En este artículo se informa de la construcción de células knockout de proteína E asociada al centrómero (CENP-E) utilizando el sistema CRISPR/Cas9 y tres estrategias de cribado basadas en el fenotipo. Hemos utilizado la línea celular knockout CENP-E para establecer un enfoque novedoso para validar la especificidad y toxicidad de los inhibidores de CENP-E, que es útil para el desarrollo de fármacos y la investigación biológica.
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Artículo de método
Generación de líneas celulares knockout de proteína E CENP-E-/- asociadas al centrómero utilizando el sistema CRISPR/Cas9
En este artículo
Resumen
Resumen
El sistema CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas)/Cas9 se ha convertido en una poderosa herramienta para la edición genética precisa y eficiente en una variedad de organismos. La proteína E ASOCIADA AL CENTRÓMERO (CENP-E) es una quinesina dirigida al extremo positivo necesaria para la captura del cinetocoro-microtúbulo, la alineación cromosómica y el punto de control de ensamblaje del huso. Aunque las funciones celulares de las proteínas CENP-E han sido bien estudiadas, ha sido difícil estudiar las funciones directas de las proteínas CENP-E utilizando protocolos tradicionales porque la ablación de CENP-E generalmente conduce a la activación del punto de control del ensamblaje del huso, la detención del ciclo celular y la muerte celular. En este estudio, hemos eliminado por completo el gen CENP-E en células HeLa humanas y hemos generado con éxito las células CENP-E-/- HeLa utilizando el sistema CRISPR/Cas9.
Se establecieron tres estrategias optimizadas de cribado basadas en el fenotipo, que incluyen el cribado de colonias celulares, los fenotipos de alineación cromosómica y las intensidades fluorescentes de las proteínas CENP-E, que mejoran eficazmente la eficacia del cribado y la tasa de éxito experimental de las células knockout CENP-E . Es importante destacar que la deleción de CENP-E da lugar a una desalineación cromosómica, a la localización anormal de las proteínas serina/treonina quinasa B (BubR1) del punto de control mitótico BUB1 y a defectos mitóticos. Además, hemos utilizado el modelo de células HeLa knockout de CENP-E para desarrollar un método de identificación de inhibidores específicos de CENP-E.
En este estudio, se ha establecido un enfoque útil para validar la especificidad y toxicidad de los inhibidores de CENP-E. Además, en este trabajo se presentan los protocolos de edición génica de CENP-E utilizando el sistema CRISPR/Cas9, que podría ser una poderosa herramienta para investigar los mecanismos de CENP-E en la división celular. Además, la línea celular knockout de CENP-E contribuiría al descubrimiento y validación de inhibidores de CENP-E, que tienen importantes implicaciones para el desarrollo de fármacos antitumorales, estudios de mecanismos de división celular en biología celular y aplicaciones clínicas.
Introducción
La edición genómica modificada media las modificaciones específicas de los genes en una variedad de células y organismos. En eucariotas, la mutagénesis específica del sitio puede introducirse mediante la aplicación de nucleasas específicas de secuencia que estimulan la recombinación homóloga del ADN diana1. En los últimos años, se han diseñado varias tecnologías de edición del genoma, incluidas las nucleasas de dedos de zinc (ZFN)2,3, las nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN)4,5 y las meganucleasas homing
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Protocolo
1. Construcción de los vectores knockout del gen CRISPR/Cas9
- Seleccione la secuencia de ADN genómico diana en el gen CENP-E humano (Acceso GenBank No. NM_001286734.2) y diseñar el sgRNA utilizando una herramienta de diseño CRISPR en línea (http://crispor.tefor.net/).
- Introduzca una sola secuencia genómica, seleccione el genoma de "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (conjunto de análisis hg38) + polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs): dbSNP148", y seleccione el motivo adyacente del protoespaciador "20 bp-NGG-spCas9". Elija dos secuencias guía, que incluyen sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' y sgRNA-2 5'-TTCTTTAG....
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Resultados
Las células CENP-E-/- HeLa se generaron con éxito utilizando el sistema CRISPR/Cas9 (Figura 1). La línea de tiempo y los pasos experimentales críticos de este método se muestran en la Figura 1. En primer lugar, diseñamos y sintetizamos los sgRNAs específicos de CENP-E, recocimos y ligamos los sgRNAs en el plásmido pX458, transfectamos el plásmido en células HeLa y las cultivamos durante 48 h. Las células transfectadas se disociaron y.......
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Discusión
La quinesina-7 CENP-E es un regulador clave en la alineación cromosómica y el punto de control de ensamblaje del huso durante la división celular 17,19,20. La deleción genética de CENP-E generalmente resulta en la activación del punto de control del ensamblaje del huso, la detención del ciclo celular y la muerte celular 27,29,51,52.
