线粒体网络极为复杂，使其分析极具挑战性。一种新型的 MATLAB 工具可分析活细胞共聚焦显微镜延时成像中的线粒体，但会产生大量输出数据，需要逐一手动处理。为解决这一问题，开发了一种常规优化方法，可实现文件的快速分析。
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摘要
摘要
复杂的线粒体网络使得对活细胞进行分割、追踪和分析极具挑战性。MATLAB 工具能够对延时成像文件中的线粒体进行分析，显著简化并加快了图像处理过程。然而，现有工具会产生大量输出数据，需要逐一手动处理，而常规的实验设置通常会产生数千个文件，每个文件都需要大量且耗时的操作。
为解决这些问题，开发了一种常规优化方法，该方法以 MATLAB 代码和实时脚本两种形式呈现，可实现快速的文件分析，显著减少文档阅读和数据处理时间。该优化方法的处理速度为每分钟 100 个文件，可实现整体快速分析。该优化通过在时间序列中对单个线粒体的帧特异性数据进行平均，以与现有工具输出结果一致的标准化方式分析数据，从而获得结果输出。采用四甲基罗丹明甲酯染料进行活细胞共聚焦成像，并通过使用视黄酸受体（RAR）激动剂处理神经元细胞来验证该常规优化方法，此类激动剂对神经元线粒体的作用已有文献报道。实验结果与已有文献一致，并进一步表征了线粒体网络在亚型特异性 RAR 调控下的响应行为。
这种新方法能够快速且经过验证地表征整个神经元的线粒体网络，同时还能区分轴突与胞体中的线粒体，这一特性在神经科学领域具有重要应用价值。此外，该方案适用于使用快速作用处理的实验，可在处理前后对同一细胞进行成像观察，其应用范围超越了神经科学领域。
引言
细胞线粒体处于所有生理状态的核心位置，深入理解其稳态（线粒体稳态）及行为对于发现多种疾病（包括癌症和阿尔茨海默病）的药物治疗方案至关重要1,2。
线粒体在细胞能量稳态、ATP生成、钙缓冲以及活性氧（ROS）调控中发挥关键作用，而线粒体稳态（mitostasis）对于维持蛋白质稳态至关重要，因为分子伴侣的功能依赖于能量3。这些过程需要持续且动态的网络调节与适应，以有效满足细胞需求，而线粒体的运输受到多种信号通路的调控；先前的研究已描述其中一条通路，即视黄酸受体（RARs）通路4,5。视黄酸（RA）通过激活RAR促进轴突和神经突的生长。在小鼠原代皮层神经元中，RAR-β的激活可促进神经突中线粒体的生长、运动速度和迁移能力6。
考虑到线粒体网络的适应性与动态特性，评估线粒体稳态的可能性 "实时" 不仅对研究能量稳态至关重要，也对蛋白质稳态、细胞健康、增殖和信号传导具有重要作用。评估线粒体稳态的常用方法是在使用荧光染料或标记物标记线粒体后，通过共聚焦显微镜观察，并结合特定的显微镜系统，以实现对温度和/或CO₂的控制2 调控7此类实验设计要求每次仅进行一个实验重复。除了对不同处理进行实验重复外，还应考虑大多数实验需设置技术重复（即每孔板记录多个成像位置），并在一系列时间点上采集多层焦平面图像（z-stack）。因此，若实验设计包含一个对照组和两个处理组，每组重复三次，每孔板五个成像位置，共15个时间点，则需处理225个z-stack图像序列。传统上，活体线粒体的视频通过绘制并分析单个kymograph图来进行分析。8，这一过程耗时较长，即使借助计算机工具，仍需要大量人工干预。
最近描述了一种算法9，可用于对活细胞二维和三维延时成像文件中的线粒体进行自动分割与追踪。目前已有其他定量分析技术，但均存在一定的局限性10。Mitometer 是一款自动化的开源应用程序，特别适用于延时成像和线粒体动态分析，且所需用户干预较少。该程序相较于其他现有的基于 MATLAB 的工具具有一系列优势，尤其能够自动处理单个 TIF 图像序列，并利用多达 13 种不同参数进行分析，这对于神经科学领域尤为有意义，因为它能够区分核周和远核区的线粒体。
然而，对于上述实验而言，这13个参数应用于225个图像栈时会产生2,925个独立的输出文件。这些文件需要进行四次独立的计算机输入操作，总计需超过10,000次手动操作才能下载全部输出文件。对于大规模的实验设计而言，这会导致对每个文件的分析和数据整合变得不必要地极为耗时。本文介绍了一种常规优化方法，可实现快速的文件分析，显著减少文档读取和数据处理工作量，并以与现有工具输出结果一致的方式对数据进行系统化分析。
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方案
