Métodos para la electroporación y confirmación de transformación en Limosilactobacillus reuteri DSM20016

El género Lactobacillus se clasificó históricamente como grampositivo, en forma de bastoncillos, no formadores de esporas, anaerobios facultativos o microaerófilos que descomponen los azúcares para producir principalmente ácido láctico¹. Estos criterios sueltos llevaron a Lactobacillus a ser, fenotípica y genotípicamente, un género extremadamente diverso. Esta amplia categorización dio lugar a la reclasificación del género, introduciendo 23 nuevos géneros en 2020².

El género antiguo, más amplio, incluía las principales especies comensales y probióticas generalmente consideradas seguras (GRAS) para el consumo³. La familia Lactobacillaceae mantiene una percepción pública de ser "bacterias buenas" debido a muchos beneficios para la salud reportados otorgados a través del consumo de varias cepas 4,5,6,7. La facilidad con la que pueden navegar por el tracto gastrointestinal⁸ y su aceptación pública se combinan para posicionar a las cepas de Lactobacillaceae como candidatos fuertes como organismos de chasis para aplicaciones medicinales, terapéuticas o de diagnóstico ingeribles.

La amplia gama de características presentes dentro de la familia Lactobacillaceae ha llevado a una situación en la que no existe una cepa de organismo modelo de facto; Los grupos de investigación han tendido a seleccionar las especies con las propiedades más relevantes para sus objetivos particulares. (Por ejemplo, los laboratorios de fermentación láctea podrían elegir L. lactis; los estudios de fermentación vegetal podrían seleccionar L. plantarum; la investigación sobre probióticos podría centrarse en L. acidophilus; y así sucesivamente).

Esta misma amplia gama de características entre especies ha llevado a una acumulación de protocolos y procedimientos que pueden funcionar bien para un subconjunto de la familia Lactobacillaceae , pero requieren optimización para funcionar eficientemente (o tal vez para funcionar en absoluto) en otros⁹. Esta necesidad de optimización entre los miembros de la familia e incluso dentro de los miembros de la misma especie puede frustrar los esfuerzos de investigadores desconocidos. Los protocolos publicados en las secciones de métodos de los documentos también pueden incluir sus propias modificaciones¹⁰, lo que lleva a colecciones de protocolos fragmentadas y descentralizadas.

L. reuteri se considera un comensal ampliamente vertebrado, que se encuentra consistentemente en los tractos gastrointestinales (GI) de mamíferos, aves¹¹ y peces¹². Las subcepas de L. reuteri a menudo están genéticamente especializadas, a través de la adaptación de proteínas de adhesión al moco, para colonizar de forma más permanente huéspedes nativos específicos 8,11,13. Las especies de Limosilactobacillus del tracto gastrointestinal pueden aislarse en huéspedes fuera de su huésped nativo, pero tienden más hacia una naturaleza transitoria⁸.

Debido a la especialización humano-huésped, L. reuteri se DSM20016 posiciona muy bien como un chasis para aplicaciones diagnósticas o terapéuticas en cualquier punto del tracto gastrointestinal humano, y la DSM20016 de la cepa podría proporcionar una ventana de efecto más duradera para las intervenciones en comparación con cepas más transitorias.

En este documento, describimos una serie de protocolos con efectividad demostrada en Limosilactobacillus reuteri (designación de cepa: F275; otros números de colección: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), junto con información centralizada sobre la cepa de otras fuentes para ayudar en aplicaciones de biología molecular y de sistemas. Los procedimientos establecidos en este documento deben permitir a un investigador sin experiencia previa para cultivar L. reuteri, crear existencias electrocompetentes, seleccionar colonias transformadas, confirmar la transformación a través de la reacción en cadena de la polimerasa de colonias (PCR) y medir la respuesta del sistema diseñado a través de proteínas reporteras fluorescentes.

Observamos que los protocolos relacionados han cubierto la recombinación del genoma de ssDNA asistida por CRISPR-Cas9 en L. reuteri (cepa: ATCC-PTA-6475)14, y la edición del genoma asistida por nickasa CRSIPR-Cas9 en múltiples tinciones de la familia Lactobacillaceae no L. ^15,16; sin embargo, estos no abordan la cepa de L. reuteri DSM20016 que es nuestro enfoque aquí.

