Mapeo de la distribución celular de una proteína optogenética mediante una rejilla de estimulación lumínica

Summary

Este protocolo implica la transfectación de sensores de cAMP y bPAC-nLuc, una proteína optogenética, para rastrear con precisión su distribución celular y su respuesta a la estimulación lumínica. El enfoque innovador de crear un mapa de respuesta de AMPc utilizando un sistema de escaneo de puntos tiene el potencial de avanzar en la investigación con proteínas optogenéticas en diferentes campos.

Abstract

Nuestro objetivo era rastrear con precisión la distribución celular de una proteína optogenética y evaluar su funcionalidad dentro de una ubicación citoplasmática específica. Para lograr esto, co-transfectamos células con sensores de cAMP dirigidos a nuclear y nuestra proteína optogenética desarrollada en laboratorio, la adenilil ciclasa-nanoluciferasa bacteriana fotoactivable (bPAC-nLuc). El bPAC-nLuc, cuando se estimula con sustratos de luz o luciferasa de 445 nm, genera adenosina 3',5'-monofosfato cíclico (AMPc). Empleamos un iluminador láser de estado sólido conectado a un sistema de escaneo puntual que nos permitió crear un patrón de cuadrícula/matriz de pequeños puntos iluminados (~1 μm²) en todo el citoplasma de las células HC-1. De este modo, pudimos hacer un seguimiento eficaz de la distribución de bPAC-nLuc con objetivos nucleares y generar un mapa completo de la respuesta del AMPc. Este mapa representaba con precisión la distribución celular de bPAC-nLuc, y su respuesta a la estimulación lumínica variaba según la cantidad de proteína en el punto iluminado. Este enfoque innovador contribuye a la expansión del conjunto de técnicas disponibles para investigar las proteínas optogenéticas celulares. La capacidad de mapear su distribución y respuesta con alta precisión tiene un potencial de gran alcance y podría hacer avanzar varios campos de investigación.

Introduction

La optogenética, nacida como una herramienta que revolucionó las neurociencias, es ahora un campo de investigación en crecimiento y una tecnología en ascenso utilizada habitualmente por muchos laboratorios en todo el mundo y en diversas áreas de investigación en biología. Desarrollamos bPAC-nLuc, una proteína optogenética versátil, mediante la fusión de una adenilil ciclasa (AC) sensible a la luz de Beggiatoa sp. (adenilil ciclasa bacteriana fotoactivable; bPAC) con nanoluciferasa (nLuc)^1,2,3. Cuando se estimula con luz azul, el bPAC produce el segundo mensajero, el monofosfato de adenosina cíclico 3',5'-AMPc. nLuc es una pequeña luciferasa recientemente desarrollada que, en presencia de uno de sus sustratos, puede generar bioluminiscencia y activar la producción de cAMP⁴. Así, esta proteína optogenética puede activarse de forma transitoria mediante el uso de breves pulsos de luz o de forma constante con Furimazina u otros sustratos de luciferasa, lo que nos permite imitar diferentes patrones de señalización de AMPc y evaluar las respuestas celulares (activación de factores de transcripción, expresión génica, proliferación celular, migración, etc.). Los avances recientes en la señalización de^2º mensajero han enfatizado la importancia de los eventos que ocurren en regiones citosólicas muy restringidas (por ejemplo, la producción endosomal de AMPc para la fosforilación de la proteína de unión al elemento de respuesta al AMPc (CREB) o los microdominios Ca²⁺ para la translocación del factor nuclear de las células T activadas (NFAT) al núcleo)^5,6. Por lo tanto, es importante desarrollar estrategias consistentes y sistemáticas para evaluar, imitar y bloquear la señalización de estos compartimentos en células vivas. Para demostrar la capacidad de bPAC-nLuc para ser activado específicamente en diferentes compartimentos celulares, co-transfectamos una línea celular derivada de hepatoma (HC-1) con el bPAC-nLuc de objetivo nuclear y H208, un sensor de cAMP de transferencia de energía de resonancia (FRET) de Förster (NLS-bPAC-nLuc; NLS-H208). Las células HC-1 que se derivan de la línea HTC carecen de actividad de CA ensayable, lo que da como resultado niveles de AMPc basales muy bajos, lo que las hace ideales para medir la producción putativa de AMPc mientras se aprovecha el rango dinámico completo de los sensores FRET^7,8. Utilizando un láser de estado sólido (445 nm, LDI-7, 89 North) conectado a un sistema de escaneo de puntos (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic), describimos un protocolo para estimular sistemáticamente áreas circulares o puntos muy pequeños (~1 μm²) dentro de células individuales. El sistema de escaneo puntual estaba conectado a uno de los puertos traseros de un microscopio de dos pisos, lo que nos permitió estimular células y realizar mediciones FRET simultáneamente a través de una trayectoria de luz independiente. En este protocolo se presenta un método en el que se emplea el software SysCon Geo, suministrado con el sistema de estimulación de Rapp OptoElectronic, para realizar un escaneo completo del citoplasma de las células. El enfoque consiste en generar un mapa de respuesta de cAMP mediante la configuración de una secuencia de iluminaciones que estimulan las células en un patrón de cuadrícula (Figura 1).