注意：本方案包含两个主要步骤：湿实验步骤，涉及细胞培养和活细胞共聚焦显微镜成像以获取活体线粒体图像（图1）；以及计算机模拟（in silico）步骤，用于分析所获得的图像（图2）。对于三维活体线粒体成像数据的自动化分析，采用Lefebvre等人提供的MATLAB应用程序Mitometer9。该常规优化程序使用MATLAB编写。相关软件、更新版本及ImageJ宏处理程序可通过GitHub免费在线获取，网址为 https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB。
1. 活细胞显微镜观察
图 1：实验流程。SH-SY5Y 细胞经分化后用类视黄醇处理。（A）使用共聚焦显微镜对经处理的细胞进行 TMRM 活体成像，以捕获五个视野的时间序列 z 轴层扫图像。（B）Mitometer 应用程序（MATLAB）可自动分割并分析线粒体图像。此外，该软件可根据线粒体与细胞核的接近程度自动区分线粒体。蓝色点表示线粒体的初始位置；红色点表示最终位置。比例尺 = 30 µm。缩写：TMRM = 四甲基罗丹明甲酯。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 细胞培养
- 将SH-SY5Y细胞置于培养箱中孵育 37 °C 在含5% CO₂的湿润环境中2 以及95%空气，在等体积的MEM（最低必需培养基）和F12（Ham's F12营养混合物）培养基中培养，并添加10%胎牛血清（FBS）。
- 将SH-SY5Y细胞以15 × 10⁵个/皿的密度接种于玻璃底细胞培养皿中4 cells/mL
- 通过5天的处理诱导细胞分化 10 µM 全反式 含1% FBS的培养基中加入视黄酸处理，随后用10 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）处理2天。
- 细胞处理
- 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并用10处理72小时-7 MEM（最低必需培养基）和F12（Ham's F12营养混合物）培养基等体积混合，并添加1% FBS，用于M RAR-亚型激动剂实验。
注意：所用的 RARα 激动剂为 AM580；RARβ 激动剂为 CD2314；Ch55 用作 RARα 和 RARβ 的共激动剂。 在RA 用作阳性对照；BMS493 用作 RAR 拮抗剂 泛-拮抗剂。
- 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并用10处理72小时-7 MEM（最低必需培养基）和F12（Ham's F12营养混合物）培养基等体积混合，并添加1% FBS，用于M RAR-亚型激动剂实验。
- 活细胞共聚焦成像
- 更换为含1% FBS并添加20 nM四甲基罗丹明甲酯（TMRM）的新鲜培养基，孵育45分钟。
注意：TMRM 是一种可穿透细胞膜的荧光染料，可被有活性的线粒体摄取，该孵育过程使 TMRM 达到平衡状态并被具有膜电位的线粒体吸收。11在达到平衡前应开始成像，因为成像过程中TMRM信号强度可能会人为增加。 - 将细胞置于连接激光扫描共聚焦显微镜的培养箱中 37 °C.
- 使用63倍油浸消色差物镜拍摄图像，图像尺寸为 512 x 512 像素 使用……获得 针孔光阑 的 1 个空气单位，捕获时间序列的 15 帧 从每个细胞板的五个不同视野中，并且一个 z轴扫描 的 8 等距的 z平面生成的.lsm文件包含时间序列、位置和z轴层扫描数据。
注意：增益、对比度和亮度的设置必须首先使用能够充分利用探测器动态范围的最低激光功率进行优化，并在整个研究过程中保持恒定，以确保所有成像均在相同条件下进行。该硬件-软件组合最多可记录九个不同的成像位置，显微镜将自动在各成像位置之间循环采集。
- 更换为含1% FBS并添加20 nM四甲基罗丹明甲酯（TMRM）的新鲜培养基，孵育45分钟。
2. 图像分析
图2常规优化。 (A) 常规优化的代表性代码。B) 常规优化 Live-Script。C常规优化工作流程。D) 常规优化结果验证：未处理细胞中线粒体的代表性图像（左图），经处理后 在RA (10-7 M，72 h，中间图），并用 RAR 拮抗剂 BMS493（10-7 M，72 小时，右侧面板），经 TMRM（20 nM，孵育 45 分钟）孵育后成像。比例尺 = 30 µm. (E细胞体线粒体中的TMRM荧光强度。显著降低 全反式 视黄酸处理（在RA, 10-7 M，72 小时），与对照组相比（p=0.0062），在使用 RAR 拮抗剂（BMS493，10）处理时未观察到该现象-7 M，72 小时）。每种条件下从三次重复实验中各量化五个细胞。 请点击此处以查看此图的放大版本。
- 图像处理
- 在 ImageJ 2.1.0 中打开文件，并按视野分离位置堆栈：打开 ImageJ，然后点击 菜单栏 | 图像 | 复制 | 输入切片/帧数 | 确定.