1. Preparación de células electrocompetentes de L. reuteri DSM20016

NOTA: Esto se basa en un protocolo de Berthier et ^al.17, con velocidades de centrifugación informadas por Rattanachaikunsopon et al.¹⁸.

1. En un tubo de centrífuga de 50 ml, inocular L. reuteri de la cal de glicerol en 6 ml de caldo deMan Rogosa Sharpe (MRS). Incubar aeróbicamente durante la noche a 37 °C en una incubadora estática.
2. A la mañana siguiente, inocular 4 ml del cultivo nocturno en 200 ml de caldo MRS (dilución 1:50).
3. Permitir que crezca aeróbicamente en una incubadora estática de 37 °C hasta que el valor de densidad óptica de 600 nm (OD600) alcance 0.5-0.85; Esto debería tomar aproximadamente 2-3 h.
4. Tan pronto como se alcance un valor adecuado de OD600, decantar el medio en tubos de centrífuga de 50 ml y colóquelos en hielo mientras equilibra los tubos.
5. Centrifugar durante 5 min a 5.000 x g en una centrífuga preenfriada a 4 °C.
6. Desechar el sobrenadante, resuspender cada pellet en 50 ml de_ddH2Opreenfriado (0 °C a 4 °C) y centrifugar de nuevo con los mismos ajustes que el paso anterior. Mantenga las células en hielo tanto como sea posible.
7. Repita el paso 1.6.
8. Resuspender cada pellet en 25 mL de_ddH2O: 0,5 M sacarosa, 10% glicerol. Centrifugar a 5.000 g a 4 °C durante 10 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a poner las células en hielo.
9. Resuspender todos los pellets en los mismos 2 mL de_ddH2O:0,5 M de sacarosa, 10% glicerol.
10. Alícuota en porciones de 50 μL a 100 μL en tubos de microcentrífuga prerefrigerados; conservar a -80 °C para su uso posterior.

2. Electroporación de L. reuteri

NOTA: Evite el pipeteo tanto como sea posible en los siguientes pasos. Se recomienda la inclusión de una electroporación de control, sin plásmido añadido, para garantizar que la selección de antibióticos sea adecuada.

1. Tome una alícuota electrocompetente entera de L. reuteri y descongele en hielo.
2. Mezclar suavemente de 5 μL a 10 μL de plásmido (concentración final de plásmidos >6 nM) en la alícuota descongelada, evitando el pipeteo tanto como sea posible.
3. Transfiera a una cubeta de electroporación de 1 mm de espacio frío por hielo.
4. Electroporato a 1,25 kV, 400 Ω y 25 μF.
5. Agregue 1 ml de caldo MRS a temperatura ambiente (RT) y mezcle invirtiendo la cubeta una o dos veces.
6. Coloque las cubetas en una incubadora estática a 37 °C durante 2,5-3 h para permitir la recuperación.
7. Coloque la cantidad total en múltiples placas de agar MRS con la selección adecuada.
8. Coloque los platos dentro de un recipiente completamente hermético con una pequeña vela encendida ("luz de té") y un sobre anaeróbico generador de atmósfera.
9. Cultivar a 37 °C durante 2-3 días o hasta que haya colonias visibles.

3. Medición de la proteína reportera fluorescente resistente a los ácidos mCherry2

1. Elija las colonias necesarias para la medición e inocular en una microplaca de almacenamiento de 96 pocillos con 1,5 ml de caldo MRS esterilizado por filtro (no esterilizado en autoclave) por pocillo y un antibiótico de selección apropiado.
2. Incubar aeróbicamente durante 24 h durante la noche a 37 °C sin agitar.
   NOTA: Esta microplaca de almacenamiento debe conservarse para su uso en la sección 4 (PCR de colonias).
3. L. reuteri se precipitará fuera de los medios cuando esté en la fase estacionaria; Resuspender el cultivo nocturno mediante pipeteo.
4. Transfiera 200 μL a una placa plana, de fondo transparente y de 96 pocillos, transfiera la placa a un lector de placas y mida el OD y la fluorescencia de mCherry2 (excitación [Ej]: 589 nm; emisión [Em]: 610 nm) u otros reporteros relevantes.

