Análise Automatizada Otimizada da Modulação da Homeostase das Mitocôndrias Neuronais Vivas por Receptores de Ácido Retinóico Isoform-Específicos

As mitocôndrias celulares estão no centro de todos os estados fisiológicos, e uma compreensão completa de sua homeostase (mitostase) e comportamento é fundamental para auxiliar na identificação do tratamento farmacológico para uma ampla gama de doenças, incluindo câncer e doença de Alzheimer ^1,2.

As mitocôndrias desempenham papéis celulares cruciais na homeostase energética, geração de ATP, tamponamento de cálcio e regulação de EROs, e a mitostase é essencial para manter a homeostase proteica, uma vez que as chaperonas moleculares são dependentes de energia³. Estes requerem uma modulação e adaptação de rede constante e dinâmica para atender eficientemente às necessidades celulares, e o transporte mitocondrial é regulado por diferentes vias de sinalização; trabalhos anteriores descreveram uma dessas vias, a dos receptores do ácido retinóico (RARs)^4,5. O ácido retinóico (AR) promove crescimento axonal e neurítico via ativação RAR. Em neurônios corticais primários de camundongos, a ativação do RAR-β estimula o crescimento, a velocidade e a mobilidade mitocondrial no neurito⁶.

Considerando a adaptabilidade e dinâmica da rede mitocondrial, a possibilidade de avaliar a mitostase em "tempo real" é essencial não apenas para investigar a homeostase energética, mas também para proteostase, saúde celular, proliferação ou sinalização. Um método comumente utilizado para avaliação de mitostases baseia-se na microscopia confocal após o realce mitocondrial usando um corante ou marcador fluorescente, bem como uma configuração de microscopia específica que permite a regulação da temperatura e/ou do CO₂ ⁷. Esse tipo de arranjo experimental implica que uma réplica experimental seja realizada de cada vez. Além da repetição experimental de diferentes tratamentos, deve-se considerar que a maioria dos experimentos deve ter suas réplicas técnicas (onde mais de uma posição é imageada por placa), com uma série de planos focais (z-stacks) sendo registrados em uma série de pontos de tempo. Assim, um delineamento experimental com três repetições de um controle e dois tratamentos, com cinco posições de imagem por placa, e 15 pontos de tempo, resultou em 225 pilhas a serem processadas. Classicamente, os vídeos de mitocôndrias vivas eram analisados por meio de quimografias plotadas, que seriam analisadas^{individualmente8}, em um processo demorado que exigia extensa entrada manual, mesmo quando dependia de ferramentas computacionais.

Recentemente foi descrito^{um algoritmo 9} que permite segmentação e rastreamento automatizado de mitocôndrias em arquivos time-lapse 2-D e 3-D de células vivas. Outras técnicas de quantificação estão disponíveis e todas apresentam suas limitações¹⁰. O mitômetro, um aplicativo automatizado de código aberto, é particularmente adequado para análise de lapso de tempo e dinâmica mitocondrial, exigindo baixa entrada do usuário. Esta aplicação tem uma série de vantagens sobre outras ferramentas existentes baseadas no MATLAB, nomeadamente permitindo o processamento automático de pilhas TIF individuais, utilizando até 13 parâmetros diferentes, particularmente interessantes para as neurociências, uma vez que diferencia entre mitocôndrias peri e telenucleares.

No entanto, para um experimento como o descrito acima, esses 13 parâmetros aplicados a 225 pilhas resultam em 2.925 arquivos de saída individuais. Estes requerem quatro entradas de computador individuais, que somam mais de 10.000 entradas manuais sendo necessárias para baixar todos os arquivos de saída. Para grandes projetos experimentais, isso resulta em uma análise desnecessariamente extremamente demorada de cada arquivo e integração de dados. Aqui apresentamos uma rotina de otimização que permite a análise rápida de arquivos, reduzindo consideravelmente a leitura de documentos e o processamento de dados, analisando os dados de forma definida, consistente com a saída das ferramentas existentes.

