Methodenartikel

Optimierte automatisierte Analyse der homöostase-Modulation lebender neuronaler Mitochondrien durch isoformspezifische Retinsäurerezeptoren

DOI:

10.3791/65452

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28. Juli 2023

 ,  ,  , 
1Neuroscience and Signalling Laboratory, Institute of Biomedicine (iBiMED), Department of Medical Sciences, University of Aveiro

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das mitochondriale Netzwerk ist extrem komplex, was die Analyse sehr schwierig macht. Ein neuartiges MATLAB-Tool analysiert konfokal abgebildete Mitochondrien in Zeitrafferbildern, führt jedoch zu einem großen Ausgabevolumen, das individuelle manuelle Aufmerksamkeit erfordert. Um dieses Problem zu lösen, wurde eine Routineoptimierung entwickelt, die eine schnelle Dateianalyse ermöglicht.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das komplexe mitochondriale Netzwerk macht es sehr schwierig, lebende Zellen zu segmentieren, zu verfolgen und zu analysieren. MATLAB-Tools ermöglichen die Analyse von Mitochondrien in Zeitrafferdateien und vereinfachen und beschleunigen den Prozess der Bildverarbeitung erheblich. Nichtsdestotrotz produzieren bestehende Werkzeuge ein großes Ausgabevolumen, das individuelle manuelle Aufmerksamkeit erfordert, und einfache Versuchsaufbauten haben eine Ausgabe von Tausenden von Dateien, die jeweils eine umfangreiche und zeitaufwändige Handhabung erfordern.

Um diese Probleme zu lösen, wurde eine routinemäßige Optimierung entwickelt, sowohl in MATLAB-Code- als auch in Live-Skript-Form, die eine schnelle Dateianalyse ermöglicht und das Lesen und die Datenverarbeitung von Dokumenten erheblich reduziert. Mit einer Geschwindigkeit von 100 Dateien/min ermöglicht die Optimierung eine insgesamt schnelle Analyse. Die Optimierung erzielt die Ergebnisse durch die Mittelung rahmenspezifischer Daten für einzelne Mitochondrien über Zeiträume hinweg und analysiert die Daten auf definierte Weise, die mit den Ergebnissen bestehender Tools übereinstimmt. Die konfokale Live-Bildgebung wurde mit dem Farbstoff Tetramethylrhodaminmethylester durchgeführt, und die Routineoptimierung wurde durch die Behandlung neuronaler Zellen mit Retinsäurerezeptor (RAR)-Agonisten validiert, deren Auswirkungen auf neuronale Mitochondrien in der Literatur nachgewiesen sind. Die Ergebnisse stimmten mit der Literatur überein und ermöglichten eine weitere Charakterisierung des mitochondrialen Netzwerkverhaltens als Reaktion auf die isoformspezifische RAR-Modulation.

Diese neue Methodik ermöglichte eine schnelle und validierte Charakterisierung des Mitochondriennetzwerks von Ganzneuronen, aber auch die Unterscheidung zwischen Axon- und Zellkörpermitochondrien, ein wesentliches Merkmal für die Anwendung im neurowissenschaftlichen Bereich. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auf Experimente mit schnell wirkenden Behandlungen angewendet werden, die die Bildgebung derselben Zellen vor und nach Behandlungen ermöglichen und über das Gebiet der Neurowissenschaften hinausgehen.

Einleitung

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Zelluläre Mitochondrien befinden sich im Zentrum aller physiologischen Zustände, und ein gründliches Verständnis ihrer Homöostase (Mitostase) und ihres Verhaltens ist von größter Bedeutung, um eine pharmakologische Behandlung für eine Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Krebs und Alzheimer, zu identifizieren 1,2.