注意：为了减少对软件的重复性输入，开发了一个 ImageJ 宏，以方便视野图像的复制和保存。
- 在 ImageJ 2.1.0 中打开文件，并按视野分离位置堆栈：打开 ImageJ，然后点击 菜单栏 | 图像 | 复制 | 输入切片/帧数 | 确定.
- 大体实验方案
- 在细胞周围绘制一个感兴趣区域（ROI） 自由选择工具.
- 通过打开 ImageJ 并导航至以运行该宏 菜单栏 | 插件 | 宏 | 运行背景清除并保存图像宏.
注意：在此过程中，图像可以随机化，并根据优化需求存储解决方案密钥。 - 确定像素大小和体素深度：打开 ImageJ | 图像 并导航至 菜单栏 | 图像 | 属性.
- 替代直接方案
注意：此替代方法不使用 Macro 处理图像- 找到像素大小和体素深度：打开 ImageJ | 打开图像 并导航至 菜单栏 | 图像 | 属性.
- 在细胞周围绘制一个感兴趣区域（ROI） 自由选择工具，确保在15帧中涵盖整个细胞。
- 导航至 菜单栏 | 编辑 | 清除外部.
- 导航至 菜单栏 | 文件 | 另存为 | 选择 Tiff.
- 选择保存文件夹，然后单击 保存.
注意：在继续进行分析之前，可在此处手动对图像进行盲化/随机化处理。
- 自动图像分析
- 准备用于存放分析文件的文件夹。
- 创建三个主文件夹，分别命名为“所有轨迹”、“核周轨迹”和“端粒核轨迹”。
注意：这些选项与主要的自动追踪功能相匹配。 - 在每个主文件夹中，为每张待处理的图像创建一个子文件夹，子文件夹按数字从1开始依次编号。
- 将两份常规优化补充文件（mitometer2table.m 和 getTXTfiles.m）的副本添加到每个图像文件夹中。
注意：这些文件有助于数据分析和最终格式的整理。文件夹的数量必须与随机化电子表格（.xlsx）中元素的数量相匹配。在为一个数据集创建了包含补充文件的所有编号子文件夹后，可将其批量复制并粘贴到其余数据集中。
- 创建三个主文件夹，分别命名为“所有轨迹”、“核周轨迹”和“端粒核轨迹”。
- 准备用于存放分析文件的文件夹。
- 使用 MATLAB 应用程序 Mitometer 分析图像。
注意：本实验方案在安装于 MATLAB R2022a 的 mitometer 上运行。为获得最佳运行时间与输出平衡，建议以每批 30 张图像的规模分批加载图像。MAT 文件的最大大小受本地文件系统限制：默认情况下，“save”操作可生成的文件 < 231 字节（约 2 GB）；可改用 MAT-文件版本 7.3 格式保存，因其支持超过 2 GB 的最大变量大小。- 识别/更改默认的 MAT 文件版本：在 首页 标签页中的 环境 切片，点击 偏好设置 并选择 MATLAB | 通用 | MAT-文件.
- 使用 MATLAB 工具 Mitometer 进行分析：打开 MATLAB 并导航至 菜单栏 | 应用程序 | 打开 Mitometer | 选择开始 3D | 输入数据（像素大小（µm)：0.1395089/帧间时间（s）：2/z平面数：8/z平面间轴向距离（µm): 0.418809 | 选择要输入的图像.
- 前往线粒体计数器侧边菜单，选择 图像，点击 选择高亮部分，导航至线粒体计数仪 菜单栏 | 选择轨道 | 轨道视图 | 选择 全轨迹、端核或核周 | mitometer 菜单栏 | 选择分析 | 选择一个元素 (即， 长度）| 选择 保存到“.txt”.