OBS: Este protocolo tem duas etapas principais: uma etapa de laboratório úmido, envolvendo cultura de células e microscopia confocal viva para obtenção de imagens de mitocôndrias vivas (Figura 1) e uma etapa in silico para análise das imagens obtidas (Figura 2). Para a análise automatizada dos dados de mitocôndrias com imagens ao vivo em 3D, foi utilizado o mitômetro de aplicação MATLAB, conforme fornecido por Lefebvre et ^al.9. A otimização de rotina é escrita no MATLAB. O software, as versões atualizadas e o processamento de Macros ImageJ estão disponíveis gratuitamente on-line através do GitHub, no https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB.

1. Microscopia ao vivo

Figura 1: Protocolo experimental. As células SH-SY5Y foram diferenciadas e tratadas com retinoides. (A) TMRM foi usado para imagens vivas de mitocôndrias saudáveis em células tratadas usando um microscópio confocal, capturando um z-stack de lapso de tempo de cinco campos visuais. (B) Aplicação de mitômetro O MATLAB segmenta e analisa automaticamente as imagens das mitocôndrias. Além de analisar, este software discrimina automaticamente as mitocôndrias de acordo com a proximidade nuclear. Os pontos azuis são posições iniciais mitocondriais; pontos vermelhos são posições finais. Barra de escala = 30 μm. Abreviação: TMRM = tetrametilrodamina, éster metílico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Cultura celular
   1. Incubar células SH-SY5Y a 37 °C em atmosfera umidificada de 5% de CO₂ e 95% de ar, cultivadas em partes iguais de meio MEM (Minimal Essential Medium) e F12 (Ham's F12 Nutrient Mix), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS).
   2. Células SH-SY5Y em placas de células com fundo de vidro a uma densidade de 15 × 10⁴ células/mL.
   3. Diferenciar células com 5 dias de tratamento com 10 μM de ácido all-trans retinóico em meio de cultura contendo FBS a 1%, seguido de 2 dias de tratamento com 10 ƞg/mL de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF).
2. Tratamento celular
   1. Lavar as células com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) e tratar por 72 h com agonistas isoformes de RAR ^10-7 M, em partes iguais de meio MEM (Minimal Essential Medium) e F12 (Ham's F12 Nutrient Mix), suplementado com FBS a 1%.
      LEGENDA: O agonista RARα utilizado foi o AM580; O agonista RARβ utilizado foi o CD2314; Ch55 foi usado como agonista como RARα e β co-agonista; emA AR foi utilizada como controle positivo; BMS493 foi usado como pan-antagonista RAR.
3. Imagem confocal ao vivo
   1. Substitua o meio de cultura por meio de cultura fresco contendo FBS a 1% por tetrametilrodamina 20 nM, éster metílico (TMRM) por 45 min.
      NOTA: O TMRM é um corante fluorescente pertençoso por células, sequestrado por mitocôndrias ativas, e esse período de incubação permite que o TMRM atinja um equilíbrio e seja absorvido por mitocôndrias polarizadas¹¹. A aquisição de imagens deve ser iniciada antes que o equilíbrio seja estabelecido, pois a intensidade do sinal TMRM pode aumentar artificialmente durante a aquisição de imagens.
   2. Colocar as células numa incubadora ligada a um microscópio confocal de varredura a laser a 37 °C.
   3. Capture imagens usando uma objetiva apocromática de imersão em óleo de 63x, com um tamanho de imagem de 512 x 512 pixels obtida com uma abertura pinhole de 1 unidade arejada, capturando uma série temporal de 15 quadros de cinco campos visuais diferentes em cada placa celular, e uma pilha z de 8 planos z equidistantes. O arquivo .lsm resultante é uma pilha de tempo, posição e z.
      NOTA: As configurações de ganho, contraste e brilho devem ser inicialmente otimizadas usando a potência mínima do laser necessária para usar toda a faixa dinâmica do detector e mantidas constantes durante todo o estudo, garantindo que todas as imagens sejam realizadas nas mesmas condições. Até nove posições diferentes podem ser registradas nesta combinação hardware-software e os ciclos do microscópio entre as posições de imagem automaticamente.

