Un método mejorado para aislar los sitios de contacto mitocondrial

Las mitocondrias realizan una variedad de funciones diferentes en los eucariotas, siendo la más conocida la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa. Otras funciones incluyen la producción de grupos de hierro-azufre, la síntesis de lípidos y, en eucariotas superiores, la señalización de Ca²⁺ y la inducción de la apoptosis 1,2,3,4. Estas funciones están inseparablemente ligadas a su compleja ultraestructura.

La ultraestructura mitocondrial fue descrita por primera vez por microscopía electrónica⁵. Se demostró que las mitocondrias son orgánulos bastante complejos que constan de dos membranas: la membrana externa mitocondrial y la membrana interna mitocondrial. Así, estas membranas forman dos compartimentos acuosos: el espacio intermembrana y la matriz. La membrana interna mitocondrial se puede dividir aún más en diferentes secciones. La membrana límite interna permanece muy cerca de la membrana externa, y las crestas forman invaginaciones. Las llamadas uniones crista conectan la membrana límite interna y las crestas (Figura 1). Además, las micrografías electrónicas de mitocondrias osmóticamente encogidas revelan que existen sitios en los que las membranas mitocondriales están estrechamente conectadas ^6,7. Estos llamados sitios de contacto están formados por complejos proteicos que abarcan las dos membranas (Figura 1). Se cree que estos sitios de interacción son esenciales para la viabilidad celular debido a su importancia para la regulación de la dinámica mitocondrial y la herencia, así como para la transferencia de metabolitos y señales entre el citosol y la matriz⁸.

El complejo MICOS en la membrana interna mitocondrial es probablemente el complejo formador de sitios de contacto mejor caracterizado y más versátil. MICOS fue descrito en levaduras en 2011, y consta de seis subunidades ^{9,10,1 1}: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19^, Mic12 y Mic10. Estos forman un complejo de aproximadamente 1,5 MDa que se localiza en las uniones^crista 9,10,11. La deleción de cualquiera de las subunidades centrales, Mic10 o Mic60, conduce a la ausencia de este complejo ^9,11, lo que significa que estas dos subunidades son esenciales para la estabilidad de MICOS. Curiosamente, MICOS forma no solo uno, sino múltiples sitios de contacto con varias proteínas y complejos de la membrana externa mitocondrial: el complejo TOM 11,12, el complejo TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, el complejo Fzo1-Ugo1⁹,^Por1 10^, OM45 10 y Miro ¹⁷. Esto indica fuertemente que el complejo MICOS está involucrado en varios procesos mitocondriales, como la importación de proteínas, el metabolismo de los fosfolípidos y la generación de la ultraestructura mitocondrial¹⁸. Esta última función es probablemente la principal función de MICOS, ya que la ausencia del complejo MICOS inducida a través de la deleción de MIC10 o MIC60 conduce a una ultraestructura mitocondrial anormal que carece prácticamente por completo de crestas regulares. En cambio, las vesículas de membrana interna sin conexión con la membrana límite interna acumulan^{19, 20}. Es importante destacar que MICOS se conserva en forma y función desde la levadura hasta el ser humano²¹. La asociación de mutaciones en subunidades MICOS con enfermedades humanas graves también enfatiza su importancia para los eucariotas superiores^22,23. Aunque MICOS es muy versátil, deben existir sitios de contacto adicionales (según nuestras observaciones no publicadas). De hecho, se han identificado varios otros sitios de contacto, por ejemplo, las maquinarias de fusión mitocondrial Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 o Mdm31-Por1^, que está involucrada en la biosíntesis del fosfolípido mitocondrial específico cardiolipina ²⁷. Recientemente, mejoramos el método que nos llevó a la identificación de MICOS para identificar Cqd1 como parte de un nuevo sitio de contacto formado con el complejo de membrana externa Por1-Om14²⁸. Curiosamente, este sitio de contacto también parece estar involucrado en múltiples procesos, como la homeostasis de la membrana mitocondrial, el metabolismo de los fosfolípidos y la distribución de la coenzima Q^28,29.

