Este protocolo implica la transfectación de sensores de cAMP y bPAC-nLuc, una proteína optogenética, para rastrear con precisión su distribución celular y su respuesta a la estimulación lumínica. El enfoque innovador de crear un mapa de respuesta de AMPc utilizando un sistema de escaneo de puntos tiene el potencial de avanzar en la investigación con proteínas optogenéticas en diferentes campos.
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Artículo de método
Mapeo de la distribución celular de una proteína optogenética mediante una rejilla de estimulación lumínica
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Resumen
Resumen
Nuestro objetivo era rastrear con precisión la distribución celular de una proteína optogenética y evaluar su funcionalidad dentro de una ubicación citoplasmática específica. Para lograr esto, co-transfectamos células con sensores de cAMP dirigidos a nuclear y nuestra proteína optogenética desarrollada en laboratorio, la adenilil ciclasa-nanoluciferasa bacteriana fotoactivable (bPAC-nLuc). El bPAC-nLuc, cuando se estimula con sustratos de luz o luciferasa de 445 nm, genera adenosina 3',5'-monofosfato cíclico (AMPc). Empleamos un iluminador láser de estado sólido conectado a un sistema de escaneo puntual que nos permitió crear un patrón de cuadrícula/matriz de pequeños puntos iluminados (~1 μm2) en todo el citoplasma de las células HC-1. De este modo, pudimos hacer un seguimiento eficaz de la distribución de bPAC-nLuc con objetivos nucleares y generar un mapa completo de la respuesta del AMPc. Este mapa representaba con precisión la distribución celular de bPAC-nLuc, y su respuesta a la estimulación lumínica variaba según la cantidad de proteína en el punto iluminado. Este enfoque innovador contribuye a la expansión del conjunto de técnicas disponibles para investigar las proteínas optogenéticas celulares. La capacidad de mapear su distribución y respuesta con alta precisión tiene un potencial de gran alcance y podría hacer avanzar varios campos de investigación.
Introducción
La optogenética, nacida como una herramienta que revolucionó las neurociencias, es ahora un campo de investigación en crecimiento y una tecnología en ascenso utilizada habitualmente por muchos laboratorios en todo el mundo y en diversas áreas de investigación en biología. Desarrollamos bPAC-nLuc, una proteína optogenética versátil, mediante la fusión de una adenilil ciclasa (AC) sensible a la luz de Beggiatoa sp. (adenilil ciclasa bacteriana fotoactivable; bPAC) con nanoluciferasa (nLuc)1,2,3. Cuando se estimula con luz azul, el bPAC produce el segundo mensajero, el monofosfato de adenosina cíclico 3',5'-AMPc. nLuc es una pequeña luciferasa recientemente desarrollada que, en presencia de uno de sus sustratos, puede generar bioluminiscencia y activar la producción de cAMP4. Así, esta proteína optogenética puede activarse de forma transitoria mediante el uso de breves pulsos de luz o de forma constante con Furimazina u otros sustratos de luciferasa, lo que nos permite imitar diferentes patrones de señalización de AMPc y evaluar las respuestas celulares (activación de factores de transcripción, expresión génica, proliferación celular, migración, etc.). Los avances recientes en la señalización de2º mensajero han enfatizado la importancia de los eventos que ocurren en regiones citosólicas muy restringidas (por ejemplo, la producción endosomal de AMPc para la fosforilación de la proteína de unión al elemento de respuesta al AMPc (CREB) o los microdominios Ca2+ para la translocación del factor nuclear de las células T activadas (NFAT) al núcleo)5,6. Por lo tanto, es importante desarrollar estrategias consistentes y sistemáticas para evaluar, imitar y bloquear la señalización de estos compartimentos en células vivas. Para demostrar la capacidad de bPAC-nLuc para ser activado específicamente en diferentes compartimentos celulares, co-transfectamos una línea celular derivada de hepatoma (HC-1) con el bPAC-nLuc de objetivo nuclear y H208, un sensor de cAMP de transferencia de energía de resonancia (FRET) de Förster (NLS-bPAC-nLuc; NLS-H208). Las células HC-1 que se derivan de la línea HTC carecen de actividad de CA ensayable, lo que da como resultado niveles de AMPc basales muy bajos, lo que las hace ideales para medir la producción putativa de AMPc mientras se aprovecha el rango dinámico completo de los sensores FRET7,8. Utilizando un láser de estado sólido (445 nm, LDI-7, 89 North) conectado a un sistema de escaneo de puntos (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic), describimos un protocolo para estimular sistemáticamente áreas circulares o puntos muy pequeños (~1 μm2) dentro de células individuales. El sistema de escaneo puntual estaba conectado a uno de los puertos traseros de un microscopio de dos pisos, lo que nos permitió estimular células y realizar mediciones FRET simultáneamente a través de una trayectoria de luz independiente. En este protocolo se presenta un método en el que se emplea el software SysCon Geo, suministrado con el sistema de estimulación de Rapp OptoElectronic, para realizar un escaneo completo del citoplasma de las células. El enfoque consiste en generar un mapa de respuesta de cAMP mediante la configuración de una secuencia de iluminaciones que estimulan las células en un patrón de cuadrícula (Figura 1).