4. Confirmación de la captación de plásmidos mediante PCR de colonias

1. Desde la microplaca de almacenamiento de 96 pocillos de la sección 3, transfiera 5 μL a un tubo de PCR.
   NOTA: Si han pasado >5 minutos, puede ser necesario volver a suspender el L. reuteri por segunda vez.
2. En una microcentrífuga portátil de sobremesa, gire hacia abajo hasta que se pueda ver el pellet (aproximadamente 2 min a 2,000 x g), deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 20 μL de NaOH de 20 mM.
3. Hervir a 95 °C durante 5 min, vórtice, y repetir el hervor una segunda vez.
4. Enfriar inmediatamente las muestras; trate de mantener las muestras en hielo tanto como sea posible en los siguientes pasos para reducir la probabilidad de degradación de la plantilla y la inhibición de la PCR.
5. Girar en una microcentrífuga portátil de sobremesa a 2.000 x g durante 2 minutos hasta que los restos celulares estén granulados, luego tomar 1 μL del sobrenadante y diluir en 99 μL de ddH₂O sin DNasa y RNasa heladas (dilución 100x).
6. Utilice la dilución 100x como ADN plantilla en una reacción de PCR estándar utilizando cebadores específicos de plásmidos. Incluir un control positivo con un plásmido derivado de la mini-preparación de E. coli.
7. Devuelva las muestras en hielo y agregue un tinte de carga apropiado a una concentración de 1x.
8. Ejecutar en gel de agarosa al 1% en tampón TAE (ácido tris-acetato-etilendiaminotetraacético [EDTA]) a 110 V durante 30 min. Imagen si es necesario.

5. Protocolo de mini-preparación para L. reuteri , seguido de PCR para confirmar la presencia de plásmidos

NOTA: Protocolo diseñado para su uso con el kit de mini-preparación que figura en la Tabla de materiales.

1. Inocular L. reuteri en 10 ml de caldo MRS que contenga un antibiótico apropiado e incubar aeróbicamente durante la noche a 37 °C en una incubadora estática.
2. Centrifugadora a 5.000 g durante 10 min en una centrífuga preenfriada a 4 °C.
3. Lave el pellet en 2 ml de tampón P1 estándar (incluido con el kit) para anular la acidez que pueda interferir con los pasos posteriores, centrifugar con la misma configuración descrita anteriormente y desechar el sobrenadante.
4. Resuspender el pellet en 250 μL de tampón P1 modificado que contenga 10 mg/ml de lisozima y 100 U/ml de mutanolisina para lisar las células bacterianas. Incubar durante 1-2 h a 37 °C.
5. Añadir 250 μL de tampón P2, mezclar invirtiendo de cuatro a seis veces e incubar a RT durante no más de 5 min.
6. Agregue 350 μL de tampón N3 (incluido con el kit) e invierta inmediatamente de cuatro a seis veces suavemente para mezclar.
7. Centrifugar a 10.000 x g durante 10 min.
8. Transfiera la mayor cantidad posible de sobrenadante a una columna de centrifugado y centrífuga a 10.000 x g durante 60 s. Deseche el flujo a través.
9. Lavar la columna de centrifugado con 500 μL de PB tampón (incluido con el kit) y centrifugar a 10.000 x g durante 60 s. Deseche el flujo a través.
10. Lave la columna de centrifugado con 750 μL de PE tampón (incluido con el kit) y centrifugar a 10.000 x g durante 60 s. Deseche el flujo y centrifugar durante 60 s para eliminar cualquier tampón residual.
11. Coloque la columna de centrifugado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Aplicar 20-30 μL de_ddH2Olibre de ADN y RNAsa al filtro de la columna de centrifugado y dejar actuar durante 1-2 min, antes de centrifugar a 10.000 x g durante 60 s.
12. Realice una reacción de PCR estándar utilizando cebadores específicos de plásmidos (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA), con eluido que proporciona el ADN modelo. Incluir un control positivo con un plásmido derivado de la mini-preparación de E. coli.
    NOTA: Los ajustes de PCR utilizados en este estudio son: 98 °C durante 5 min, (98 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s, 72 °C durante 45 s) 30 ciclos, 72 °C durante 2 min, 4 °C de retención. Los parámetros dependen en gran medida de la polimerasa utilizada, la longitud del fragmento y los cebadores exactos utilizados por cualquier persona que utilice este protocolo.