Protocol

1. Cultivo de células HC-1 y preparación para la obtención de imágenes

1. Mantener las células HC-1 en DMEM suplementadas con 10% de suero fetal bovino (FBS), penicilina (100 UI/L), estreptomicina (100 mg/L) y L-glutamina en placas de 10 cm e incubadas a 37 °C, 5% de CO₂, en aire humidificado al 95%.
2. Pase las células cada 2-4 días una vez que las células estén ~90% confluentes utilizando diluciones 1:5 o 1:10.
3. Células de semilla para transfección en cubreobjetos de vidrio 2 días antes del experimento.
   1. Trabajando en condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos con medios precalentados y PBS, aspire los medios de una placa de células casi confluente y lave suavemente con 5 mL de PBS.
   2. Aspirar el PBS y añadir 1 mL de tripsina. Incubar a 37 °C durante 3-5 min hasta que las células se hayan desprendido.
   3. Vuelva a suspender las células en 4 mL de medio y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL.
   4. Use un hemocitómetro para contar el número de células y calcular la densidad de células.
   5. Diluir las células hasta una densidad de 1,5 x 10⁴ células/mL.
   6. Pipetear 2 mL de la suspensión celular en cubreobjetos de vidrio de 25 mm con recubrimiento de poli-D-lisina en un plato de 6 pocillos.
   7. Incubar las células durante aproximadamente 24 h en una incubadora hasta un 70% de confluencia.
4. Transfecte las células utilizando un kit de transfección siguiendo las instrucciones del fabricante utilizando una proporción de 0,25 μg de ADN NLS-bPAC-nLuc/0,75 μg de ADN NLS-H208 por 3 μL de reactivo de transfección y 2 μL de reactivo P3000 diluido en medios Opti-MEM sin rojo de fenol.
5. Coloque las células en la incubadora durante ~ 48 h para permitir una expresión suficiente de bPAC-nLuc, esencial para producir niveles detectables de cAMP.
   NOTA: El nivel mínimo requerido de expresión de bPAC-nLuc variará dependiendo de la potencia del sistema de estimulación y los parámetros de la estimulación.
6. Prepare las celdas en cubreobjetos para la obtención de imágenes.
   1. Aspire el medio de un pocillo y lávese dos veces con 2 mL de PBS.
   2. Levante con cuidado el cubreobjetos con un par de pinzas y colóquelo en la cámara de imágenes.
   3. Añada 1 mL de Opti-MEM sin rojo de fenol a la cámara de imagen. Las células también se pueden obtener en HBSS o en cualquier otra solución fisiológica compatible con fluorescencia.