En este caso, se utilizó una variación del fraccionamiento de mitocondrias descrito anteriormente 9,30,31,32,33. El tratamiento osmótico de las mitocondrias conduce a la ruptura de la membrana externa mitocondrial y a una contracción del espacio de la matriz, dejando las dos membranas solo muy cerca en los sitios de contacto. Esto permite la generación de vesículas que consisten exclusivamente en la membrana externa mitocondrial o en la membrana interna mitocondrial o en los sitios de contacto de ambas membranas a través de una sonicación suave. Debido a que la membrana interna mitocondrial posee una proporción proteína-lípidos mucho más alta, las vesículas de la membrana interna mitocondrial exhiben una mayor densidad en comparación con las vesículas de la membrana externa mitocondrial. La diferencia de densidad se puede utilizar para separar las vesículas de membrana a través de la centrifugación en gradiente de densidad de flotación de sacarosa. Por lo tanto, las vesículas de la membrana externa mitocondrial se acumulan a bajas concentraciones de sacarosa, mientras que las vesículas de la membrana interna mitocondrial se enriquecen a altas concentraciones de sacarosa. Las vesículas que contienen los sitios de contacto se concentran en concentraciones intermedias de sacarosa (Figura 2). El siguiente protocolo describe en detalle este método mejorado, que requiere menos equipo especializado, tiempo y energía en comparación con el establecido anteriormente³², y proporciona una herramienta útil para la identificación de posibles proteínas en el sitio de contacto.

1. Tampones y soluciones madre

1. Prepare una solución de ácido 3-morfolinopropano-1-sulfónico (MOPS) 1 M en agua desionizada, pH 7,4. Conservar a 4 °C.
2. Preparar 500 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en agua desionizada, pH 8,0. Almacenar a temperatura ambiente.
3. Preparar sorbitol 2,4 M en agua desionizada. Almacenar a temperatura ambiente después de esterilizarlo en autoclave.
4. Preparar 2,5 M de sacarosa en agua desionizada. Almacenar a temperatura ambiente después de esterilizarlo en autoclave.
5. Prepare 200 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) en isopropanol. Conservar a -20 °C.
   PRECAUCIÓN: El PMSF es tóxico si se ingiere y causa quemaduras graves en la piel y daños oculares. No respire el polvo y use guantes y gafas protectoras.
6. Preparar ácido tricloroacético (TCA) al 72% en agua desionizada. Conservar a 4 °C.
   PRECAUCIÓN: El TCA puede causar irritación respiratoria, quemaduras graves en la piel y daño ocular. No respire el polvo y use guantes y gafas protectoras.
7. Preparar el tampón SM: 20 mM MOPS y 0,6 M de sorbitol, pH 7,4.
8. Prepare el tampón de hinchamiento: 20 mM de MOPS, 0,5 mM de EDTA, 1 mM de PMSF y cóctel de inhibidores de la proteasa, pH 7,4.
9. Prepare los tampones de gradiente de sacarosa: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M y 1,3 M de sacarosa en 20 mM de MOPS y 0,5 mM de EDTA, pH 7,4.
   NOTA: Todos los tampones se pueden almacenar a 4 °C; sin embargo, se recomienda almacenar los tampones que contienen sacarosa a -20 °C para evitar el crecimiento de hongos. Los inhibidores de la proteasa deben añadirse de nuevo antes de su uso.