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Protocolo
1. Cultivo de células HC-1 y preparación para la obtención de imágenes
- Mantener las células HC-1 en DMEM suplementadas con 10% de suero fetal bovino (FBS), penicilina (100 UI/L), estreptomicina (100 mg/L) y L-glutamina en placas de 10 cm e incubadas a 37 °C, 5% de CO2, en aire humidificado al 95%.
- Pase las células cada 2-4 días una vez que las células estén ~90% confluentes utilizando diluciones 1:5 o 1:10.
- Células de semilla para transfección en cubreobjetos de vidrio 2 días antes del experimento.
- Trabajando en condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos con medios precalentados y PBS, aspire los medios de una placa de células casi confluente y lave suavemente con 5 mL de PBS.
- Aspirar el PBS y añadir 1 mL de tripsina. Incubar a 37 °C durante 3-5 min hasta que las células se hayan desprendido.
- Vuelva a suspender las células en 4 mL de medio y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL.
- Use un hemocitómetro para contar el número de células y calcular la densidad de células.
- Diluir las células hasta una densidad de 1,5 x 104 células/mL.
- Pipetear 2 mL de la suspensión celular en cubreobjetos de vidrio de 25 mm con recubrimiento de poli-D-lisina en un plato de 6 pocillos.
- Incubar las células durante aproximadamente 24 h en una incubadora hasta un 70% de confluencia.
- Transfecte las células utilizando un kit de transfección siguiendo las instrucciones del fabricante utilizando una proporción de 0,25 μg de ADN NLS-bPAC-nLuc/0,75 μg de ADN NLS-H208 por 3 μL de reactivo de transfección y 2 μL de reactivo P3000 diluido en medios Opti-MEM sin rojo de fenol.
- Coloque las células en la incubadora durante ~ 48 h para permitir una expresión suficiente de bPAC-nLuc, esencial para producir niveles detectables de cAMP.
NOTA: El nivel mínimo requerido de expresión de bPAC-nLuc variará dependiendo de la potencia del sistema de estimulación y los parámetros de la estimulación. - Prepare las celdas en cubreobjetos para la obtención de imágenes.
- Aspire el medio de un pocillo y lávese dos veces con 2 mL de PBS.
- Levante con cuidado el cubreobjetos con un par de pinzas y colóquelo en la cámara de imágenes.
- Añada 1 mL de Opti-MEM sin rojo de fenol a la cámara de imagen. Las células también se pueden obtener en HBSS o en cualquier otra solución fisiológica compatible con fluorescencia.
2. Simulación de luz e imágenes de células vivas
- Realizar cultivo celular y manipulación de células que expresan NLS-bPAC-nLuc en un entorno oscuro. Para evitar la exposición a longitudes de onda <500 nm, utilice una lámpara de luz de seguridad roja (Tabla de Materiales) con una bombilla de fluorescencia compacta ámbar de 13 W (Tabla de Materiales).
- Realizar experimentos en un microscopio motorizado de dos pisos (Tabla de Materiales) equipado con un motor de luz multi-LED de 6 líneas (Tabla de Materiales), una rueda de filtro de emisión (Tabla de Materiales), etapa XY (Tabla de Materiales), una cámara CMOS digital ORCA-Fusion (Tabla de Materiales) y un objetivo de aceite 100x/1.4 NA (∞/0.17/FN26.5). Captura de imágenes mediante software de microscopía digital (Tabla de Materiales). Esta configuración es capaz de estimular células y realizar mediciones FRET simultáneamente mediante el uso de una trayectoria de luz independiente provista de un filtro dicroico ZT458rdc (Tabla de Materiales).