Mitochondrien spielen eine entscheidende zelluläre Rolle bei der Energiehomöostase, der ATP-Erzeugung, der Kalziumpufferung und der ROS-Regulation, und die Mitostase ist für die Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase unerlässlich, da molekulare Chaperone energieabhängig sind3. Diese erfordern eine konstante und dynamische Netzwerkmodulation und -anpassung, um die zellulären Bedürfnisse effizient zu erfüllen, und der Mitochondrientransport wird durch verschiedene Signalwege reguliert; frühere Arbeiten haben einen solchen Signalweg beschrieben, den der Retinsäurerezeptoren (RARs)4,5. Retinsäure (RA) fördert das Wachstum von Axonen und Neuriten durch RAR-Aktivierung. In primären kortikalen Neuronen der Maus fördert die Aktivierung von RAR-β das mitochondriale Wachstum, die Geschwindigkeit und die Beweglichkeit im Neuriten6.

In Anbetracht der Anpassungsfähigkeit und Dynamik des mitochondrialen Netzwerks ist die Möglichkeit, die Mitostase in "Echtzeit" zu bewerten, nicht nur für die Untersuchung der Energiehomöostase, sondern auch für die Proteostase, die Zellgesundheit, die Proliferation oder die Signalübertragung unerlässlich. Eine häufig verwendete Methode zur Beurteilung der Mitostase beruht auf der konfokalen Mikroskopie nach Hervorhebung der Mitochondrien mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder -marker sowie einem spezifischen Mikroskopieaufbau, der eine Temperatur- und/oder CO2 -Regulierung ermöglicht7. Bei dieser Art von Versuchsaufbau wird jeweils eine experimentelle Wiederholung durchgeführt. Zusätzlich zur experimentellen Wiederholung verschiedener Behandlungen sollte berücksichtigt werden, dass die meisten Experimente ihre technischen Replikate haben sollten (bei denen mehr als eine Position pro Platte abgebildet wird), wobei eine Reihe von Fokusebenen (z-Stapeln) in einer Reihe von Zeitpunkten aufgezeichnet wird. So ergibt ein Versuchsdesign mit drei Wiederholungen einer Kontrolle und zwei Behandlungen, mit fünf Bildgebungspositionen pro Platte und 15 Zeitpunkten, 225 zu bearbeitende Stacks. Klassischerweise wurden Videos von lebenden Mitochondrien analysiert, indem Kymographen geplottet wurden, die einzeln analysiert wurden8, in einem zeitaufwändigen Prozess, der umfangreiche manuelle Eingaben erforderte, selbst wenn man sich auf Computertools stützte.

Kürzlich wurde ein Algorithmus beschrieben9 , der eine automatisierte Segmentierung und Verfolgung von Mitochondrien in lebenden 2D- und 3D-Zeitrafferdateien ermöglicht. Es gibt andere Quantifizierungstechniken, die alle ihre Grenzen haben10. Mitometer, eine automatisierte Open-Source-Anwendung, eignet sich besonders für Zeitraffer- und Mitochondriendynamikanalysen, die nur geringe Benutzereingaben erfordern. Diese Anwendung hat eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen bestehenden MATLAB-basierten Werkzeugen, nämlich die automatische Verarbeitung einzelner TIF-Stacks unter Verwendung von bis zu 13 verschiedenen Parametern, was besonders für die Neurowissenschaften interessant ist, da sie zwischen peri- und telenukleären Mitochondrien unterscheidet.

Bei einem Experiment wie dem oben beschriebenen ergeben diese 13 Parameter, die auf 225 Stapel angewendet werden, jedoch 2.925 einzelne Ausgabedateien. Diese erfordern vier einzelne Computereingaben, was sich auf über 10.000 manuelle Eingaben summiert, die zum Herunterladen aller Ausgabedateien erforderlich sind. Bei großen Versuchsdesigns führt dies zu einer unnötig extrem zeitaufwändigen Analyse jeder Datei und Datenintegration. Hier stellen wir eine Routineoptimierung vor, die eine schnelle Dateianalyse ermöglicht, das Lesen und die Datenverarbeitung von Dokumenten erheblich reduziert und Daten auf definierte Weise analysiert, die mit der Ausgabe bestehender Tools übereinstimmt.

