方法文章

视黄酸受体亚型特异性调控活神经元线粒体稳态的优化自动化分析

DOI：

10.3791/65452

⸱

2023年7月28日

 ,  ,  , 
1Neuroscience and Signalling Laboratory, Institute of Biomedicine (iBiMED), Department of Medical Sciences, University of Aveiro

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

线粒体网络极为复杂，使其分析极具挑战性。一种新型的 MATLAB 工具可分析活细胞共聚焦显微镜延时成像中的线粒体，但会产生大量输出数据，需要逐一手动处理。为解决这一问题，开发了一种常规优化方法，可实现文件的快速分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

复杂的线粒体网络使得对活细胞进行分割、追踪和分析极具挑战性。MATLAB 工具能够对延时成像文件中的线粒体进行分析，显著简化并加快了图像处理过程。然而，现有工具会产生大量输出数据，需要逐一手动处理，而常规的实验设置通常会产生数千个文件，每个文件都需要大量且耗时的操作。

为解决这些问题，开发了一种常规优化方法，该方法以 MATLAB 代码和实时脚本两种形式呈现，可实现快速的文件分析，显著减少文档阅读和数据处理时间。该优化方法的处理速度为每分钟 100 个文件，可实现整体快速分析。该优化通过在时间序列中对单个线粒体的帧特异性数据进行平均，以与现有工具输出结果一致的标准化方式分析数据，从而获得结果输出。采用四甲基罗丹明甲酯染料进行活细胞共聚焦成像，并通过使用视黄酸受体（RAR）激动剂处理神经元细胞来验证该常规优化方法，此类激动剂对神经元线粒体的作用已有文献报道。实验结果与已有文献一致，并进一步表征了线粒体网络在亚型特异性 RAR 调控下的响应行为。

这种新方法能够快速且经过验证地表征整个神经元的线粒体网络，同时还能区分轴突与胞体中的线粒体，这一特性在神经科学领域具有重要应用价值。此外，该方案适用于使用快速作用处理的实验，可在处理前后对同一细胞进行成像观察，其应用范围超越了神经科学领域。

引言

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细胞线粒体处于所有生理状态的核心位置，深入理解其稳态（线粒体稳态）及行为对于发现多种疾病（包括癌症和阿尔茨海默病）的药物治疗方案至关重要1,2。

线粒体在细胞能量稳态、ATP生成、钙缓冲以及活性氧（ROS）调控中发挥关键作用，而线粒体稳态（mitostasis）对于维持蛋白质稳态至关重要，因为分子伴侣的功能依赖于能量3。这些过程需要持续且动态的网络调节与适应，以有效满足细胞需求，而线粒体的运输受到多种信号通路的调控；先前的研究已描述其中一条通路，即视黄酸受体（RARs）通路4,5。视黄酸（RA）通过激活RAR促进轴突和神经突的生长。在小鼠原代皮层神经元中，RAR-β的激活可促进神经突中线粒体的生长、运动速度和迁移能力6。

考虑到线粒体网络的适应性与动态特性，评估线粒体稳态的可能性 "实时" 不仅对研究能量稳态至关重要，也对蛋白质稳态、细胞健康、增殖和信号传导具有重要作用。评估线粒体稳态的常用方法是在使用荧光染料或标记物标记线粒体后，通过共聚焦显微镜观察，并结合特定的显微镜系统，以实现对温度和/或CO₂的控制2 调控7此类实验设计要求每次仅进行一个实验重复。除了对不同处理进行实验重复外，还应考虑大多数实验需设置技术重复（即每孔板记录多个成像位置），并在一系列时间点上采集多层焦平面图像（z-stack）。因此，若实验设计包含一个对照组和两个处理组，每组重复三次，每孔板五个成像位置，共15个时间点，则需处理225个z-stack图像序列。传统上，活体线粒体的视频通过绘制并分析单个kymograph图来进行分析。8，这一过程耗时较长，即使借助计算机工具，仍需要大量人工干预。

最近描述了一种算法9，可用于对活细胞二维和三维延时成像文件中的线粒体进行自动分割与追踪。目前已有其他定量分析技术，但均存在一定的局限性10。Mitometer 是一款自动化的开源应用程序，特别适用于延时成像和线粒体动态分析，且所需用户干预较少。该程序相较于其他现有的基于 MATLAB 的工具具有一系列优势，尤其能够自动处理单个 TIF 图像序列，并利用多达 13 种不同参数进行分析，这对于神经科学领域尤为有意义，因为它能够区分核周和远核区的线粒体。