2. Simulación de luz e imágenes de células vivas

1. Realizar cultivo celular y manipulación de células que expresan NLS-bPAC-nLuc en un entorno oscuro. Para evitar la exposición a longitudes de onda <500 nm, utilice una lámpara de luz de seguridad roja (Tabla de Materiales) con una bombilla de fluorescencia compacta ámbar de 13 W (Tabla de Materiales).
2. Realizar experimentos en un microscopio motorizado de dos pisos (Tabla de Materiales) equipado con un motor de luz multi-LED de 6 líneas (Tabla de Materiales), una rueda de filtro de emisión (Tabla de Materiales), etapa XY (Tabla de Materiales), una cámara CMOS digital ORCA-Fusion (Tabla de Materiales) y un objetivo de aceite 100x/1.4 NA (∞/0.17/FN26.5). Captura de imágenes mediante software de microscopía digital (Tabla de Materiales). Esta configuración es capaz de estimular células y realizar mediciones FRET simultáneamente mediante el uso de una trayectoria de luz independiente provista de un filtro dicroico ZT458rdc (Tabla de Materiales).
   NOTA: Se puede utilizar cualquier configuración de adquisición si permite la estimulación optogenética simultánea y la obtención de imágenes FRET/intensiométricas con un sensor compatible.
3. Encienda el geosistema UGA - 42. Encienda el microscopio y configúrelo con los parámetros adecuados para adquirir con el sensor H208 FRET. La configuración de adquisición dependerá de los niveles de expresión del sensor FRET. Los parámetros típicos son un tiempo de simulación de 40 ms para YFP/mScarletI, una potencia de LED del 15 % y 0,5 Hz.
4. Abra el software SysCon y el software de imágenes que controla el microscopio.
5. En la ventana de la cámara, seleccione la pestaña Calibración y elija la longitud de onda del láser compatible con la proteína optogenética. Para estimular bPAC-nLuc, utilice una longitud de onda de 445 nm.
6. Calibre el sistema antes de cada uso. Esto es importante porque pequeñas variaciones en la configuración, o incluso cambios en la temperatura ambiente (RT), pueden alterar la precisión de la estimulación.
7. En la ventana de la cámara, seleccione la pestaña Cámara y haga clic en para iniciar la adquisición desde el software de visualización.
8. En la ventana del Visor de imágenes, visualice una adquisición en vivo o previa de la fluorescencia de las células tomada del software de imágenes, que guiará el posicionamiento de los objetos de estimulación.
9. Utilice el modo Click and Fire para evaluar rápidamente la capacidad de respuesta de una celda individual antes de iniciar el experimento.
10. Usando la ventana del Administrador de secuencias, seleccione para crear una nueva secuencia.
    NOTA: Para verificar la calibración adecuada del sistema, dibuje varias formas y tamaños en la ventana del Visor de imágenes. Estos deben corresponder con precisión a los patrones de estimulación proyectados sobre las células, asegurando una alineación precisa con el diseño previsto.
11. En la ventana Visor de imágenes, seleccione el icono Redondo en la barra de herramientas de la izquierda para dibujar objetos de estimulación circulares.
12. Cree múltiples círculos pequeños idénticos y distribúyalos uniformemente para asegurar la cobertura homogénea de todo el citoplasma de las células a estimular.
13. Haga clic con el botón derecho del ratón en cada uno para verificar la homogeneidad de los objetos de estimulación circular. Aparecerá una ventana; Utilícelo para examinar su radio, posición, etc.
14. Establezca el radio entre 1 y 5, dependiendo del objetivo utilizado y del tamaño de la celda.
15. Para ayudar con el espaciado uniforme y la alineación de los círculos, use el botón en la subventana Ver. Además, establezca las propiedades de la cuadrícula mediante el botón .
16. Asegúrese de que la rejilla o matriz de objetos de estimulación circular espaciados uniformemente cubra completamente la celda, y su tamaño (por ejemplo, 6 x 6 o 10 x 10) esté determinado por el tamaño de la celda. Como control de la estimulación nula que no debería desencadenar ningún evento celular, incluya algunos círculos colocados fuera de la célula.
17. Cada objeto creado en la ventana del Visor de imágenes aparecerá en la ventana de la línea de tiempo.
    1. En la subventana Temporización de objetos, configure las propiedades temporales de cada objeto de estimulación (tiempo de inicio, duración, retardo).
    2. En la subventana Fuente de luz, configure la longitud de onda y la intensidad de cada objeto. Para este protocolo, asegúrese de que cada objeto utilice la misma longitud de onda y sea idéntico en duración e intensidad. La hora de inicio será diferente para cada objeto, y el retraso entre ellos puede variar en función del resultado esperado para evitar superponer el efecto de diferentes estimulaciones.
18. En la ventana de la línea de tiempo, modifique la secuencia en la que se activará cada objeto de estimulación si es necesario. Configure las estimulaciones en un patrón regular (por ejemplo, de izquierda a derecha, de arriba a abajo) o en un patrón aleatorio, según el experimento en particular.
19. Cargue la secuencia en el sistema y configure el número de ciclos de secuencia (ejecuciones) que realizará el sistema.
20. Coloque las regiones de interés (ROI) en el software de imágenes en las posiciones deseadas.
21. Comience a adquirir imágenes de fluorescencia con el microscopio y presione en la ventana de UGA-42.