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Protokoll

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HINWEIS: Dieses Protokoll besteht aus zwei Hauptschritten: einem Nasslaborschritt, der Zellkultur und konfokale Lebendmikroskopie umfasst, um Bilder von lebenden Mitochondrien zu erhalten (Abbildung 1), und einem In-silico-Schritt zur Analyse der erhaltenen Bilder (Abbildung 2). Für die automatisierte Datenanalyse von 3D-Live-Mitochondrien wurde die MATLAB-Anwendung Mitometer verwendet, wie sie von Lefebvre et al.9 bereitgestellt wurde. Die Routineoptimierung ist in MATLAB geschrieben. Die Software, aktualisierte Versionen und die Verarbeitung von ImageJ-Makros sind online über GitHub unter https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB frei verfügbar.

1. Live-Mikroskopie

figure-protocol-1
Abbildung 1: Versuchsprotokoll. SH-SY5Y-Zellen wurden differenziert und mit Retinoiden behandelt. (A) TMRM wurde verwendet, um gesunde Mitochondrien in behandelten Zellen mit einem konfokalen Mikroskop live abzubilden, wobei ein Zeitraffer-Z-Stapel von fünf Gesichtsfeldern aufgenommen wurde. (B) Mitometer-Anwendung MATLAB segmentiert und analysiert automatisch Mitochondrienbilder. Zusätzlich zur Analyse unterscheidet diese Software automatisch Mitochondrien nach Kernnähe. Blaue Punkte sind mitochondriale Anfangspositionen; Rote Punkte sind Endpositionen. Maßstabsbalken = 30 μm. Abkürzung: TMRM = Tetramethylrhodamin, Methylester. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Zellkultur
    1. Inkubieren Sie SH-SY5Y-Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO2 und 95 % Luft, kultiviert zu gleichen Teilen aus MEM (Minimal Essential Medium) und F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS).
    2. SH-SY5Y-Zellen in Glasboden-Zellschalen mit einer Dichte von 15 × 104 Zellen/ml aufteilen.
    3. Differenzieren Sie die Zellen mit einer 5-tägigen Behandlung mit 10 μM all-trans-Retinsäure in 1 % FBS-haltigem Kulturmedium, gefolgt von einer 2-tägigen Behandlung mit 10 ƞg/ml brain-derived neurotrophic factor (BDNF).
  2. Zellbehandlung
    1. Waschen Sie die Zellen mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und behandeln Sie sie 72 h lang mit 10-7 M RAR-Isoform-Agonisten, zu gleichen Teilen aus MEM (Minimal Essential Medium) und F12 (Ham's F12 Nutrient Mix) Medium, ergänzt mit 1% FBS.
      HINWEIS: Der verwendete RARα-Agonist war AM580; Der verwendete RARβ-Agonist war CD2314; Ch55 wurde als Agonist als RARα und β Co-Agonist verwendet; beiRA wurde als Positivkontrolle verwendet; BMS493 wurde als RAR-Pan-Antagonist verwendet.
  3. Konfokale Live-Bildgebung
    1. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches 1% FBS-haltiges Kulturmedium mit 20 nM Tetramethylrhodamin, Methylester (TMRM) für 45 Minuten.
      HINWEIS: TMRM ist ein zellpermeierter Fluoreszenzfarbstoff, der von aktiven Mitochondrien sequestriert wird, und diese Inkubationszeit ermöglicht es TMRM, ein Gleichgewicht zu erreichen und von polarisierten Mitochondrien aufgenommen zu werden11. Die Bildgebung sollte begonnen werden, bevor ein Gleichgewicht hergestellt ist, da die TMRM-Signalintensität während der Bildgebung künstlich ansteigen könnte.
    2. Legen Sie die Zellen in einen Inkubator, der an ein konfokales Laserscanning-Mikroskop bei 37 °C angeschlossen ist.
    3. Erfassen Sie Bilder mit einem 63-fachen Öl-Immersions-Apochromat-Objektiv mit einer Bildgröße von 512 x 512 Pixeln , die mit einer Lochblende von 1 luftigen Einheit erhalten wurden, und erfassen Sie eine Zeitreihe von 15 Bildern aus fünf verschiedenen Gesichtsfeldern in jeder Zellplatte und einen Z-Stapel von 8 äquidistanten Z-Ebenen. Die resultierende LSM-Datei ist ein Zeit-, Positions- und Z-Stapel.
      HINWEIS: Die Einstellungen für Verstärkung, Kontrast und Helligkeit müssen zunächst mit der minimalen Laserleistung optimiert werden, die erforderlich ist, um den gesamten Dynamikbereich des Detektors zu nutzen, und während der gesamten Studie konstant gehalten werden, um sicherzustellen, dass alle Bildgebungen unter den gleichen Bedingungen durchgeführt werden. In dieser Hardware-Software-Kombination können bis zu neun verschiedene Positionen aufgezeichnet werden und das Mikroskop wechselt automatisch zwischen den Aufnahmepositionen.