Eficiencias de transformación
L. reuteri no requiere un plásmido no metilado dcm-/dam, como se observa para otras Lactobacillaceae19,20 (ver Figura 1). La electroporación de L. reuteri DSM20016 con 10 μL del plásmido de 8,5 kb pTRKH3_mCherry2 (origen de replicación theta pAMβ1) debe dar eficiencias de transformación de aproximadamente 80 unidades formadoras de colonias (UFC)/μg (cinco a ocho colonias por 200 μL plateados), independientemente de la condición de metilación del plásmido. Con el curado selectivo y la retransformación, es posible obtener cepas mutadas de L. reuteri con eficiencias de transformación mucho mayores21, observadas con pTRKH3_mCherry2 de aproximadamente 4 x 103 UFC/μg (200-250 colonias por 200 μL plateados), lo que permite aplicaciones de mayor rendimiento. También se observaron resultados similares para el reportero mTFP1. Las transformaciones también se llevaron a cabo con pNZ123 (pSH71 rolling circle origin), sin portador de proteína reportera constitutiva exógena, lo que resultó en eficiencias de transformación de 3 x 104 UFC/μg ADN (Figura suplementaria 1).

Figura 1: Eficiencias de electroporación. Se obtuvieron totales de 10 nM pTRKH3_mTFP1 y 80 nM pTRKH3_mCherry2 plásmidos de dos fuentes: DH10( E. coli y Dcm-/dam-metilasa knockout E. coli. L. reuteri se electroporó con 10 μL de los dos plásmidos de patrón de metilación diferentes y se contaron las colonias. Las barras de error indican una desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Condiciones de crecimiento de la transformación
L. reuteri es aerotolerante y se puede cultivar en caldo y en agar en condiciones atmosféricas normales. Sin embargo, el éxito de la transformación depende en gran medida de la generación de un entorno de crecimiento anaeróbico cuando está plateado; Es quizás la condición más importante para el éxito de la transformación. Se pueden detectar fugas deO2 incluyendo una placa de L. reuteria no transformada. La morfología de la colonia cambia notablemente en presencia de oxígeno (ver Figura 2); alternativamente, se pueden usar indicadores anaeróbicos (ver Tabla de materiales).

Figura 2: Morfología de colonias de L. reuteri.Colonias transformadas con el plásmido pTRKH3_mCherry2. (A) Bajo las condiciones de bajoO-2, las colonias aparecen blancas, opacas, lisas, redondas, convexas y brillantes. (B) En condiciones parciales o permeables deO2, las colonias aparecen blancas, opacas, onduladas (onduladas), redondas, umbonadas (redondeadas/nudosas) y brillantes. (C) Colonias de L. reuteri sin transformación plásmida bajo niveles atmosféricos deO2. Las colonias aparecen opacas o translúcidas y umbonadas o planas; Siempre aparecen lobulentes, redondos y secos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Medición de proteínas reporteras
La expresión y el crecimiento de la proteína reportera de L. reuteri DSM20016 tipo silvestre varían entre colonias (ver Figura 3A), lo que dificulta las deducciones precisas sobre la actividad del sistema. Es posible seleccionar y curar correctamente DSM20016 de L. reuteri de tipo silvestre transformado; La retransformación puede dar lugar a cepas con mutaciones que permiten una mayor eficiencia de transformación. Una cepa desarrollada a través de este método parecía mucho más estable en términos de expresión de proteínas reporteras (ver Figura 3B). Es aconsejable que se busquen tales mutaciones, a través del curado y la retransformación de plásmidos, antes de llevar a cabo trabajos que requieran la expresión de proteínas sintonizadas.

