Optimerad automatiserad analys av levande neuronala mitokondrier homeostasmodulering av isoformspecifika retinsyrareceptorer
Summary
Det mitokondriella nätverket är extremt komplext, vilket gör det mycket utmanande att analysera. Ett nytt MATLAB-verktyg analyserar levande konfokala avbildade mitokondrier i timelapse-bilder, men resulterar i en stor utdatavolym som kräver individuell manuell uppmärksamhet. För att lösa detta problem utvecklades en rutinoptimering som möjliggjorde snabb filanalys.
Abstract
Det komplexa mitokondriella nätverket gör det mycket utmanande att segmentera, följa och analysera levande celler. MATLAB-verktyg gör det möjligt att analysera mitokondrier i timelapse-filer, vilket avsevärt förenklar och påskyndar bildbehandlingsprocessen. Icke desto mindre producerar befintliga verktyg en stor utdatavolym, vilket kräver individuell manuell uppmärksamhet, och grundläggande experimentella inställningar har en utmatning av tusentals filer, som var och en kräver omfattande och tidskrävande hantering.
För att ta itu med dessa problem utvecklades en rutinmässig optimering, i både MATLAB-kod och live-script-formulär, vilket möjliggör snabb filanalys och avsevärt minskar dokumentläsning och databehandling. Med en hastighet på 100 filer/min möjliggör optimeringen en övergripande snabb analys. Optimeringen uppnår resultaten genom att beräkna medelvärdet av ramspecifika data för enskilda mitokondrier över tidsramar, analysera data på ett definierat sätt, i överensstämmelse med de som utdata från befintliga verktyg. Levande konfokalavbildning utfördes med hjälp av färgämnet tetrametylrhodaminmetylester, och den rutinmässiga optimeringen validerades genom att behandla neuronala celler med retinsyrareceptoragonister (RAR), vars effekter på neuronala mitokondrier är etablerade i litteraturen. Resultaten överensstämde med litteraturen och möjliggjorde ytterligare karakterisering av mitokondriellt nätverksbeteende som svar på isoformspecifik RAR-modulering.
Denna nya metodik möjliggjorde snabb och validerad karakterisering av mitokondrienätverk för hela nervceller, men den möjliggör också differentiering mellan axon- och cellkroppsmitokondrier, en viktig funktion att tillämpa inom neurovetenskapen. Dessutom kan detta protokoll tillämpas på experiment med snabbverkande behandlingar, vilket möjliggör avbildning av samma celler före och efter behandlingar, vilket överskrider neurovetenskapen.
Introduction
Cellulära mitokondrier sitter i centrum för alla fysiologiska tillstånd, och en grundlig förståelse av deras homeostas (mitostas) och beteende är avgörande för att hjälpa till att identifiera farmakologisk behandling för ett brett spektrum av sjukdomar, inklusive cancer och Alzheimers sjukdom 1,2.
Mitokondrier spelar avgörande cellulära roller i energihomeostas, ATP-generering, kalciumbuffring och ROS-reglering, och mitostas är avgörande för att upprätthålla proteinhomeostas eftersom molekylära chaperoner är energiberoende3. Dessa kräver en konstant och dynamisk nätverksmodulering och anpassning för att effektivt möta cellulära behov, och mitokondrietransporten regleras av olika signalvägar; Tidigare forskning har beskrivit en sådan signalväg, retinsyrareceptorer (RAR)4,5. Retinsyra (RA) främjar axonal och neuritutväxt via RAR-aktivering. I primära kortikala neuroner hos möss uppmuntrar aktivering av RAR-β mitokondriell tillväxt, hastighet och rörlighet i neuriten6.
Med tanke på mitokondriernas nätverks anpassningsförmåga och dynamik är möjligheten att bedöma mitostas i “realtid” avgörande inte bara för att undersöka energihomeostas, utan också för proteostas, cellulär hälsa, proliferation eller signalering. En vanlig metod för att utvärdera mitostas bygger på konfokalmikroskopi efter att mitokondrier markerats med hjälp av ett fluorescerande färgämne eller markör, samt en specifik mikroskopiuppställning som tillåter temperatur och/eller CO2-reglering 7. Denna typ av experimentuppställning innebär att ett experimentellt replikat utförs åt gången. Förutom experimentell upprepning av olika behandlingar bör det beaktas att de flesta experiment bör ha sina tekniska replikat (där mer än en position avbildas per platta), med en serie fokalplan (z-stackar) registrerade i en serie tidpunkter. En experimentell design med tre repetitioner av en kontroll och två behandlingar, med fem avbildningspositioner per platta och 15 tidpunkter, resulterar i 225 stackar som ska bearbetas. Klassiskt analyserades videor av levande mitokondrier genom att plotta kymografer, som skulle analyseras individuellt8, i en tidskrävande process som krävde omfattande manuell inmatning, även när man förlitade sig på datorverktyg.
En algoritm beskrevs nyligen9 som möjliggör automatiserad segmentering och spårning av mitokondrier i levande celler 2-D och 3-D time-lapse-filer. Andra kvantifieringstekniker finns tillgängliga, och alla har sina begränsningar10. Mitometer, en automatiserad applikation med öppen källkod, är särskilt lämplig för analys av tidsfördröjning och mitokondriedynamik, vilket kräver låg användarinmatning. Denna applikation har en rad fördelar jämfört med andra befintliga MATLAB-baserade verktyg, nämligen att den tillåter automatisk bearbetning av enskilda TIF-stackar, med upp till 13 olika parametrar, särskilt intressant för neurovetenskap, eftersom den skiljer mellan peri- och telenukleära mitokondrier.
Men för ett experiment som det ovan beskrivna resulterar dessa 13 parametrar som tillämpas på 225 stackar i 2 925 enskilda utdatafiler. Dessa kräver fyra individuella datorinmatningar, vilket ger över 10 000 manuella inmatningar som krävs för att ladda ner alla utdatafiler. För stora experimentella designer resulterar detta i en onödigt extremt tidskrävande analys av varje fil och dataintegration. Här presenterar vi en rutinmässig optimering som möjliggör snabb filanalys, vilket kraftigt minskar dokumentläsning och databehandling, analyserar data på ett definierat sätt, i överensstämmelse med resultatet från befintliga verktyg.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avbildning av levande celler producerar stora filer som kräver seriös databehandling, men även de senaste verktygen kräver omfattande manuell inmatning för att bearbetas. Denna rutinoptimering är inriktad på att förenkla processen för mitokondrieanalys på Mitometern eftersom detta verktyg presenterar en mycket bra balans mellan användarinmatning och datautmatning. En omfattande jämförelse mellan olika verktyg för mitokondriebildanalys har tidigare granskats10. Medan andra pipelines ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bildinsamlingen utfördes i LiM-anläggningen hos iBiMED, en nod inom PPBI (Portuguese Platform of BioImaging): POCI-01-0145-FEDER-022122. Detta arbete stöddes av FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276), ett bidrag till DT från Fundação para a Ciência e Tecnologia of the Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), ett bidrag från ATG-The Gabba Alumni Association till VP, och Institute for Biomedicine-iBiMED, University of Aveiro.
Materials
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
Referencias
- Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
- Clare, D. K., Saibil, H. R. ATP-driven molecular chaperone machines. Biopolymers. 99 (11), 846-859 (2013).
- Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
- Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
- Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754 (2013).
- Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
- Chu, C. -. H., Tseng, W. -. W., Hsu, C. -. M., Wei, A. -. C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775 (2022).
- Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
- Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628 (2021).
- Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).