2. Bildanalyse

figure-protocol-2
Abbildung 2: Routineoptimierung. (A) Repräsentativer Code der Routineoptimierung. (B) Live-Skript zur Routineoptimierung. (C) Routinemäßiger Optimierungsworkflow. (D) Validierung der Ergebnisse der Routineoptimierung: repräsentatives Bild der Mitochondrien in unbehandelten Zellen (linkes Bild), behandelt mit RA(10-7 M, 72 h, mittleres Bild) und behandelt mit dem RAR-Antagonisten BMS493 (10-7 M, 72 h, rechtes Bild), aufgenommen nach Inkubation mit TMRM (20 nM, 45 min Inkubation). Maßstabsbalken = 30 μm. (E) TMRM-Intensität in Zellkörpermitochondrien. Signifikante Abnahme bei all-trans-Retinsäure-Behandlung (beiRA, 10-7 M, 72 h) im Vergleich zur Kontrollgruppe (p = 0,0062), nicht beobachtet bei Behandlung mit RAR-Antagonisten (BMS493, 10-7 M, 72 Stunden). Fünf Zellen wurden aus jeder der drei Wiederholungen pro Bedingung quantifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Bildverarbeitung
    1. Öffnen Sie Dateien in ImageJ 2.1.0 und trennen Sie Stapel nach Sichtfeld: Öffnen Sie ImageJ und klicken Sie auf Menüleiste | Bild | Duplizieren | Eingabe-Slices/Frame-Nummer | In Ordnung.
      HINWEIS: Um sich wiederholende Eingaben in die Software zu reduzieren, wurde ein ImageJ-Makro entwickelt, um das Duplizieren und Speichern von Gesichtsfeldbildern zu erleichtern.
  2. Makro-Protokoll
    1. Zeichnen Sie mit dem freien Auswahlwerkzeug einen Interessenbereich (ROI) um die Zelle.
    2. Führen Sie das Makro aus, indem Sie ImageJ öffnen und zu Menüleiste navigieren | Plugins | Makros | Führen Sie das Makro Hintergrund löschen und Bilder speichern aus.
      HINWEIS: Bei diesem Prozess können Bilder nach dem Zufallsprinzip ausgewählt werden, wobei der Lösungsschlüssel gemäß den Optimierungsanforderungen gespeichert wird.
    3. Bestimmen Sie die Pixelgröße und die Voxeltiefe: Öffnen Sie ImageJ | das Bild und navigieren Sie zu Menüleiste | Bild | Eigenschaften.
  3. Alternatives direktes Protokoll
    HINWEIS: Diese Alternative verwendet kein Makro zum Verarbeiten von Bildern
    1. Ermitteln der Pixelgröße und Voxeltiefe: Öffnen Sie ImageJ | Bild öffnen und zu Menüleiste navigieren | Bild | Eigenschaften.
    2. Zeichnen Sie mit dem freien Auswahlwerkzeug eine ROI um die Zelle herum und stellen Sie sicher, dass sie die gesamte Zelle in den 15 Frames umfasst.
    3. Navigieren Sie zur Menüleiste | Bearbeiten | Draußen klar.
    4. Navigieren Sie zur Menüleiste | Datei | Speichern unter | Wählen Sie Tiff aus.
    5. Wählen Sie Ordner speichern und klicken Sie auf Speichern.
      HINWEIS: Bilder können an dieser Stelle manuell verblindet/randomisiert werden, bevor mit der Analyse fortgefahren wird.
  4. Automatisierte Bildanalyse
    1. Bereiten Sie die Ordner für Analysedateien vor.
      1. Erstellen Sie drei Hauptordner mit den Titeln "Alle Titel", "Perinukleare Spuren" und "Telenuklearspuren".
        HINWEIS: Diese entsprechen den wichtigsten automatisierten Track-Optionen.
      2. Erstellen Sie in jedem Hauptordner einen Unterordner für jedes zu verarbeitende Bild, der numerisch von 1 aufwärts identifiziert wird.
      3. Fügen Sie jedem Image-Ordner eine Kopie der beiden ergänzenden Dateien zur Routinenoptimierung (mitometer2table.m und getTXTfiles.m) hinzu.
