de PMSF y cóctel de inhibidores de proteasa, pH 7,4. Si la concentración de sacarosa se estima en 2 M en lugar de medirse, se recomienda probar si la concentración es lo suficientemente baja después del ajuste. Aplique una pequeña alícuota de la muestra (aprox. 50 μL) sobre 200 μL de sacarosa 0,8 M en un tubo de ensayo. La muestra debe permanecer encima de la sacarosa 0,8 M.
  8. Cargue las muestras (aproximadamente 1 ml) en la parte superior del gradiente de sacarosa (guarde el 10% para referencia posterior). Es importante un pipeteo cuidadoso para evitar la alteración del gradiente (Figura 2, paso 5).
  9. Separar las vesículas por centrifugación a 200.000 x g y 4 °C durante 12 h. Si es posible, ajuste la centrífuga a aceleración y desaceleración lentas para evitar la perturbación del gradiente (Figura 2, paso 6).
    NOTA: En este caso, se utilizó un rotor de cangilón basculante con un radio máximo de 153,1 mm. Las condiciones de centrifugación dependen en gran medida del rotor y tendrán que adaptarse cuando se utilice otro rotor.
  10. Coseche el gradiente de arriba a abajo en fracciones de 700 μL con una pipeta de 1 mL. Esto dará como resultado 17 fracciones, lo que permite una resolución suficiente.

4. Análisis de vesículas suzocondriales

  1. Concentrar las proteínas sometiendo cada fracción a dos precipitaciones de TCA38 realizadas secuencialmente para preparar las muestras SDS-PAGE.
    1. Añadir 200 μL de TCA al 72% a las fracciones individuales y mezclar hasta que la solución sea homogénea. Incubar las fracciones durante 30 min en hielo, y granular las proteínas precipitadas por centrifugación a 20.000 x g y 4 °C durante 20 min. Deseche el sobrenadante, agregue 500 μL de solución de TCA al 28 %, mezcle bien y repita el paso de centrifugación.
    2. Lavar los gránulos con 1 ml de acetona (−20 °C) y centrifugar durante 10 min a 20.000 x g y 4 °C. Deseche el sobrenadante y deje que los gránulos se sequen al aire. Vuelva a suspender los gránulos en 60 μL de tampón de muestra SDS e incube las muestras durante 5 min a 95 °C.
      NOTA: Quedará una gran cantidad de sacarosa, particularmente en las fracciones de alta densidad, después de la primera precipitación de TCA. Esto se eliminará a través de la precipitación adicional de TCA.
  2. Analizar 20 μL de cada fracción mediante SDS-PÁGINA39 e inmunotransferencia40,41,42,43.

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Resultados

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Es relativamente fácil separar las membranas internas y externas mitocondriales. Sin embargo, la generación y separación de vesículas que contienen sitios de contacto es mucho más difícil. En nuestra opinión, dos pasos son críticos y esenciales: las condiciones de sonicación y el gradiente utilizado.

Por lo general, se cree que los degradados lineales tienen una mejor resolución en comparación con los degradados escalonados. Sin embargo, su producción reproducible es tediosa y requiere equipos...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El subfraccionamiento mitocondrial es un experimento complicado con varios pasos muy complejos. Por lo tanto, nuestro objetivo era mejorar aún más y, hasta cierto punto, simplificar nuestro método establecido32. En este caso, los desafíos eran la necesidad de equipos complicados y altamente especializados, que a menudo son construcciones individuales, y el enorme consumo de tiempo y energía. Con este fin, intentamos eliminar las bombas y las construcciones individuales utilizadas para la fundición...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.E.H. agradece a la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), proyecto número 413985647, por su apoyo financiero. Los autores agradecen al Dr. Michael Kiebler, de la Universidad Ludwig-Maximilians, Múnich, por su generoso y amplio apoyo. Agradecemos a Walter Neupert por su aporte científico, sus útiles discusiones y su continua inspiración. J.F. agradece a la Escuela de Graduados de Ciencias de la Vida de Múnich (LSM) por su apoyo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
13,2 mL, tubo ultraclaro de pared delgada abierto, 14 x 89 mmBeckman Instruments, Alemania344059
50 mL, tubo abierto de policarbonato de pared gruesa abierto, 29 x 104 mmBeckman Instruments, Alemania363647
Rotor de ángulo fijo - Aluminio, 8 x 50 mL, 25.000 rpm, 75.600 x gBeckman Instruments, Alemania363055
refractómetro AbbeZeiss, Alemaniadescontinuado,
cualquier refractómetro Abbe puede ser utilizado
accu-jet pro Pipet ControllerBrandtech, EE. UU.BR26320descontinuado,
cualquier controlador de pipeta será suficiente
Beaker 1000 mLDWK Life Science, AlemaniaC118.1
Branson  Sonda digital W-250 DBranson Ultrasonics, EE. UU.FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIPBranson Ultrasonics, EE. UU.101-148-062
Branson Ultrasonics Sonificadores de 200 y 400 vatios: celda de enfriamiento de rosetaBranson Ultrasonics, EE. UU.15-338-70
Centrífuga Avanti JXN-26Beckman Instruments, AlemaniaB37912
Centrífuga Optima XPN-100 ultraBeckman Instruments, Alemania8043-30-0031
cOmplete Inhibtor-Cóctel de proteasaRoche, Suiza11697498001
D-SorbitRoth, Alemania6213
EDTA (Ácido etilendiamina-tetraacético, sal disódica dihidratada)Roth, Alemania8043
Matraz Erlenmeyer, 100 mLRoth, AlemaniaPipeta graduada X747.1
, Kl. B, 25:0, 0.1Hirschmann, Alemania1180170
pipeta graduada, Kl. B, 5:0, 0.05Hirschmann, Alemania1180153
baño de hieloneoLab, Alemania  S12651
Agitador magnético RCT basicIKA-Werke GmbH, AlemaniaZ645060GB-1EA
MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico)Gerbu, Alemania1081
MyPipetman Select P1000Gilson, Estados UnidosFP10006S
MyPipetman Select P20Gilson, Estados UnidosFP10003S
MyPipetman Select P200Gilson, Estados Unidos
Omnifix 1 mLBraun, Alemania4022495251879
Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)Serva, Alemania32395.03
Cánula STERICAN 21 Gx4 4/5 0.8x120 mmBraun, Alemania4022495052414
barra agitadora, 15 mmVWR, EE. UU.442-0366
SacarosaMerck, AlemaniaS8501
SW 41 Ti Rotor de cubeta oscilanteBeckman Instruments, Alemania331362
Tubos de ensayoEppendorf, Alemania3810X
Trituradoras de tisú, tipo Potter-Elvehjem, recipiente de vidrio de 2 mLVWR, EE. UU432-0200
Amoladoras de tejidos, tipo Potter-Elvehjem, émbolo de 2 mL con punta dentadaVWR, EE. UU.432-0212
Ácido tricloroacético ( TCA)Sigma Aldrich, Alemania33731descontinuado,
cualquier TCA será suficiente (CAS: 73-03-9)
TRISRoth, Alemania4855
A-25.50 FP10005S.

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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