然而，对于上述实验而言，这13个参数应用于225个图像栈时会产生2,925个独立的输出文件。这些文件需要进行四次独立的计算机输入操作，总计需超过10,000次手动操作才能下载全部输出文件。对于大规模的实验设计而言，这会导致对每个文件的分析和数据整合变得不必要地极为耗时。本文介绍了一种常规优化方法，可实现快速的文件分析，显著减少文档读取和数据处理工作量，并以与现有工具输出结果一致的方式对数据进行系统化分析。

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方案

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注意：本实验方案包含两个主要步骤：湿实验步骤，涉及细胞培养和活细胞共聚焦显微镜成像，以获取活体线粒体的图像（图1）；以及计算机模拟（in silico）步骤，用于分析所获得的图像（图2）。对于三维活体成像线粒体的自动化数据分析，采用了Lefebvre等人提供的MATLAB应用程序Mitometer9。该常规优化程序使用MATLAB编写。相关软件、更新版本及ImageJ宏处理程序可通过GitHub免费在线获取，网址为 https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB。

1. 活细胞显微观察

SH-SY5Y 细胞成像工作流程；TMRM 孵育、活细胞成像设置、自动分割分析。
图 1：实验方案。SH-SY5Y 细胞经诱导分化后用类视黄醇处理。（A）使用共聚焦显微镜通过 TMRM 对处理后的细胞中健康的线粒体进行活体成像，采集五个视野的时间序列 z 轴层扫图像。（B）Mitometer 应用程序（MATLAB）可自动分割并分析线粒体图像。此外，该软件还能根据线粒体与细胞核的接近程度自动区分线粒体。蓝色点表示线粒体的初始位置；红色点表示最终位置。比例尺 = 30 µm。缩写：TMRM = 四甲基罗丹明甲酯。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 细胞培养
    1. 将SH-SY5Y细胞在37 °C、含5% CO2和95%空气的湿润环境中孵育，使用等体积混合的MEM（最低必需培养基）和F12（Ham's F12营养混合物）培养基，添加10%胎牛血清（FBS）。
    2. 以15 × 104 个细胞/mL的密度将SH-SY5Y细胞接种于玻璃底细胞培养皿中。
    3. 使用含1% FBS的培养基，先用10 µM 全反式维甲酸处理细胞5天，再用10 ƞg/mL脑源性神经营养因子（BDNF）处理2天，以诱导细胞分化。
  2. 细胞处理
    1. 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，随后在含1% FBS的等体积混合MEM和F12培养基中，加入10-7 M的RAR亚型激动剂处理72小时。
      注：所用RARα激动剂为AM580；RARβ激动剂为CD2314；Ch55作为RARα和β共激动剂；atRA用作阳性对照；BMS493用作RAR pan-拮抗剂。
  3. 活细胞共聚焦成像
    1. 将培养基更换为新鲜的含1% FBS的培养基，并加入20 nM四甲基罗丹明甲酯（TMRM），孵育45分钟。
      注：TMRM是一种可穿透细胞膜的荧光染料，可被活性线粒体摄取，该孵育时间可使TMRM达到平衡状态并被有膜电位的线粒体吸收11。应在平衡建立前开始成像，因为在成像过程中TMRM信号强度可能人为增加。
    2. 将细胞置于连接激光扫描共聚焦显微镜的37 °C培养箱中。
    3. 使用63倍油镜消色差物镜进行图像采集，图像尺寸为512 x 512像素，针孔孔径设为1艾里单位，每块细胞培养板从五个不同的视野采集15帧的时间序列图像，并采集包含8个等间距z平面的z层扫描。生成的.lsm文件包含时间、位置和z层扫描信息。
      注：增益、对比度和亮度的设置需使用尽可能低的激光功率，以充分利用探测器的动态范围进行初始优化，并在整个研究过程中保持恒定，确保所有成像均在相同条件下进行。该硬件-软件组合最多可记录九个不同位置，显微镜将自动在各成像位置间循环切换。