        HINWEIS: Diese Dateien helfen bei der Datenanalyse und der endgültigen Formatanordnung. Die Anzahl der Ordner muss mit der Anzahl der Elemente in der zufälligen Tabelle (.xlsx) übereinstimmen. Nachdem Sie alle nummerierten Unterordner mit ergänzenden Dateien für einen Datensatz erstellt haben, können diese im Stapel kopiert und in die verbleibenden Datensätze eingefügt werden.
  5. Verwenden Sie die MATLAB-Anwendung Mitometer, um Bilder zu analysieren.
    HINWEIS: Dieses Protokoll wurde auf einem Mitometer ausgeführt, das auf MATLAB R2022a installiert ist. Laden Sie Bilder in Stapeln von 30 für eine optimale Zeit- und Ausgabebalance. Die maximale MAT-Dateigröße wird durch das native Dateisystem vorgegeben: Standardmäßig können "Speichern"-Operationen eine Datei < 231 Bytes (~2 GB) erstellen; Das Speicherformat MAT-Files Version 7.3 kann stattdessen verwendet werden, da es maximale Variablengrößen von mehr als 2 GB zulässt.
    1. Identifizieren/Ändern der Standardversion der MAT-Datei: Klicken Sie auf der Registerkarte Start im Abschnitt Umgebung auf Einstellungen und wählen Sie MATLAB | Allgemein | MAT-Akten.
    2. Verwenden Sie das MATLAB-Tool Mitometer zur Analyse: Öffnen Sie MATLAB und navigieren Sie zur Menüleiste | APPS | Offenes Mitometer | Wählen Sie Start 3D | Eingabedaten (Pixelgröße (μm): 0,1395089 / Zeit zwischen den Bildern (s): 2 / Anzahl der Z-Ebenen: 8 / Axialer Abstand zwischen den Z-Ebenen (μm): 0,418809 | Wählen Sie die einzugebenden Bilder aus.
    3. Gehen Sie zum Mitometer-Seitenmenü, wählen Sie Bild aus, klicken Sie auf Hervorgehoben auswählen, navigieren Sie zur Mitometer-Menüleiste | Auswählen von Titeln | Ansichten verfolgen | Wählen Sie All-Tracks, Telenuclear oder Perinuclear | mitometer Menüleiste | Wählen Sie Analyse | Wählen Sie ein Element (z. B. Länge) | Wählen Sie Speichern unter ".txt".
      HINWEIS: Es können mehrere Parameter gleichzeitig heruntergeladen werden, wenn sie gleichzeitig ausgewählt werden.
    4. Extrahieren Sie die Ergebnisdateien in die erstellten Ordner (2.2.1).
  6. Routineoptimierung und Datenanalyse
    1. Vorbereiten/Anpassen der "Randomization.xlsx"-Datei, die den Schlüssel für die Bildkodierung enthält.
      1. Fügen Sie eine Liste aufeinanderfolgender ganzer Zahlen von 1 aufwärts in Spalte A ein.
        HINWEIS: Es ist ratsam, einen duplizierten Ordner mit ursprünglich benannten Bildern aufzubewahren.
      2. Platzieren Sie die analytischen Variablen in Spalte B, die aus alphanumerischen Zeichen besteht.
        HINWEIS: Die Anzahl der Zeilen im Dokument muss mit der Anzahl der Ordner im Hauptdatensatz übereinstimmen. Kopieren Sie diese "Randomization.xlsx"-Datei und fügen Sie sie in die beiden anderen Hauptdatensätze ein.
    2. Optimierte Datenanalyse
      1. Doppelklicken Sie auf "executable.mlx", geben Sie die Anzahl der Ordner ein, geben Sie das Ordnerverzeichnis an (kopieren Sie das Verzeichnis vom Anfang des Ordners) | das Speicherverzeichnis (kopieren Sie das Verzeichnis vom Anfang des Ordners) | den Tabellenkalkulationsnamen in der Ausgabedatei und klicken Sie auf Ausführen.
      2. Führen Sie bei Bedarf statistische Analysen durch.
        HINWEIS: Die optionale Erstellung einer .xlsx Datei in jedem Ordner mit den .txt Daten und der akustischen Warnung bis zum Ende der Analyse kann ausgewählt werden. Live Script gibt eine einzelne Tabellenkalkulationsdatei in einem Tabellenformat aus. In dieser Ausgabe stellen Spalten analysierte Parameter dar (z. B. "Hauptachsenlänge"; "Intensität") und Linien stellen visuelle Felder analytischer Variablen dar (z. B. "Kontrolle").