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a todos los miembros del Laboratorio de Citoesqueletos de la Universidad Médica de Fujian por sus útiles discusiones. Agradecemos a Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin y Min-Xia Wu del Centro de Servicios Públicos de Tecnología de la Universidad Médica de Fujian por su asistencia técnica. Agradecemos a Si-Yi Zheng, Ying Lin y Qi Ke del Centro de Enseñanza Experimental de Ciencias Médicas Básicas de la Universidad Médica de Fujian por su apoyo. Este estudio contó con el apoyo de las siguientes subvenciones: Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención número 82001608 y 82101678), Fundación de Ciencias Na....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| tubo de centrífuga de 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| Placa de 24 pocillos | Corning | 3524 | |
| 4S gelred, 10.000x en agua | Sangon Biotech (Shanghái) | A616697 | |
| tubo de centrífuga de 50 mL | Corning | 430828 | |
| placa de Petri de 6 cm | Corning | ||
| Etanol al 95% | Reactivo químico Sinopharm 10009164 | ||
| placa de 96 pocillos | Corning | 3599 | |
| Ácido acético | Reactivo químico Sinopharm 10000218 | disolver en H2O para preparar una solución de trabajo al 10%. | |
| Agarosa | Sangon Biotech (Shanghái) | A620014 | |
| Alexa Fluor 488-marcada con IgG (H+L) para cabra Anti-Mouse IgG(H+L) | Beyotime | A0428 | para inmunofluorescencia. Disolver en BSA/PBST al 1%. Dilución 1:500. |
| Alexa Fluor 488-marcado Cabra Anti-Conejo IgG(H+L) | Beyotime | A0423 | Para inmunofluorescencia. Disolver en BSA/PBST al 1%. Dilución 1:500. |
| Alexa Fluor 555-marcado Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) | Beyotime | A0460 | Para inmunofluorescencia. Disolver en BSA/PBST al 1%. Dilución 1:500. |
| Etanol anhidro | Sinopharm Chemical Reagent | 100092690 | |
| Anti-BubR1 anticuerpo monoclonal de conejo | Abcam | ab254326 | para inmunofluorescencia. Disolver en BSA/PBST al 1%. dilución 1:100 |
| Anticuerpo monoclonal de ratón anti-CENP-B | Santa Cruz Biotechnology | sc-376392 | Para inmunofluorescencia. Disolver en BSA/PBST al 1%. Dilución 1:50. |
| Anticuerpo monoclonal anti-CENP-E de conejo | Abcam | ab133583 | Para inmunofluorescencia. Disolver en BSA/PBST al 1%. Dilución 1:100. |
| Medio de montaje anti-decoloración | Beyotime | P0131 | Ralentización del enfriamiento de las señales fluorescentes. |
| Anticuerpo monoclonal de ratón anti-&alfa;-tubulina | Abcam | ab7291 | para inmunofluorescencia. Disolver en BSA/PBST al 1%. Dilución 1:100. |
| Biotek Epoch Espectrofotómetro de microplacas | Biotek Instruments | Biotek Epoch | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sinopharm Reactivo químico | 69003435 | |
| BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | |
| CellTiter 96 ensayo acuoso de proliferación celular en solución | promega | G3580 | |
| centrífuga | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Colchicina | Sinopharm Reactivo químico | 61001563 | |
| Microscopio de barrido confocal | Leica | Leica TCS SP8 | |
| Coverslip | CITOTEST | 80344-1220 | |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| DH5α células | competentes Sangon Biotech (Shanghai) | B528413 | |
| DL2000 Marcador de ADN | TaKaRa | 3427A | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
Endo-free plásmido mini kit  | Omega | D6950 | |
| Ezup Column Kit de purificación de ADN genómico animal | Sangon Biotech (Shanghai) | B518251 | |
| Suero fetal bovino | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 11011-8611 | |
| Violeta de genciana | Sinopharm Reactivo químico | 71019944 | Disolver en PBS para preparar violeta de genciana al 0,1% / PBS. |
| Solución de tinción Giemsa | Reactivo químico Sinopharm 71020260 | ||
| GraphPad Prisma versión 8.0 software | GraphPad | www.graphpad.com | Análisis estadístico. |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Línea celular HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| Incubadora humidificada | Heal Force | HF90/HF240 | |
| Software Image J | Institutos Nacionales de Salud | https://imagej.nih.gov/ij/ | Procesamiento y análisis de imágenes. |
| Microscopio invertido | Nanjing Jiangnan Novel Optics | XD-202 | |
| LB polvo de agar | Sangon Biotech (Shanghai) | A507003 | |
| reactivo de transfección Lipo6000 | Beyotime | C0526 | |
| Nikon Ti-S2 microscopio | Nikon | Ti-S2 | |
| Opti-MEM reducido suero medio | Gibco | 31985070 | |
| Paraformaldehído | Sinopharm Reactivo Químico | 80096618 | Disuelva en PBS para preparar paraformaldehído al 4% / PBS. |
| Solución de penicilina-estreptomicina | HyClone SV30010 | ||
| columna SanPrep kit de extracción de gel de ADN | Sangon Biotech (Shanghai) | B518131 | |
| SanPrep columna plásmido mini-preparaciones kit | Sangon Biotech (Shanghái) | B518191 | |
| T4 ADN ligasa | TaKaRa | 2011A | |
| T4 polinucleótido quinasa | TaKaRa | 2021A | |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | |
| Triton X-100 | Sinopharm Reactivo químico | 30188928 | Disolver en PBS para preparar Triton X-100/PBS al 0,25%. |
| Tween 20 | Sinopharm Reactivo Químico | 30189328 | Disolver en PBS para preparar 0.1% Tween 20/PBS. |
Referencias
- Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
- Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases.<....
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Reimpresiones y permisos