3. Análisis de datos

1. Aunque el software proporcionado por el sistema de estimulación permite guardar secuencias para su uso posterior, no registra la información real del experimento. Por lo tanto, documente meticulosamente todos los detalles relacionados con los puntos de estimulación y las secuencias empleadas durante el experimento, incluidos parámetros como la posición, la intensidad, la duración, el número de carreras, etc. Documentar cualquier otra condición experimental relevante, como agentes farmacológicos o soluciones específicas.
2. Durante el experimento, coloque los ROI designados en el software de imágenes para capturar los cambios en la intensidad de la fluorescencia de toda la célula o de ubicaciones específicas dentro de las células.
3. Preste especial atención a la posición de los ROI en relación con los puntos de estimulación. Mida los cambios en la intensidad de la fluorescencia dentro o lejos de las áreas estimuladas. Ajuste las posiciones de los ROI después del experimento, proporcionando el software de imágenes para permitir guardar las imágenes adquiridas durante el experimento y no solo los valores de intensidad del ROI.

Results

Los resultados presentados en Figura 1 muestran que solo las estimulaciones dirigidas al núcleo celular fueron capaces de generar elevaciones medibles de cAMP. Esto confirma que NLS-bPAC-nLuc se expresa exclusivamente en el compartimento nuclear de las células HC-1. Es posible estimular con precisión una proteína optogenética utilizando este patrón de cuadrícula/matriz para mapear su distribución intracelular. Además, las elevaciones más altas de cAMP hacia el centro nuclear reflejan la mayor masa de bPAC-nLuc simulada por puntos centrales en comparación con las situadas en la periferia nuclear (Figura 1).

Figura 1: El protocolo de estimulación de la red y el mapa de respuesta del AMPc. Estimulaciones secuenciales de luz azul (445 nm; intervalo de 30 s entre pulsos; tren de pulsos: 50 ms, 500 ms duración total, 10 Hz, 7% de potencia láser) en células HC-1 transfectadas con NLS-H208 (sensor cAMP) y NLS-bPAC-nLuc. El panel izquierdo muestra la fluorescencia de la proteína fluorescente amarilla (YFP) del H208, que se superpuso con los pulsos de luz reales capturados por la cámara sCMOS representados en una sola imagen. Las trazas de la derecha muestran aumentos transitorios del AMPc desencadenados por la estimulación NLS-bPAC-nLuc en cada punto de estimulación. La fluorescencia NLS-H208 sustraída al fondo se midió utilizando un único ROI que cubría todo el núcleo, y se calcularon las relaciones normalizadas (R/R0). Las respuestas en las áreas exteriores (filas 1 y 7, columnas A y G) fueron negativas y no se muestran. Barra = 3 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El objetivo de este estudio fue monitorear con precisión la distribución intracelular de una proteína optogenética y evaluar su rendimiento dentro de un compartimento citoplasmático particular. También mostramos las capacidades de estimulación precisas de un sistema de escaneo de puntos en células que expresan una proteína optogenética. Para lograr esto, empleamos un bPAC-nLuc dirigido a la energía nuclear con altos niveles de expresión pero una distribución muy limitada al núcleo. Los resultados mostraron que los puntos de estimulación separados por solo ~ 1 μm pueden desencadenar la producción de cAMP o no, dependiendo de la distribución celular de la proteína optogenética; solo los estímulos dirigidos al núcleo pudieron elevar los niveles de AMPc. En este protocolo, el objetivo no era generar elevaciones localizadas de AMPc, sino mostrar que las estimulaciones de luz breves pueden ser lo suficientemente precisas como para activar proteínas optogenéticas en áreas muy restringidas de la célula sin estimular las proteínas circundantes. Sin embargo, este enfoque constituye un control necesario para el estudio de otras proteínas optogenéticas con distribuciones difusas y/o la generación de elevaciones localizadas de AMPc. Esto se puede lograr variando los niveles de expresión de la proteína optogenética, la intensidad y frecuencia de la estimulación, etc. Para medir con precisión estas señales localizadas, es crucial tener en cuenta cuidadosamente los parámetros de adquisición y las características de los sensores. Esto incluye seleccionar posiciones y tamaños de ROI apropiados, determinar la frecuencia de adquisición y elegir sensores FRET/intensiométricos con afinidad, intensidad, rango dinámico y constante de disociación óptimos.