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Ergebnisse

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Um die Analyse von Ausgabedateien in .txt Format zu verbessern und zu beschleunigen, wurde eine Routineoptimierung codiert, die Daten liest, die mit den Ausgabedateien von Mitometer .txt übereinstimmen, wobei Spalten einen Rahmen und Linien identifizierte Mitochondrien darstellen. Die Routineoptimierung erzeugt Daten in einem einzigen Wert pro Parameter, indem die Rahmen für jedes identifizierte Mitochondrium gemittelt werden und dann die Ergebnisse aller Mitochondrien pro Gesichtsfeld gemittelt werden. Die entwickelte R...

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Diskussion

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Die Bildgebung lebender Zellen erzeugt große Dateien, die eine ernsthafte Computerverarbeitung erfordern, aber selbst die neuesten Tools erfordern umfangreiche manuelle Eingaben zur Verarbeitung. Diese Routineoptimierung konzentriert sich auf die Vereinfachung des Prozesses der Mitochondrienanalyse auf dem Mitometer, da dieses Tool ein sehr gutes Gleichgewicht zwischen Benutzereingabe und Datenausgabe bietet. Ein umfassender Vergleich zwischen verschiedenen Werkzeugen für die Mitochondrien-Bildanalyse wurde zuvor überprü...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

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Die Bildaufnahme wurde in der LiM-Einrichtung von iBiMED, einem Knoten von PPBI (Portuguese Platform of BioImaging), durchgeführt: POCI-01-0145-FEDER-022122. Diese Arbeit wurde unterstützt durch FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276), ein Stipendium für DT von der Fundação para a Ciência e Tecnologia des Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), ein Stipendium von ATG-The Gabba Alumni Association an VP und das Institute for Biomedicine-iBiMED, University of Aveiro.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AM580Sigma-AldrichA8843
BDNF Thermo-FisherRP8642
BMS493Tocris Bioscience 3409
CD2314Tocris Bioscience3824
Ch55Tocris Bioscience 2020
Fötales RinderserumThermo-Fisher10270106
GraphPad Prism v4.0GraphPad Software, La Jollan/a
Schinken s F12 NährstoffmischungThermo-Fisher21765029
MATLAB R2022a MathWorksn/a
Minimal Essential MediumThermo-Fisher31095
Nunc GlasbodenschalenThermo-Fisher150680
Phosphatpuffer KochsalzlösungThermo-Fisher28372
RetinsäureSigma-Aldrich  R2625
TMRM Thermo-FisherT668
Zeiss LSM 510Carl Zeissn/aAusgestattet mit Lebendzell-Imaging-Kulturkammer und 63x Öl-Immersionsobjektiv 

Referenzen

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