2. 图像分析

MATLAB 图像处理工作流程；TIF 输入，线粒体分析，输出文件；线粒体研究。
图 2：常规优化。 （A）常规优化的代表性代码。（B）常规优化 Live-Script。（C）常规优化工作流程。（D）常规优化结果验证：未处理细胞中的线粒体代表性图像（左图），经 atRA（10-7 M，72 小时，中图）处理，以及经 RAR 拮抗剂 BMS493（10-7 M，72 小时，右图）处理后，使用 TMRM（20 nM，孵育 45 分钟）染色成像。比例尺 = 30 µm。（E）细胞体中线粒体的 TMRM 荧光强度。与对照组相比，经 all-trans 视黄酸（atRA，10-7 M，72 小时）处理后显著降低（p=0.0062），而使用 RAR 拮抗剂（BMS493，10-7 M，72 小时）处理时未观察到该现象。每种条件下三次重复实验中各量化五个细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 图像处理
    1. 在 ImageJ 2.1.0 中打开文件，并按视野分离位置堆栈：打开 ImageJ，点击 菜单栏 | 图像 | 复制 | 输入切片/帧编号 | 确定。
      注意：为减少对软件的重复输入，已开发一个 ImageJ 宏，以简化视野图像的复制和保存。
  2. 宏协议
    1. 使用自由选择工具在细胞周围绘制感兴趣区域（ROI）。
    2. 运行宏：打开 ImageJ，导航至 菜单栏 | 插件 | 宏 | 运行“清除背景并保存图像”宏。
      注意：在此过程中可对图像进行随机化处理，并根据优化需求存储解码密钥。
    3. 确定像素大小和体素深度：打开ImageJ | 图像，导航至 菜单栏 | 图像 | 属性。
  3. 替代直接协议
    注意：此替代方法不使用宏处理图像
    1. 确定像素大小和体素深度：打开 ImageJ | 打开图像，导航至 菜单栏 | 图像 | 属性。
    2. 使用自由选择工具在细胞周围绘制 ROI，确保其在全部 15 帧中均包含整个细胞。
    3. 导航至 菜单栏 | 编辑 | 清除外部。
    4. 导航至 菜单栏 | 文件 | 另存为 | 选择 Tiff。
    5. 选择保存文件夹，点击保存。
      注意：在此步骤后、继续分析前，可手动对图像进行盲化/随机化处理。
  4. 自动图像分析
    1. 为分析文件准备文件夹。
      1. 创建三个主文件夹，分别命名为“所有轨迹”、“核周轨迹”和“端核轨迹”。
        注意：这些名称与主要的自动轨迹选项相对应。
      2. 在每个主文件夹中，为每幅待处理图像创建一个子文件夹，按数字顺序从 1 开始编号。
      3. 将两个常规优化补充文件（mitometer2table.m 和 getTXTfiles.m）的副本添加到每个图像文件夹中。
        注意：这些文件有助于数据分析和最终格式整理。文件夹数量必须与随机化电子表格（.xlsx）中的元素数量一致。为一个数据集创建所有编号子文件夹并添加补充文件后，可将其批量复制并粘贴至其余数据集。
  5. 使用 MATLAB 应用程序 Mitometer 分析图像。
    注意：本方案在安装于 MATLAB R2022a 的 Mitometer 上运行。为获得最佳运行时间和输出平衡，建议以每批 30 幅图像加载。MAT 文件的最大大小受本地文件系统限制：默认情况下，“save”操作创建的文件大小 < 231 字节（约 2 GB）；可改用 MAT-文件版本 7.3 格式，因其支持大于 2 GB 的最大变量大小。
    1. 识别/修改默认的 MAT 文件版本：在 环境 区域的 主页 选项卡中，点击 首选项，选择 MATLAB | 常规 | MAT 文件。
    2. 使用 MATLAB 工具 Mitometer 进行分析：打开 MATLAB，导航至 菜单栏 | 应用程序 | 打开 Mitometer | 选择 3D 开始 | 输入数据（像素大小 (µm)：0.1395089/帧间时间 (s)：2/z 平面数：8/z 平面间轴向距离 (µm)：0.418809 | 选择输入图像。
    3. 进入 Mitometer 侧边菜单，选择 图像，点击 选择高亮项，导航至 Mitometer 菜单栏 | 选择轨迹 | 轨迹视图 | 选择 所有轨迹、端核轨迹或核周轨迹 | Mitometer 菜单栏 | 选择分析 | 选择一个元素（例如，长度）| 选择 保存为“.txt”。
      注意：若同时选择多个参数，可一次性下载多个参数。
    4. 将结果文件提取至已创建的文件夹（2.2.1）。
  6. 常规优化与数据分析
    1. 准备/调整包含图像编码密钥的“Randomization.xlsx”文件。
      1. 在 A 列插入从 1 开始的连续整数列表。
        注意：建议保留一个包含原始命名图像的副本文件夹。
      2. 在 B 列放置由字母数字字符组成的分析变量。
        注意：文档中的行数必须与主数据集中存在的文件夹数量一致。将此“Randomization.xlsx”文件复制并粘贴到另外两个主数据集中。
    2. 优化数据分析
      1. 双击“executable.mlx”，输入文件夹数量，指定文件夹目录（从文件夹顶部复制路径）| 保存目录（从文件夹顶部复制路径）| 输出文件中的电子表格名称，然后点击 运行。
      2. 根据需要进行统计分析。
        注意：可选择在每个文件夹中创建包含 .txt 数据的 .xlsx 文件，并在分析结束时发出声音提示。实时脚本将以表格形式输出单个电子表格文件。在此输出中，列表示分析参数（例如，“主轴长度”；“强度”），行表示分析变量的视野（例如，“对照”）。