2. Análise das imagens

Figura 2: Otimização de rotina. (A) Código representativo da otimização de rotina. (B) Otimização de rotina Live-Script. (C) Fluxo de trabalho de otimização de rotina. (D) Validação dos resultados da otimização de rotina: imagem representativa das mitocôndrias em células não tratadas (painel esquerdo), tratadas com RA (^10-7 M, 72 h, painel médio) e tratadas com antagonistaRAR BMS493 (^10-7 M, 72 h, painel direito), obtida após incubação com TMRM (20 nM, 45 min de incubação). Barra de escala = 30 μm. (E) TMRM Intensidade em mitocôndrias do corpo celular. Redução significativa com o tratamento com ácido trans-retinóico (AR, ^10-7 M, 72 h), em comparação com o controle (p=0,0062), não observada quando tratada com antagonista RAR (BMS493, ^10-7 M, 72 horas). Cinco células foram quantificadas de cada uma das três repetições por condição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Processamento de imagens
   1. Abra arquivos no ImageJ 2.1.0 e separe pilhas de posição por campo visual: Abra o ImageJ e clique em Barra de menus | Imagem | Duplicar | Fatias de entrada/número de quadro | Está bem.
      NOTA: Para diminuir as entradas repetitivas para o software, um ImageJ Macro foi desenvolvido para facilitar a duplicação e salvamento de imagens de campo visual.
2. Protocolo de macro
   1. Desenhe uma região de interesse (ROI) ao redor da célula com a ferramenta de seleção gratuita.
   2. Execute a macro abrindo o ImageJ e navegando até a Barra de Menus | Plugins | Macros | Execute Limpar o plano de fundo e salvar imagens macro.
      NOTA: As imagens podem ser randomizadas neste processo, armazenando a chave da solução de acordo com os requisitos de otimização.
   3. Determine o tamanho do pixel e a profundidade do voxel: Abra o ImageJ | a Imagem e navegue até a Barra de Menus | Imagem | Propriedades.
3. Protocolo direto alternativo
   Observação : essa alternativa não usa macro para processar imagens
   1. Encontre o tamanho do pixel e a profundidade do voxel: Abra o ImageJ | Abra a Imagem e navegue até a Barra de Menus | Imagem | Propriedades.
   2. Desenhe um ROI ao redor da célula com a ferramenta de seleção gratuita, garantindo que ela abranja toda a célula ao longo dos 15 quadros.
   3. Navegue até a barra de menus | Editar | Limpe do lado de fora.
   4. Navegue até a barra de menus | Arquivo | Salvar como | Selecione Tiff.
   5. Selecione Salvar pasta e clique em Salvar.
      NOTA: As imagens podem ser cegas/randomizadas manualmente neste ponto antes de continuar a análise.
4. Análise automatizada de imagens
   1. Prepare as pastas para arquivos de análise.
      1. Crie três pastas principais, intituladas "Todas as faixas", "Trilhas perinucleares" e "Trilhas telenucleares".
         NOTA: Eles correspondem às principais opções de faixa automatizada.
      2. Em cada pasta principal, crie uma subpasta para cada imagem a ser processada, identificada numericamente de 1 para cima.
      3. Adicione uma cópia dos dois arquivos suplementares de otimização de rotina (mitometer2table.m e getTXTfiles.m) a cada pasta de imagem.