注意：若同时选择，可一次性下载多个参数。 - 将结果文件提取到创建的文件夹中（2.2.1）。
- 常规优化与数据分析
- 准备/调整包含图像编码密钥的“Randomization.xlsx”文件。
- 在 A 列中插入从 1 开始的连续整数。
注意：建议保留一个包含原始命名图像的备份文件夹。 - 将由字母和数字字符组成的分析变量置于 B 列。
注意：文档中的行数必须与主数据集中的文件夹数量保持一致。将此“Randomization.xlsx”文件复制并粘贴到另外两个主数据集中。
- 在 A 列中插入从 1 开始的连续整数。
- 优化的数据分析
- 双击“executable.mlx”，输入文件夹数量， 指定文件夹目录（从文件夹顶部复制目录）| 保存目录（从文件夹顶部复制目录）| 输出文件中的电子表格名称 并点击 运行.
- 根据需要进行统计分析。
注意：可选择在每个包含 .txt 数据的文件夹中自动生成一个 .xlsx 文件，并在分析结束时发出声音提示。实时脚本会以表格形式输出单个电子表格文件。在此输出中，列表示所分析的参数（例如， “长轴长度”；“强度”）以及线条代表分析变量的视野范围（例如，“对照组”）。
- 准备/调整包含图像编码密钥的“Randomization.xlsx”文件。
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结果
为增强并加速对 .txt 格式输出文件的分析，编写了一项常规优化程序，可读取与 Mitometer .txt 输出文件格式一致的数据，其中列表示帧，行表示被识别的线粒体。该常规优化程序通过对每个被识别线粒体的各帧参数取平均值，再对每个视野中所有线粒体的结果进行平均，从而为每个参数生成单一数值。所开发的程序可读取从编号 1 开始递增的文件夹中的文件。Live Script 常规优化程序输出一个表格格式的单一电子表格文件。在此输出文件中，列表示分析的参数例如， “长轴长度”；“强度”）以及线条代表分析变量的视野范围（例如， 对照组
既往发表的研究结果表明，激活 RARβ 后，原代神经元培养物胞体中的线粒体膜电位降低，而轴突内线粒体的运动增加6。
在经维甲酸受体激动剂和拮抗剂处理72小时的分化型神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中进行了类似的处理（图3）。收集的数据使用双尾...
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讨论
活细胞成像会产生大量文件，需要强大的计算处理能力，但即使是最新的分析工具，仍需要大量人工干预。本常规优化方案旨在简化使用Mitometer进行线粒体分析的流程，因为该工具在用户输入与数据输出之间具有良好的平衡性。此前已有文献对多种线粒体图像分析工具进行了全面比较10。尽管其他分析流程更侧重于线粒体网络和聚集体质量的分析，或膜电位变化的检测，但本文所介绍的新方法能够快速且可靠地表征全细胞的线粒体网络，同时还能区分轴突与胞体中的线粒体，这一特性在神经科学领域具有重要应用价值。
MATLAB 应用程序 Mitometer9 可分析图像序列中的线粒体：从序列的每一时间帧和 z 平面中减去弥散背景，然后与高斯核进行卷积以消除高频噪声，再通过强度阈值处理生成分割后的线粒体掩膜。理想参数设置可在最大化识别线粒体中位数的同时，最小化图像相邻时间帧之间线粒体数量和面积的波动，并根据平移运动将前一帧中的线粒体分配至其对应的轨迹中。
分化的 SH-SY5...
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
图像采集在iBiMED的LiM设施中进行，该设施是PPBI（葡萄牙生物成像平台）的一个节点：POCI-01-0145-FEDER-022122。本工作得到FCT（EXPL/BTM-SAL/0902/2021）、LCF（CI21-00276）、葡萄牙科学与技术基金会（Fundação para a Ciência e Tecnologia）向DT提供的资助（2020.02006.CEECIND）、ATG-The Gabba校友协会向VP提供的资助，以及阿威罗大学生物医学研究所-iBiMED的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| 胎牛血清 | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 营养混合物 | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| 最低必需培养基 | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc 玻璃底培养皿 | Thermo-Fisher | 150680 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Thermo-Fisher | 28372 | |
| 视黄酸 | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | 配备活细胞成像培养室和 63 倍油浸物镜 |
参考文献
- Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
- Clare, D. K., Saibil, H. R. ATP-driven molecular chaperone machines. Biopolymers. 99 (11), 846-859 (2013).
- Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
- Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
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- Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
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- Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
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- Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628(2021).
- Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).
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