Figura 3: Resultados de crecimiento, fluorescencia del reportero y PCR de colonias para L. reuteria transformada. Ambos experimentos utilizan pTRKH3_mCherry2 plásmido a 80 nM. (A,B) Cada columna en cada una de las tres subparcelas se refiere al valor OD de la misma colonia, valor de fluorescencia (Ej: 589 nm; Em: 610 nm), y resultado de PCR (bloque sólido indica la banda correcta observada). (A) Todas las colonias de L. reuteri DSM20016 transformación elegida (transformación de control = cero colonias). Colonias incubadas en caldo MRS filtrado durante 24 h antes de la medición a ganancia 100. (B) Un total de 88 colonias seleccionadas de la cepa de DSM20016 L. reuteri seleccionadas para mayores eficiencias de transformación, producción de proteínas reporteras más consistentes y menor inhibición de PCR (transformación de control = cero colonias). Colonias incubadas en caldo MRS filtrado durante 24 h antes de la medición a ganancia 200. Los controles están en azul, C = control de celda DSM20016 no transformado, M = caldo MRS filtrado solo control de medios, y las barras de error denotan desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

PCR de colonias
La PCR de colonias no debe utilizarse como único medio para deducir la transformación correcta, ya que pueden ser poco fiables incluso cuando las muestras se diluyen y se mantienen refrigeradas (véase la figura 4). Si el control sin plásmidos incluido con las transformaciones exhibe cero colonias, implica que todas las colonias tienen el plásmido portador de resistencia a los antibióticos. Sin embargo, si se requiere PCR de colonias, las condiciones optimizadas establecidas aquí pueden aumentar en gran medida el éxito.

Figura 4: PCR de colonias de L. reutari transformado. (A) Las colonias de L. reuteri DSM20016 fueron examinadas para detectar bandas de PCR positivas; se obtuvieron seis y se inocularon en caldo MRS fresco esterilizado en autoclave. Las muestras de 5 μL tomadas en varios momentos después de la inoculación se sometieron de nuevo a PCR a los niveles indicados de dilución. Los colores en cada cuadro de tiempo/dilución indican el éxito de la recuperación de PCR: verde = banda correcta observada; rojo = sin banda observada. (B) Los resultados para una dilución fija de 100x muestran que variar la temperatura de preparación dio lugar a diferentes tasas de éxito de PCR: las muestras se prepararon en hielo y PCR-ed inmediatamente (89,77%), se prepararon a temperatura ambiente y PCR-ed inmediatamente (75%), o se prepararon a RT y luego se incubaron a 37 °C durante 30 minutos antes de la PCR (27,27%). (C) (1) Ocho muestras positivas de dilución 100x (R1-8) de la condición RT. (2) Después de haber sido dejadas en RT durante 48 h, las muestras fueron PCR-ed por segunda vez, mostrando una ausencia de las bandas a ~1.1 kb; Los controles positivos y negativos (carriles +/-) son los carriles más a la derecha en C (2). La escalera utilizada fue de 1 kb más la escalera de ADN, que figura en la Tabla de materiales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

L. reuteri mini-prep
La mini-preparación para L. reuteri es limitada y pretende ser solo un método alternativo de confirmación de transformación de plásmidos. Una publicación anterior señaló que algunas cepas son lisadas más eficazmente por la mutanolisina22; Se encontró que la acción dual lisozima-mutanolisina era la más efectiva para L. reuteri DSM20016. Ejecutar el eluido de mini-preparación a través de un gel de agarosa da como resultado un frotis en lugar de bandas observables. Sin embargo, la PCR posterior debería producir los tamaños de banda esperados (ver Figura 5).

Figura 5: Electroforesis en gel de agarosa de productos de PCR y mini-prep. Las mismas seis colonias de la Figura 4A fueron mini-preparadas utilizando el protocolo establecido en este documento. (Fila inferior) Mini-prep eluido muestra una mancha. (Fila superior) Después de que se realizó la PCR utilizando el eluyente como plantilla de ADN, se observan bandas positivas claras. La escalera utilizada fue de 1 kb más la escalera de ADN, que figura en la Tabla de materiales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Eficiencias de transformación de L. reuteri DSM20016 con plásmido pNZ123. Transformaciones realizadas con pNZ123 (pSH71 rolling circle origin), sin portar proteína reportera constitutiva exógena. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 1: Archivos CAD para cámaras anaeróbicas. Hoja 1: Dibujo base; Hoja 2: Dibujo de pared larga; Hoja 3: Dibujo de pared pequeña; Hoja 4: Dibujo superior; Hoja 5: Dibujo de la tapa; Hoja 6: Dibujar labios de bloqueo; Hoja 7: Dibujo de la barra de sujeción; Hoja 8: Dibujo de la placa de abrazadera; Hoja 9: Visión general del conjunto; Hoja 10: Resumen con partes numeradas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

No existen conflictos de intereses.