En un artículo publicado recientemente, utilizamos una estrategia similar para demostrar funcionalmente la distribución de un bPAC-nLuc dirigido a la energía nuclear y la capacidad de una fosfodiesterasa modificada (PDE; ΔRI-PDE8) para abolir las elevaciones de AMPc en una línea celular derivada de la tiroides⁹. En este artículo, realizamos la estimulación celular a lo largo de una línea recta en lugar de una cuadrícula, y los puntos de iluminación se colocaron en relación con los puntos de referencia celulares (por ejemplo, centro nuclear, borde nuclear, etc.) en lugar de en un patrón sistemático. Sorprendentemente, incluso los estímulos dirigidos al borde nuclear fueron insuficientes para desencadenar una respuesta de AMPc detectable. Razonamos que esto probablemente se debió a la estimulación de una masa insuficiente de NLS-bPAC-nLuc⁹. Sin embargo, en el presente protocolo, algunas estimulaciones dirigidas a la vecindad del borde nuclear provocaron un aumento detectable de AMPc. Esta discrepancia podría atribuirse a varios factores, incluidos los niveles de expresión del bPAC-nLuc, las características de la estimulación, la morfología del núcleo, la presencia de EDP endógenas, proteínas tampón, etc.

Si bien otras proteínas optogenéticas dirigidas o no dirigidas pueden exhibir distribuciones más difusas, este enfoque sistemático permite sacar conclusiones significativas mediante la configuración cuidadosa de experimentos y el análisis de los datos. Además, este enfoque permite dirigirse a estructuras celulares especializadas (por ejemplo, lamelipodios, dendritas, cilios primarios, etc.), lo que facilita las comparaciones entre las respuestas en las regiones distal y proximal de estas estructuras y/o el cuerpo celular.

Esta estrategia también se puede utilizar para evaluar la activación de elementos aguas abajo en la vía del AMPc, como la proteína quinasa A (PKA) o la proteína de intercambio activada directamente por el AMPc (EPAC1). Además, dado que bPAC-nLuc no está influenciado por los mismos moduladores que los AC endógenos, que pueden verse afectados por interacciones locales con proteínas u otros factores, se puede suponer que genera consistentemente la misma cantidad de cAMP dado el mismo nivel de expresión. Al examinar la reducción de las elevaciones de AMPc o la disminución de los niveles de AMPc después de un aumento temporal, este enfoque permite evaluar la degradación, difusión o funcionalidad y distribución de las EDP endógenas o transfectadas. Esta estrategia resulta particularmente útil para evaluar el comportamiento de cualquier proteína optogenética en diferentes ubicaciones celulares, lo que ayuda a evitar el sesgo de colocar arbitrariamente puntos de estimulación dentro del citoplasma.