2. Generación de vesículas submitocondriales

1. Aislar las mitocondrias crudas de levadura frescas de acuerdo con los protocolos establecidos^34,35.
   NOTA: Para este experimento, se aislaron mitocondrias de Saccharomyces cerevisiae. No es necesaria la generación de mitocondrias puras en gradiente desprovistas de otros orgánulos.
2. Resuspender 10 mg de mitocondrias recién aisladas en 1,6 ml de tampón SM (4 °C) mediante pipeteo (Figura 2, paso 1).
3. Transfiera la suspensión mitocondrial a un matraz Erlenmeyer de 100 ml preenfriado.
4. Agregue lentamente 16 ml de tampón de hinchazón con una pipeta de vidrio de 20 ml. Aplique una agitación suave constante sobre hielo durante la adición. Este tratamiento osmótico da como resultado la absorción de agua en el espacio de la matriz. La hinchazón de la membrana interna mitocondrial alterará la membrana externa. Sin embargo, ambas membranas permanecerán en contacto en los sitios de contacto⁹ (Figura 2, paso 2).
5. Incubar las muestras bajo agitación suave constante durante 30 minutos en hielo.
6. Agregue lentamente 5 ml de solución de sacarosa 2,5 M con una pipeta de vidrio de 5 ml para aumentar la concentración de sacarosa en las muestras a aproximadamente 0,55 M. Este tratamiento osmótico da como resultado un flujo de agua de la matriz³⁶. La contracción de la membrana interna tiene como objetivo maximizar su distancia a los fragmentos residuales de la membrana externa. Esto disminuye la probabilidad de generar vesículas híbridas artificiales de membranas internas y externas a través de la sonicación (Figura 2, paso 3).
7. Incubar las muestras bajo una agitación suave durante 15 minutos en hielo.
8. Sométase las mitocondrias a sonicación para generar vesículas de membrana submitocondrial (Figura 2, paso 4).
   1. Transfiera la suspensión mitocondrial a una celda roseta preenfriada.
   2. Sonicar la suspensión mitocondrial a una amplitud del 10% durante 30 s mientras se enfría la célula roseta en un baño de hielo.
   3. Deje reposar la suspensión durante 30 s en un baño de hielo.
   4. Repita los pasos 2.8.2 y 2.8.3 tres veces más.
      NOTA: Las condiciones de sonicación variarán según el sonicador utilizado. La optimización será necesaria para máquinas individuales. La sonicación demasiado dura conducirá a la formación artificial de vesículas formadas por membranas internas y externas mitocondriales.

3. Separación de vesículas submitocondriales

1. Separar las vesículas generadas de las mitocondrias intactas restantes mediante centrifugación a 20.000 x g durante 20 min a 4 °C. Las mitocondrias intactas se granularán mientras que las vesículas permanecerán en el sobrenadante.
2. Concentra la mezcla de vesículas.
   1. Transfiera el sobrenadante a tubos de ultracentrifugación nuevos.
   2. Cargue una almohadilla de 0,3 ml de solución de sacarosa 2,5 M en el fondo del tubo utilizando una jeringa de 1 ml equipada con una cánula de 0,8 mm x 120 mm.
   3. Centrifugar a 118.000 x g durante 100 min a 4 °C.
      NOTA: En este caso, se utilizó un rotor de cangilón basculante con un radio máximo de 153,1 mm. Las condiciones de centrifugación dependen en gran medida del rotor y tendrán que adaptarse cuando se utilice otro rotor.
3. Las vesículas aparecerán como un disco en la parte superior de la almohadilla de sacarosa después de la centrifugación. Deseche aproximadamente el 90% del sobrenadante. Ahora, recoja las vesículas concentradas resuspendiéndolas en el tampón restante, incluida la sacarosa de 2,5 M, pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la suspensión a un homogeneizador Dounce helado.
4. Homogeneizar la suspensión con al menos 10 pasadas utilizando un alfarero de politetrafluoroetileno.
5. Prepara el degradado de sacarosa.
   1. Para un gradiente escalonado de 11 mL con cinco pasos (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M y 0,8 M de sacarosa en 20 mM de MOPS y 0,5 mM de EDTA, pH 7,4), cada capa tiene 2,2 mL de solución de sacarosa.
      NOTA: Se recomienda un refractómetro para medir y ajustar las concentraciones de sacarosa; sin embargo, no es esencial. Aplique 10 μL del tampón al refractómetro y detecte los respectivos índices de refracción. El cálculo de la concentración de sacarosa es el siguiente:
      