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结果

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为了增强并加速对 .txt 格式输出文件的分析，编写了一项例程优化程序，用于读取与 Mitometer .txt 输出文件格式一致的数据，其中列表示某一帧，行表示已识别的线粒体。该例程优化通过对每个已识别线粒体的各帧数据进行平均，再对每个视野中所有线粒体的结果进行平均，从而为每个参数生成单一数值。所开发的例程按顺序读取从编号 1 开始递增的文件夹中的文件。Live Script 例程优化输出一个表格格式的单一电子表格文件。在此输出文件中，列表示分析参数（例如，“长轴长度”；“强度”），行表示分析变量的视野（例如，“对照组”）。

既往发表的研究结果表明，在激活 RARβ 后，原代神经元培养物胞体中的线粒体膜电位降低，而轴突内线粒体的运动增加6。

在经维甲酸受体激动剂和拮抗剂处理72小时的分化型神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中进行了类似的处理（图3）。收集的数据采用双...

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讨论

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活细胞成像会产生大量文件，需要强大的计算处理能力，但即使是最新的分析工具，仍需要大量人工干预。本常规优化方案旨在简化使用Mitometer进行线粒体分析的流程，因为该工具在用户输入与数据输出之间具有良好的平衡性。此前已有文献对多种线粒体图像分析工具进行了全面比较10。尽管其他分析流程更侧重于线粒体网络和聚集体质量的分析，或膜电位变化的检测，但本文所介绍的新方法能够快速且可靠地表征全细胞的线粒体网络，同时还能区分轴突与胞体中的线粒体，这一特性在神经科学领域具有重要应用价值。

MATLAB 应用程序 Mitometer9 可分析图像序列中的线粒体：从序列的每一时间帧和 z 平面中减去弥散背景，然后与高斯核进行卷积以消除高频噪声，再通过强度阈值处理生成分割后的线粒体掩膜。理想参数设置可在最大化识别线粒体中位数的同时，最小化图像相邻时间帧之间线粒体数量和面积的波动，并根据平移运动将前一帧中的线粒体分配至其对应的轨迹中。

分化的 SH-SY5...

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披露

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作者声明无任何利益冲突。

致谢

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图像采集在iBiMED的LiM设施中进行，该设施是PPBI（葡萄牙生物成像平台）的一个节点：POCI-01-0145-FEDER-022122。本工作得到FCT（EXPL/BTM-SAL/0902/2021）、LCF（CI21-00276）、葡萄牙科学与技术基金会（Fundação para a Ciência e Tecnologia）向DT提供的资助（2020.02006.CEECIND）、ATG-The Gabba校友协会向VP提供的资助，以及阿威罗大学生物医学研究所-iBiMED的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AM580Sigma-AldrichA8843
BDNF Thermo-FisherRP8642
BMS493Tocris Bioscience 3409
CD2314Tocris Bioscience3824
Ch55Tocris Bioscience 2020
胎牛血清Thermo-Fisher10270106
GraphPad Prism v4.0GraphPad Software, La Jollan/a
Ham’s F12 营养混合物Thermo-Fisher21765029
MATLAB R2022a MathWorksn/a
最低必需培养基Thermo-Fisher31095
Nunc 玻璃底培养皿Thermo-Fisher150680
磷酸盐缓冲液Thermo-Fisher28372
视黄酸Sigma-Aldrich R2625
TMRM Thermo-FisherT668
Zeiss LSM 510Carl Zeissn/a配备活细胞成像培养室和 63 倍油浸物镜 

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
  2. Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
  3. Clare, D. K., Saibil, H. R. ATP-driven molecular chaperone machines. Biopolymers. 99 (11), 846-859 (2013).
  4. Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
  5. Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
  6. Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
  7. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
  8. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754(2013).
  9. Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
  10. Chu, C. -H., Tseng, W. -W., Hsu, C. -M., Wei, A. -C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775(2022).
  11. Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
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