Inmunofluorescencia dual de γH2AX y 53BP1 en linfocitos periféricos humanos

Resumen

Este protocolo presenta un método para evaluar la formación y reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante la detección simultánea de focos γH2AX y 53BP1 en núcleos interfase de linfocitos periféricos humanos tratados con bleomicina.

Resumen

Las roturas de doble cadena (DSB) son una de las lesiones más graves que pueden ocurrir en los núcleos celulares y, si no se reparan, pueden conducir a resultados graves, incluido el cáncer. Por lo tanto, la célula está provista de mecanismos complejos para reparar DSB, y estas vías involucran histona H2AX en su forma fosforilada en Ser-139 (es decir, γH2AX) y la proteína de unión a p53 1 (53BP1). Como ambas proteínas pueden formar focos en los sitios de los DSB, la identificación de estos marcadores se considera un método adecuado para estudiar tanto los DSB como su cinética de reparación. De acuerdo con los procesos moleculares que conducen a la formación de focos γH2AX y 53BP1, podría ser más útil investigar su colocalización cerca de los DSB para establecer un enfoque alternativo que permita cuantificar los DSB mediante la detección simultánea de dos marcadores de daño en el ADN. Así, este protocolo tiene como objetivo evaluar el daño genómico inducido en linfocitos humanos por el agente radiomimético bleomicina a través de la presencia de focos γH2AX y 53BP1 en una inmunofluorescencia dual. Usando esta metodología, también delineamos la variación en el número de focos γH2AX y 53BP1 a lo largo del tiempo, como un intento preliminar de estudiar la cinética de reparación de los DSB inducidos por bleomicina.

Introducción

El daño del ADN es inducido continuamente por agentes que pueden ser endógenos, como ROS generados por el metabolismo oxidativo celular, o exógenos, tanto químicos como físicos¹. Entre las lesiones más dañinas, las roturas de doble cadena (DSB) juegan un papel fundamental para contribuir a la inestabilidad genómica, ya que causan aberraciones cromosómicas que a su vez pueden iniciar el proceso de carcinogénesis. Por lo tanto, las células están provistas de mecanismos complejos y eficientes de reparación de DSB².

Cuando se produce un DSB, la célula desencadena la respuesta al daño del ADN (DDR)....

Protocolo

El estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Pisa, y se obtuvo el consentimiento informado y firmado de cada donante.

1. Formación de focos γH2AX y 53BP1

1. Preparación de muestras y tratamiento mutagénico
   1. Recolectar muestras de sangre total por venopunción de individuos adultos sanos en tubos de recolección de sangre (por ejemplo, Vacutainer) que contienen heparina de litio como anticoagulante.
   2. Para garantizar la conservación adecuada de la muestra de sangre, comience el procedimiento dentro de las 24 h posteriores al muestreo.
   3. Añadir 300 μL de la muestra ....

Resultados

Los datos obtenidos por el análisis con microscopio de fluorescencia de linfocitos periféricos nos permiten evaluar tres aspectos principales: la efectividad del tratamiento con bleomicina para aumentar el número de focos de γH2AX y 53BP1 (y por lo tanto de DSB) debido a su efecto mutagénico, en qué medida ambos focos colocalizados en el sitio de los DSB, y el curso temporal de los focos de γH2AX y 53BP1 para delinear la cinética de reparación de los DSB inducidos por bleomicina. Como era de esperar, se observó una frecu.......

Discusión

El análisis de inmunofluorescencia de los focos γH2AX y 53BP1 es un método adecuado para evaluar el daño genómico en los núcleos de interfase de un sistema celular. Este procedimiento tiene varios puntos críticos que pueden afectar el resultado de los experimentos, principalmente, los agentes utilizados en la fijación y permeabilización, el tipo de anticuerpos y sus factores de dilución, y la concentración del mutágeno.

El mantenimiento de la integridad de las proteínas es fundamental ya que e.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
AlexaFluor 568 cabra anti-ratón IgG (γ 1)	Invitrogen	A21124	53BP1 anticuerpo secundario
Bleoprim	Sanofi		sulfato de bleomicina (mutágeno)
Solución de penicilina-estreptomicina 100X	Euroclon	ECB3001D	antibióticos para medio de cultivo
PBS 10X	Termofisher	14200075	Solución salina tamponada con fosfato
FBS	Euroclone	EC20180L	Suero fetal bovino para inmunofluorescencia
IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated	Termofisher	#35552	γ Anticuerpo secundario H2AX
Anticuerpo monoclonal anti-53BP1 de ratón	Merck	MAB 3802	53BP1 anticuerpo primario
Labophot 2	Microscopio de fluorescencia	Nikon
P-histona H2AX (Ser139) anticuerpo de conejo	Señalización celular	#2577	γ Anticuerpo primario H2AX
Fitohemoaglutinina	Termofisher	R30852801	componente del medio de cultivo
Reactivo antidecoloración de oro prolongado con DAPI	Cell Signaling	#8961	Solución antidecoloración con DAPI para contrarrestar la tinción
RPMI 1640	Euroclon	ECB9006L	medio de cultivo
Triton-X100	Sigma	T9284	Detergente no iónico para Permeabilización