      1.3333 representa el índice de refracción del agua. 0,048403 es un índice de conversión específico de sacarosa obtenido a partir del escalado lineal de la refractividad molar a la concentración de sacarosa en soluciones acuosas ³⁷.
   2. Agregue la concentración más alta de sacarosa al tubo de centrifugación y coloque el tubo a -20 °C. Espere hasta que la capa esté completamente congelada antes de aplicar la siguiente. Proceda en consecuencia hasta que se agregue la última capa y almacene los degradados a -20 °C.
      NOTA: Recuerde transferir los gradientes congelados a 4 °C al iniciar el experimento para permitir que los gradientes se descongelen. Esto tomará aproximadamente 3 h. Para la centrifugación se utilizó un rotor de cangilón basculante con una capacidad de 13,2 ml. Cuando se utiliza un rotor diferente, los volúmenes de paso de gradiente deben adaptarse en consecuencia.
6. Mida la concentración de sacarosa de las muestras con un refractómetro. Si no hay acceso a un refractómetro, se podría suponer alternativamente que la concentración de sacarosa es de 2 M. Esta supuesta concentración de sacarosa será la base para el siguiente paso.
7. Ajuste la concentración de sacarosa a 0,6 M mediante la adición de una cantidad adecuada de 20 mM de MOPS, 0,5 mM de EDTA, 1 mM de PMSF y cóctel de inhibidores de proteasa, pH 7,4. Si la concentración de sacarosa se estima en 2 M en lugar de medirse, se recomienda probar si la concentración es lo suficientemente baja después del ajuste. Aplique una pequeña alícuota de la muestra (aprox. 50 μL) sobre 200 μL de sacarosa 0,8 M en un tubo de ensayo. La muestra debe permanecer encima de la sacarosa 0,8 M.
8. Cargue las muestras (aproximadamente 1 ml) en la parte superior del gradiente de sacarosa (guarde el 10% para referencia posterior). Es importante un pipeteo cuidadoso para evitar la alteración del gradiente (Figura 2, paso 5).
9. Separar las vesículas por centrifugación a 200.000 x g y 4 °C durante 12 h. Si es posible, ajuste la centrífuga a aceleración y desaceleración lentas para evitar la perturbación del gradiente (Figura 2, paso 6).
   NOTA: En este caso, se utilizó un rotor de cangilón basculante con un radio máximo de 153,1 mm. Las condiciones de centrifugación dependen en gran medida del rotor y tendrán que adaptarse cuando se utilice otro rotor.
10. Coseche el gradiente de arriba a abajo en fracciones de 700 μL con una pipeta de 1 mL. Esto dará como resultado 17 fracciones, lo que permite una resolución suficiente.

4. Análisis de vesículas suzocondriales

1. Concentrar las proteínas sometiendo cada fracción a dos precipitaciones de TCA³⁸ realizadas secuencialmente para preparar las muestras SDS-PAGE.
   1. Añadir 200 μL de TCA al 72% a las fracciones individuales y mezclar hasta que la solución sea homogénea. Incubar las fracciones durante 30 min en hielo, y granular las proteínas precipitadas por centrifugación a 20.000 x g y 4 °C durante 20 min. Deseche el sobrenadante, agregue 500 μL de solución de TCA al 28 %, mezcle bien y repita el paso de centrifugación.
   2. Lavar los gránulos con 1 ml de acetona (−20 °C) y centrifugar durante 10 min a 20.000 x g y 4 °C. Deseche el sobrenadante y deje que los gránulos se sequen al aire. Vuelva a suspender los gránulos en 60 μL de tampón de muestra SDS e incube las muestras durante 5 min a 95 °C.
      NOTA: Quedará una gran cantidad de sacarosa, particularmente en las fracciones de alta densidad, después de la primera precipitación de TCA. Esto se eliminará a través de la precipitación adicional de TCA.
2. Analizar 20 μL de cada fracción mediante SDS-PÁGINA³⁹ e inmunotransferencia^40,41,42,43.

Es relativamente fácil separar las membranas internas y externas mitocondriales. Sin embargo, la generación y separación de vesículas que contienen sitios de contacto es mucho más difícil. En nuestra opinión, dos pasos son críticos y esenciales: las condiciones de sonicación y el gradiente utilizado.

Por lo general, se cree que los degradados lineales tienen una mejor resolución en comparación con los degradados escalonados. Sin embargo, su producción reproducible es tediosa y requiere equipos especiales. Por lo tanto, establecimos un método para generar un gradiente de pasos con diferencias relativamente pequeñas entre los pasos individuales (ver paso 3.5). Especulamos que el gradiente de paso se equilibraría tras la centrifugación, lo que daría como resultado un gradiente casi lineal. Sorprendentemente, la determinación de las concentraciones de sacarosa de las fracciones individuales después de la centrifugación utilizando un refractómetro reveló que el gradiente de paso se volvió prácticamente lineal después de 12 h de centrifugación a 200.000 x g (Figura 3).