         NOTA: Esses arquivos ajudam na análise de dados e na disposição final do formato. O número de pastas deve corresponder ao número de elementos na planilha aleatória (.xlsx). Depois de criar todas as subpastas numeradas com arquivos suplementares para um conjunto de dados, elas podem ser copiadas em lote e coladas nos conjuntos de dados restantes.
5. Use o aplicativo MATLAB Mitometer para analisar imagens.
   NOTA: Este protocolo foi executado em um mitômetro, instalado no MATLAB R2022a. Carregue imagens em lotes de 30 para otimizar o tempo de execução e o equilíbrio de saída. O tamanho máximo do arquivo MAT é imposto pelo sistema de arquivos nativo: por padrão, as operações de "salvar" podem criar um arquivo < 2³¹ bytes (~2 GB); salvar formato MAT-Files Versão 7.3 pode ser usado em vez disso, pois permite tamanhos variáveis máximos maiores do que 2 GB.
   1. Identificar/alterar a versão padrão do arquivo MAT: Na guia Página Inicial da seção Ambiente, clique em Preferências e selecione MATLAB | Geral | Arquivos MAT.
   2. Use a ferramenta MATLAB Mitometer para analisar: Abra o MATLAB e navegue até a Barra de menus | APLICATIVOS | Miômetro Aberto | Selecione Iniciar 3D | Dados de entrada (Tamanho do pixel (μm): 0,1395089/Tempo entre quadros (s): 2/Número z-planos: 8/Distância axial entre z-planos (μm): 0,418809 | Selecione as imagens a serem inseridas.
   3. Vá para o Menu Lateral do Mitômetro, selecione Imagem, clique em Selecionar Realçado, navegue até a Barra de Menus do mitômetro | Selecionar faixas | Rastrear visualizações | selecione All-Tracks, Telenuclear ou Perinuclear | mitômetro Barra de Menus | Selecionar Análise | Escolha um elemento (ou seja, Comprimento) | selecione Salvar em ".txt".
      Observação : mais de um parâmetro pode ser baixado de uma só vez, se selecionado concomitantemente.
   4. Extraia arquivos de resultado para as pastas criadas (2.2.1).
6. Otimização de rotina e análise de dados
   1. Prepare/adapte o arquivo "Randomization.xlsx" que contém a chave para codificação de imagem.
      1. Insira uma lista de inteiros consecutivos, de 1 para cima, na coluna A.
         NOTA: É aconselhável manter uma pasta duplicada com imagens originalmente nomeadas.
      2. Coloque as variáveis analíticas na coluna B, composta por caracteres alfanuméricos.
         Observação : o número de linhas no documento deve ser consistente com o número de pastas presentes no conjunto de dados principal. Copie e cole esse arquivo "Randomization.xlsx" nos outros dois conjuntos de dados principais.
   2. Análise de dados otimizada
      1. Clique duas vezes em "executable.mlx", insira o número de pastas, especifique o diretório de pastas (copie o diretório da parte superior da pasta) | o diretório de salvamento (copie o diretório da parte superior da pasta) | o nome da planilha no arquivo de saída e clique em Executar.
      2. Realizar análise estatística conforme necessário.
         Observação : criação opcional de um arquivo de .xlsx em cada pasta com os dados .txt e som alerta para o final da análise pode ser selecionado. O Live Script gera um único arquivo de planilha em um formato de tabela. Nessa saída, as colunas representam os parâmetros analisados (por exemplo, "Comprimento do eixo principal"; "Intensidade") e linhas representam campos visuais de variáveis analíticas (por exemplo, "Controle").