NOTA: Se puede utilizar cualquier configuración de adquisición si permite la estimulación optogenética simultánea y la obtención de imágenes FRET/intensiométricas con un sensor compatible. - Encienda el geosistema UGA - 42. Encienda el microscopio y configúrelo con los parámetros adecuados para adquirir con el sensor H208 FRET. La configuración de adquisición dependerá de los niveles de expresión del sensor FRET. Los parámetros típicos son un tiempo de simulación de 40 ms para YFP/mScarletI, una potencia de LED del 15 % y 0,5 Hz.
- Abra el software SysCon y el software de imágenes que controla el microscopio.
- En la ventana de la cámara, seleccione la pestaña Calibración y elija la longitud de onda del láser compatible con la proteína optogenética. Para estimular bPAC-nLuc, utilice una longitud de onda de 445 nm.
- Calibre el sistema antes de cada uso. Esto es importante porque pequeñas variaciones en la configuración, o incluso cambios en la temperatura ambiente (RT), pueden alterar la precisión de la estimulación.
- En la ventana de la cámara, seleccione la pestaña Cámara y haga clic en para iniciar la adquisición desde el software de visualización.
- En la ventana del Visor de imágenes, visualice una adquisición en vivo o previa de la fluorescencia de las células tomada del software de imágenes, que guiará el posicionamiento de los objetos de estimulación.
- Utilice el modo Click and Fire para evaluar rápidamente la capacidad de respuesta de una celda individual antes de iniciar el experimento.
- Usando la ventana del Administrador de secuencias, seleccione para crear una nueva secuencia.
NOTA: Para verificar la calibración adecuada del sistema, dibuje varias formas y tamaños en la ventana del Visor de imágenes. Estos deben corresponder con precisión a los patrones de estimulación proyectados sobre las células, asegurando una alineación precisa con el diseño previsto. - En la ventana Visor de imágenes, seleccione el icono Redondo en la barra de herramientas de la izquierda para dibujar objetos de estimulación circulares.
- Cree múltiples círculos pequeños idénticos y distribúyalos uniformemente para asegurar la cobertura homogénea de todo el citoplasma de las células a estimular.
- Haga clic con el botón derecho del ratón en cada uno para verificar la homogeneidad de los objetos de estimulación circular. Aparecerá una ventana; Utilícelo para examinar su radio, posición, etc.
- Establezca el radio entre 1 y 5, dependiendo del objetivo utilizado y del tamaño de la celda.
- Para ayudar con el espaciado uniforme y la alineación de los círculos, use el botón en la subventana Ver. Además, establezca las propiedades de la cuadrícula mediante el botón .
- Asegúrese de que la rejilla o matriz de objetos de estimulación circular espaciados uniformemente cubra completamente la celda, y su tamaño (por ejemplo, 6 x 6 o 10 x 10) esté determinado por el tamaño de la celda. Como control de la estimulación nula que no debería desencadenar ningún evento celular, incluya algunos círculos colocados fuera de la célula.
- Cada objeto creado en la ventana del Visor de imágenes aparecerá en la ventana de la línea de tiempo.
- En la subventana Temporización de objetos, configure las propiedades temporales de cada objeto de estimulación (tiempo de inicio, duración, retardo).
- En la subventana Fuente de luz, configure la longitud de onda y la intensidad de cada objeto. Para este protocolo, asegúrese de que cada objeto utilice la misma longitud de onda y sea idéntico en duración e intensidad. La hora de inicio será diferente para cada objeto, y el retraso entre ellos puede variar en función del resultado esperado para evitar superponer el efecto de diferentes estimulaciones.
- En la ventana de la línea de tiempo, modifique la secuencia en la que se activará cada objeto de estimulación si es necesario. Configure las estimulaciones en un patrón regular (por ejemplo, de izquierda a derecha, de arriba a abajo) o en un patrón aleatorio, según el experimento en particular.
- Cargue la secuencia en el sistema y configure el número de ciclos de secuencia (ejecuciones) que realizará el sistema.
- Coloque las regiones de interés (ROI) en el software de imágenes en las posiciones deseadas.
- Comience a adquirir imágenes de fluorescencia con el microscopio y presione en la ventana de UGA-42.
3. Análisis de datos
- Aunque el software proporcionado por el sistema de estimulación permite guardar secuencias para su uso posterior, no registra la información real del experimento. Por lo tanto, documente meticulosamente todos los detalles relacionados con los puntos de estimulación y las secuencias empleadas durante el experimento, incluidos parámetros como la posición, la intensidad, la duración, el número de carreras, etc. Documentar cualquier otra condición experimental relevante, como agentes farmacológicos o soluciones específicas.