La importancia de la sonicación suave es evidente en estos resultados representativos. En condiciones de sonicación leve (Figura 4A), el marcador de membrana externa mitocondrial Tom40 se enriqueció en las fracciones tempranas de baja densidad (Fracción n.º 4) y estuvo prácticamente ausente en las posteriores. El marcador de membrana interna mitocondrial Tim17 se concentró en fracciones de alta densidad (Fracción Nº 17). Por el contrario, la proteína Mic60 en el sitio de contacto se acumuló en fracciones de concentración intermedia de sacarosa (Fracción No. 12-14), lo que indica la generación exitosa y la posterior separación de las diversas vesículas de membrana. Por el contrario, con condiciones de sonicación más duras, el marcador de membrana externa mitocondrial Tom40 podría detectarse en fracciones más bajas del gradiente (Fracción n.º 14 y Fracción n.º 17, Figura 4B). Además, hubo una cantidad significativa de Tim17 en fracciones de densidad intermedia (Fracción Nº 13 y Fracción Nº 14, Figura 4B). La acumulación inespecífica de marcadores de membrana externa e interna en fracciones de densidad intermedia indica la formación artificial de membranas mixtas, lo que inhibe la identificación de proteínas candidatas.

Figura 1: Representación esquemática de la ultraestructura mitocondrial. Una representación esquemática de una mitocondria para mostrar los diferentes compartimentos, membranas y ubicaciones de proteínas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Flujo de trabajo del fraccionamiento mitocondrial para aislar proteínas en el sitio de contacto. Una descripción general esquemática del proceso descrito en el protocolo. Las (1) mitocondrias recién aisladas estaban (2) hinchadas osmóticamente (3) y luego encogidas. (4) Las mitocondrias encogidas se sometieron a una sonicación leve para generar vesículas suestocondriales. (5) La mezcla de vesículas se concentró y se cargó en un gradiente escalonado de sacarosa. (6) A través de la centrifugación, las vesículas de la membrana externa mitocondrial se enriquecieron a una baja concentración de sacarosa, las vesículas de la membrana interna mitocondrial a una alta concentración de sacarosa y las vesículas que contienen el sitio de contacto a una concentración intermedia de sacarosa. Abreviaturas: MIM, membrana interna mitocondrial; MOM: membrana externa mitocondrial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Generación de un gradiente lineal por centrifugación. Se prepararon dos gradientes escalonados (1,3 M, 1,13 M, luego 1,02 M, 0,96 M y 0,8 M en MOPS de 20 mM y EDTA de 0,5 mM, pH 7,4) en paralelo, y se cargó 1 mL de sacarosa de 0,6 M en MOPS de 20 mM y EDTA de 0,5 m, pH 7,4, en ambos gradientes. Los gradientes se sometieron a centrifugación a 200.000 x g y 4°C durante 12 h y se cosecharon en 17 fracciones cada uno. La reproducibilidad del método se comprobó mediante la determinación de la concentración de sacarosa de las fracciones individuales de los gradientes individuales utilizando un refractómetro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Aislamiento de proteínas en el sitio de contacto con un pulso ultrasónico bien definido. (A,B) Las mitocondrias de levadura recién aisladas se sometieron a un tratamiento osmótico y se expusieron a sonicación. Las vesículas generadas se separaron mediante centrifugación en gradiente de densidad de flotación de sacarosa. El gradiente se fraccionó y las proteínas de las distintas fracciones se sometieron a precipitación de TCA. La distribución de las proteínas marcadoras para la membrana externa mitocondrial (Tom40), la membrana interna mitocondrial (Tim17) y los sitios de contacto (Mic60) se analizaron mediante inmunotransferencia utilizando los anticuerpos indicados. (A) La sonicación leve (4 x 30 s, 10% de amplitud) dio lugar a una clara separación de las proteínas de la membrana externa (fracciones de baja densidad) y las proteínas de la membrana interna (fracciones de alta densidad). Además, la proteína Mic60 en el sitio de contacto se enriqueció con éxito en fracciones de densidad intermedia. (B) La sonicación más dura (4 x 30 s, 20% de amplitud) dio lugar a la generación de vesículas híbridas y, por tanto, no permitió una separación clara de los puntos de contacto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.