Para aprimorar e acelerar a análise de arquivos de saída em .txt formato, foi codificada uma rotina de otimização que lê dados consistentes com os arquivos de saída do Mitometer .txt, com colunas representando um quadro e linhas representando mitocôndrias identificadas. A otimização de rotina produz dados em um único valor por parâmetro, calculando a média dos quadros para cada mitocôndria identificada e, em seguida, calculando a média dos resultados de todas as mitocôndrias por campo visual. A rotina desenvolvida lê arquivos de pastas numeradas de 1 para cima. A Otimização de Rotina do Live Script gera um único arquivo de planilha em um formato de tabela. Nessa saída, as colunas representam os parâmetros analisados (por exemplo, "Comprimento do eixo principal"; "Intensidade") e linhas representam campos visuais de variáveis analíticas (por exemplo, "Controle").

Resultados publicados anteriormente descrevem a diminuição do potencial de membrana mitocondrial no corpo celular de culturas neuronais primárias e o aumento do movimento axonal mitocondrial após ativaçãoβ RAR6.

Tratamentos semelhantes foram realizados em células SH-SY5Y de neuroblastoma diferenciado, tratadas com agonistas e antagonistas dos receptores do ácido retinóico por 72 h (Figura 3). Os dados coletados foram plotados e analisados por meio do teste t de Student não direcional, bicaudal, 2 amostras, variância igual. Foram feitas comparações, no arquivo da planilha de saída, entre os grupos apropriados, com α = 0,05.

Figura 3: Regulação da homeostase mitocondrial por sinalização retinoide isoform-específica. (A) Imagem representativa das mitocôndrias após o tratamento (parte superior), respectivo gráfico de superfície (meio) e segmentação automatizada (inferior). Os pontos azuis são posições iniciais mitocondriais; pontos vermelhos são posições finais. Barras de escala = 30 μm. (B) Mapa de calor resumindo todas as variações encontradas nos parâmetros mitocondriais; Houve variância significativa entre o corpo celular e o neurito (ANOVA two-way, p=0,0158), com influência significativa da modulação isoformo-específica do RAR em todas as mitocôndrias (ANOVA two-way, p=0,0082). (C) Comprimento mitocondrial - observou-se diminuição significativa nas células tratadas com AM580 (p=0,0179). (D) Área de superfície mitocondrial - reduções significativas foram observadas nas células tratadas com AM580 (p=0,000406) e com BMS493 (p=3,01 × 10-8). (E) Intensidade da TMRM, normalizada para volume mitocondrial - reduções significativas foram encontradas nas células tratadas com AR (p=0,00621) e Ch55 (p=0,000542). * p < 0,05; ** p < 0,01; # p < 0,0001. Cinco células foram quantificadas de cada uma das três repetições por condição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A análise revela que o tratamento de células SH-SY5Y diferenciadas com oagonista α RAR AM580 resulta em uma diminuição no comprimento médio e na área de superfície das mitocôndrias; esse efeito não foi encontrado quando se tratou com agonistas para outras isoformas que não exclusivamenteα RAR, mas houve uma redução interessante de 35,42 ± 0,5% na área de superfície mitocondrial após o tratamento com o pan-antagonista RAR BMS493 (p = 3,01 x 10-8). Em contraste, os retinóides parecem ter um efeito oposto em termos de intensidade da TMRM, que se relaciona com a polarização da membrana mitocondrial11: enquanto o tratamento comα agonista RAR parece não ter um efeito significativo na intensidade da TMRM, o tratamento com pan-agonista RAR naAR resulta em uma redução dramática de 54,82 ± 18,01% (p=0,00621). Essa diminuição também é encontrada após o tratamento com RARα/β agonista CH55 (28,99 ± redução de 4,97%, p=0,000542), e possivelmente também após o tratamento com RARβ agonista específico CD2314 (37,01 ± redução de 28,96%, p=0,09134). É importante ressaltar que este método diferenciou as mitocôndrias axonais das do corpo celular, permitindo o estudo do estímulo RAR isoform-específico e da modulação mitocondrial.

Figura 4: Mínimo fotoclareamento ao longo do protocolo de imagem. (A) Timelapses Z-stack foram processados em FIJI, e projeções z-project de intensidades médias foram exportadas para todos os momentos. (B) Um perfil do eixo z do mesmo processamento foi plotado de acordo com o tempo. (C) Quantificação do fotobranqueamento para montagem experimental. Não foram observadas alterações significativas (p = 0,7607; teste t pareado para intensidade média do sinal do primeiro e do último quadro). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.