Es importante tener en cuenta que el tamaño del punto de estimulación y su energía dependerán en última instancia de las características particulares de la configuración utilizada (trayectorias de luz, objetivos, sistema de escaneo, etc.). Para garantizar resultados precisos, se debe tener en cuenta la expresión relativa de la proteína optogenética, la sensibilidad de las células a la longitud de onda utilizada y cualquier otro parámetro al realizar cada experimento en cada sistema en particular. También es esencial tener en cuenta que no hemos estudiado hasta qué punto se puede impulsar el sistema en la implementación de puntos de estimulación más pequeños y / o cuadrículas más densas (es decir, puntos de estimulación menos espaciados) para evaluar sistemáticamente estructuras celulares más pequeñas con mayor precisión. Además, hemos probado esta estrategia utilizando solo el sistema de escaneo de puntos geográficos UGA-42. Este enfoque puede ser posible utilizando diferentes sistemas, siempre que puedan generar de manera reproducible manchas localizadas espaciadas uniformemente. Cada sistema debe optimizarse para obtener resultados similares.

Finalmente, se debe evaluar cuidadosamente la estimulación potencial de los sensores FRET por parte del sistema de estimulación. Por ejemplo, la proteína fluorescente cian (CFP) ciertamente será estimulada o incluso blanqueada por el láser de 445 nm utilizado en este protocolo. El uso de potencias láser más altas (o filtros de densidad neutra (ND) de mayor transmitancia) aumentará las posibilidades de estimular los sensores fluorescentes e introducir información falsa en el experimento y/o generar problemas con el análisis de datos. El fotoblanqueo normal de los sensores FRET/intensiométricos también debe evaluarse cuidadosamente. Finalmente, dado que bPAC puede ser sensible a la luz ambiental y generar cAMP incluso en condiciones de oscuridad (la actividad oscura de bPAC se ha medido como 33 ± 5 pmol / min / mg de proteína³), las células deben manipularse cuidadosamente después de transfectar bPAC-nLUC para evitar la contaminación lumínica (por ejemplo, en la incubadora, antes y / o durante los experimentos, etc.). Opcionalmente, las células se pueden incubar con un inhibidor de la PDE (p. ej., 3-isobutil-1-metilxantina; IBMX¹⁰) para determinar la actividad de referencia de bPAC-nLuc y confirmar que las condiciones de iluminación utilizadas son apropiadamente oscuras.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bombilla compacta de fluorescencia ámbar de 13 W - Low Blue Lights	Photonic Developments
3-isobutil-1-metilxantina (IBMX)	Sigma	I7018
Lumencor multi-LED de 6 líneas Spectra X	Lumencor		Motor de luz multi-LED de 6 líneas
Corning - DMEM	Thermo Fischer	MT10013CMEA
Corning - Suero fetal bovino regular	Thermo Fischer	MT35011CV
Cubreobjetos: círculos	Thermo Fischer	12545102P
GBX-2 rojo oscuro filtro de luz de seguridad 5.5"	Kodak	1416827	Lámpara de luz de seguridad roja
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) 10x	Thermo Fischer	14185052	Diluido a 1x, pH ajustado
LDI-7	89 North
L-Glutamine	Thermo Fischer	BW17605E
Lipofectamine 3000	Thermo Fischer	L3000001	Kit de transfección
Olympus IX83 motorizada  dos cubiertas  microscopio	Microscopio motorizado de dos pisos Olympus
Opti-MEM, cámara	Thermo Fischer	11058021
ORCA-fusion sin rojo fenol	Hamamatsu	C14440-20UP
Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)	Thermo Fischer	15140122
Solución tamponada de fosfato (1x)	Lonza	17516F
Rueda de filtro de emisión anterior y juegos de filtros	Prior Scientific, Inc.		Rueda de filtro de emisiones
Anterior  Etapa Proscan XY	Prior Scientific, Inc.		Etapa XY
Slidebook 6	Innovaciones en imágenes inteligentes Software de		microscopía digital
Software SysCon	Software SysCon		Software proporcionado por el sistema de estimulación
UGA-42  Geo	Rapp OptoElectronic
UPlanSApo 100x	Olympus		100x/1.4 NA (∞/0.17/FN26.5)
ZT458rdc dicroico	Chroma Technology Corp		BS, Longitud de onda (CWL):  498 nm