- Durante el experimento, coloque los ROI designados en el software de imágenes para capturar los cambios en la intensidad de la fluorescencia de toda la célula o de ubicaciones específicas dentro de las células.
- Preste especial atención a la posición de los ROI en relación con los puntos de estimulación. Mida los cambios en la intensidad de la fluorescencia dentro o lejos de las áreas estimuladas. Ajuste las posiciones de los ROI después del experimento, proporcionando el software de imágenes para permitir guardar las imágenes adquiridas durante el experimento y no solo los valores de intensidad del ROI.
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Resultados
Los resultados presentados en la Figura 1 muestran que solo las estimulaciones dirigidas al núcleo celular fueron capaces de generar aumentos medibles de AMPc. Esto confirma que NLS-bPAC-nLuc se expresa exclusivamente en el compartimento nuclear de las células HC-1. Es posible estimular con precisión una proteína optogenética utilizando este patrón de cuadrícula/matriz para mapear su distribución intracelular. Además, los mayores aumentos de AMPc hacia el cen...
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Discusión
El objetivo de este estudio fue monitorear con precisión la distribución intracelular de una proteína optogenética y evaluar su rendimiento dentro de un compartimento citoplasmático particular. También mostramos las capacidades de estimulación precisas de un sistema de escaneo de puntos en células que expresan una proteína optogenética. Para lograr esto, empleamos un bPAC-nLuc dirigido a la energía nuclear con altos niveles de expresión pero una distribución muy limitada al núcleo. Los resultados mostraron que los puntos...
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.
Agradecimientos
La financiación fue proporcionada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) subvenciones R01 GM099775 y GM130612 a D.L.A.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Bombilla compacta de fluorescencia ámbar de 13 W - Low Blue Lights | Photonic Developments | ||
| 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) | Sigma | I7018 | |
| Lumencor multi-LED de 6 líneas Spectra X | Lumencor | Motor de luz multi-LED de 6 líneas | |
| Corning - DMEM | Thermo Fischer | MT10013CMEA | |
| Corning - Suero fetal bovino regular | Thermo Fischer | MT35011CV | |
| Cubreobjetos: círculos | Thermo Fischer | 12545102P | |
| GBX-2 rojo oscuro filtro de luz de seguridad 5.5" | Kodak | 1416827 | Lámpara de luz de seguridad roja |
| Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) 10x | Thermo Fischer | 14185052 | Diluido a 1x, pH ajustado |
| LDI-7 | 89 North | ||
| L-Glutamine | Thermo Fischer | BW17605E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fischer | L3000001 | Kit de transfección |
| Olympus IX83 motorizada dos cubiertas microscopio | Microscopio motorizado de dos pisos Olympus | ||
| Opti-MEM, cámara | Thermo Fischer | 11058021 | |
| ORCA-fusion sin rojo fenol | Hamamatsu | C14440-20UP | |
| Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL) | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Solución tamponada de fosfato (1x) | Lonza | 17516F | |
| Rueda de filtro de emisión anterior y juegos de filtros | Prior Scientific, Inc. | Rueda de filtro de emisiones | |
| Anterior Etapa Proscan XY | Prior Scientific, Inc. | Etapa XY | |
| Slidebook 6 | Innovaciones en imágenes inteligentes Software de | microscopía digital | |
| Software SysCon | Software SysCon | Software proporcionado por el sistema de estimulación | |
| UGA-42 Geo | Rapp OptoElectronic | ||
| UPlanSApo 100x | Olympus | 100x/1.4 NA (∞/0.17/FN26.5) | |
| ZT458rdc dicroico | Chroma Technology Corp | BS, Longitud de onda (CWL): 498 nm |
Referencias
- Naim, N., et al. Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).
- Naim, N., Reece, J. M., Zhang, X., Altschuler, D. L. Dual activation of cAMP production through photostimulation or chemical stimulation. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2173, 201-216 (2020).
- Stierl, M., et al. Light modulation of cellular cAMP by a small bacterial photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, of the soil bacterium Beggiatoa. The Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1181-1188 (2011).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
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- Groschner, K., Graier, W. F., Romanin, C. Store-operated ca(2)+ entry (SOCE) pathways. , Springer, Vienna. (2017).
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