Aquí, presentamos protocolos para trabajar con Limosilactobacillus reuteri DSM20016, detallando el crecimiento, la transformación de plásmidos, la PCR de colonias, la medición de proteínas reporteras fluorescentes y la mini-preparación limitada de plásmidos, así como problemas comunes y solución de problemas. Estos protocolos permiten la medición de proteínas reporteras en DSM20016, o la confirmación a través de PCR de colonias si no hay ningún informador involucrado.
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Artículo de método
Métodos para la electroporación y confirmación de transformación en Limosilactobacillus reuteri DSM20016
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Resumen
Resumen
Lactobacillus era un género increíblemente grande y diverso de bacterias que comprendía 261 especies, varias de las cuales eran cepas comensales con el potencial de su uso como chasis para esfuerzos biológicos sintéticos dentro del tracto gastrointestinal. La amplia variación fenotípica y genotípica observada dentro del género condujo a una reciente reclasificación y la introducción de 23 nuevos géneros.
Debido a la amplitud de las variaciones dentro de los géneros antiguos, los protocolos demostrados en un miembro pueden no funcionar como se anuncia con otros miembros. La falta de información centralizada sobre cómo manipular exactamente cepas específicas ha llevado a una serie de enfoques ad hoc , a menudo adaptados de otras familias bacterianas. Esto puede complicar las cosas para los investigadores que comienzan en el campo, que pueden no saber qué información se aplica o no a la cepa elegida.
En este documento, nuestro objetivo es centralizar un conjunto de protocolos con éxito demostrado, específicamente en la designación de cepa Limosilactobacillus reuteri F275 (otros números de colección: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), junto con consejos de solución de problemas y problemas comunes que uno puede encontrar. Estos protocolos deberían permitir a un investigador con poca o ninguna experiencia trabajando con L. reuteri DSM20016 transformar un plásmido, confirmar la transformación y medir la retroalimentación del sistema en un lector de placas a través de una proteína reportera.
Introducción
El género Lactobacillus se clasificó históricamente como grampositivo, en forma de bastoncillos, no formadores de esporas, anaerobios facultativos o microaerófilos que descomponen los azúcares para producir principalmente ácido láctico1. Estos criterios sueltos llevaron a Lactobacillus a ser, fenotípica y genotípicamente, un género extremadamente diverso. Esta amplia categorización dio lugar a la reclasificación del género, introduciendo 23 nuevos géneros en 20202.
El género antiguo, más amplio, incluía las principales especies comensales y probióticas generalmente considerad....
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Protocolo
1. Preparación de células electrocompetentes de L. reuteri DSM20016
NOTA: Esto se basa en un protocolo de Berthier et al.17, con velocidades de centrifugación informadas por Rattanachaikunsopon et al.18.
- En un tubo de centrífuga de 50 ml, inocular L. reuteri de la cal de glicerol en 6 ml de caldo deMan Rogosa Sharpe (MRS). Incubar aeróbicamente durante la noche a 37 °C en una incubadora estática.
- A la mañana siguiente, inocular 4 ml del cultivo nocturno en 200 ml de caldo MRS (dilución 1:50).
- Permitir que crezca aeróbica....
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Resultados
Eficiencias de transformación
L. reuteri no requiere un plásmido no metilado dcm-/dam, como se observa para otras Lactobacillaceae19,20 (ver Figura 1). La electroporación de L. reuteri DSM20016 con 10 μL del plásmido de 8,5 kb pTRKH3_mCherry2 (origen de replicación theta pAMβ1) debe dar eficiencias de transformación de aproximadamente 80 unidades formadoras de colon.......
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Discusión
El paso más crítico para la transformación de L. reuteri DSM20016 es la generación de condiciones de crecimiento anaeróbico después de que las transformaciones son plateadas; Las colonias obtenidas en condiciones aeróbicas son muy ocasionales y generalmente no crecen cuando se inoculan en caldo MRS. También se debe practicar el recubrimiento de todo el volumen de recuperación para maximizar la probabilidad de crecimiento de la colonia. Incluso con estos dos pasos críticos, la eficiencia de la transformación sigu.......
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Divulgaciones
No existen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Apreciamos enormemente el valioso asesoramiento proporcionado por el Prof. J.P. van Pijkeren (Universidad de Wisconsin-Madison), cuya orientación sobre el trabajo con L. reuteri ATCC PTA 6475 proporcionó una base para los métodos descritos aquí.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Cubetas de espectrofotómetro | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (centrífuga refrigerada) | Beckman Allegra | N/A | Ya no está en producción |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 sistema de electroporación | VWR | 58017-984 | |
| Tubos de centrífuga (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 colorante de carga | NEB | B7024S | |
| Cubeta de electroporación | Fisherbrand | FB101 | |
| Eritromicina | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporación baño/muelle | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Instituto Leibniz DSMZ | DSM20016 | Designación de la cepa F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Tubos de microcentrífuga (1,7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP reemplazado por un indicador mCherry2 constitutivo, optimizado para codones proteína |
| MRS Caldo (Deshidratado) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipeta | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 | Pipeta Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipeta | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipeta | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipeta | Eppendorf | 3123000055 | |
| Tubos de PCR | FroggaBio | STF-A120S | |
| Microcentrífuga personal de sobremesa | Genlantis | E200100 | |
| placas de Petri | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Termociclador | MJ Research | N/A | Ya no está en producción |
| pTRKH3_slpGFP (modificado) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Espectrofotómetro | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Microplaca de almacenamiento | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sacarosa | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | Ya no está en producción |
| Incubadora VWR 1500E | VWR | N/A | Ya no está en producción |
Referencias
- Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
- Zheng, J., et al.
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Reimpresiones y permisos
