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Artículo de método

Desarrollo de un compendio para el carcinoma de células escamosas de esófago

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DOI:

10.3791/65480

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12 de abril de 2024

 , 
1Amity Centre of Nanotechnology, Amity University Haryana, 2Amity Stem Cell Institute, Amity Medical School, Amity University Haryana, 3Clinical Biosamples & Research Services (CBRS)

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe una herramienta útil para identificar cambios moleculares significativos en el cáncer y conduce al desarrollo de nuevos enfoques diagnósticos y terapéuticos para el carcinoma de células escamosas de esófago.

Resumen

El cáncer de esófago (CE) se sitúa como la8ª neoplasia maligna más agresiva, y su tratamiento sigue siendo un reto debido a la falta de biomarcadores que faciliten la detección precoz. La CE se manifiesta en dos formas histológicas principales: adenocarcinoma (EAD) y carcinoma de células escamosas (ESCC), ambas con variaciones en la incidencia en poblaciones geográficamente distintas. Las tecnologías de alto rendimiento están transformando la comprensión de las enfermedades, incluido el cáncer. Un reto importante para la comunidad científica es tratar con datos dispersos en la literatura. Para abordar esto, se propone una tubería simple para el análisis de conjuntos de datos de microarrays disponibles públicamente y la colección de moléculas reguladas diferencialmente entre el cáncer y las condiciones normales. La tubería puede servir como un enfoque estándar para el análisis de expresión génica diferencial, identificando genes expresados diferencialmente entre tejidos cancerosos y normales o entre diferentes subtipos de cáncer. El proceso implica varios pasos, incluido el preprocesamiento de datos (que implica el control de calidad y la normalización de los datos brutos de expresión génica para eliminar las variaciones técnicas entre las muestras), el análisis de expresión diferencial (identificación de genes expresados diferencialmente entre dos o más grupos de muestras mediante pruebas estadísticas como las pruebas t, ANOVA o modelos lineales), análisis funcional (uso de herramientas bioinformáticas para identificar vías y funciones biológicas enriquecidas en genes expresados diferencialmente) y validación (que implica la validación utilizando conjuntos de datos independientes o métodos experimentales como qPCR o inmunohistoquímica). Con este tubería, se puede generar una colección de moléculas expresadas diferencialmente (DEM) para cualquier tipo de cáncer, incluido el cáncer de esófago. Este compendio se puede utilizar para identificar posibles biomarcadores y dianas farmacológicas para el cáncer y mejorar la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes a la enfermedad. Además, el cribado poblacional específico del cáncer de esófago mediante este proceso ayudará a identificar dianas farmacológicas específicas para distintas poblaciones, lo que conducirá a tratamientos personalizados para la enfermedad.

Introducción

Es alarmante que el AE sea el octavo cáncer más común en todo el mundo y la sexta causa de muerte en todo el mundo. China, India e Irán tienen tasas de incidencia y mortalidad alarmantemente altas. Existen dos tipos principales de CE: el adenocarcinoma de esófago (EAC o EAD) y el carcinoma de células escamosas de esófago (ESCC)1. La EAC es más común en el mundo occidental, mientras que la ESCC es más común en los países orientales, especialmente en China e Irán2. Varios factores de riesgo están asociados con la AE, incluyendo el consumo de tabaco y alcohol, la obesidad y la enfermedad por reflujo gastroesofágico (ERGE). Además, los factores dietéticos, como la falta de frutas y verduras y el consumo de bebidas y alimentos calientes, se asocian con el riesgo de ESCC en áreas de alto riesgo. El diagnóstico y el tratamiento tempranos son importantes para mejorar los resultados de los pacientes con CE 3,4. Por lo tanto, es importante crear conciencia sobre los factores de riesgo, los signos y los síntomas de la AE, y fomentar el cribado regular de las personas de alto riesgo. Además, los esfuerzos para abordar los factores de riesgo modificables, como el consumo de tabaco y alcohol y los hábitos dietéticos poco saludables, pueden ayudar a reducir la incidencia de AE. La EAD se produce en las células de las glándulas productoras de moco en la parte inferior del esófago, cerca del estómago. A menudo se asocia con la enfermedad por reflujo gastroesofágico, en la que el ácido y el contenido del estómago regresan al esófago. Por el contrario, la ESCC surge de células planas y delgadas que recubren la parte superior del esófago5. Es más común en áreas donde el consumo de tabaco y alcohol está muy extendido, como China e Irán.

Entre las diversas afecciones relacionadas con el esófago, el esófago de Barrett (EB), una afección en la que el revestimiento del esófago es reemplazado por células glandulares, es un precursor conocido de EAC6. Vale la pena señalar que el EB puede desarrollarse sin ERGE, pero la presencia de ERGE aumenta el riesgo de desarrollar EBE de 3 a 5 veces. Además, la presencia de EB aumenta el riesgo de desarrollar EAC entre 50 y 100 veces7. Además, los alimentos y líquidos calientes o picantes se han relacionado con la ESCC, pero no con la EAC. Comprender los factores de riesgo de la AE es importante para su prevención y detección temprana. Los esfuerzos para abordar los factores de riesgo modificables, como el consumo de tabaco, el consumo de alcohol, la obesidad y los hábitos dietéticos poco saludables, pueden ayudar a reducir la incidencia de AE. Además, el cribado y la vigilancia rutinarios de las personas de alto riesgo, como las que tienen disfagia o EB, pueden mejorar los resultados al permitir la detección y el tratamiento tempranos.

Es cierto que los estudios basados en ómicas, como la genómica, la transcriptómica, la proteómica, la metilomática, la miRNAomics y la metabolómica, han contribuido en gran medida a nuestra comprensión de las CE, especialmente de las ESCC 8,9,10,11,12,13. Estos estudios han permitido identificar nuevos biomarcadores, potenciales dianas terapéuticas y nuevas vías implicadas en el desarrollo y progresión de las ESCC. Sin embargo, los datos generados a partir de estos estudios se encuentran dispersos por toda la literatura, lo que dificulta el acceso y uso de esta información por parte de la comunidad científica. Por lo tanto, es importante crear un repositorio o base de datos que recopile los datos obtenidos de estudios de alto o bajo rendimiento sobre cánceres específicos. Un paquete de este tipo puede simplificarse y elaborarse mediante la aplicación de algunas directrices básicas. Estas directrices incluyen la selección de estudios relevantes, la extracción y organización de datos de estos estudios y la garantía de la calidad y coherencia de los datos. Además, el compendio debe actualizarse periódicamente para incluir nuevos estudios y datos a medida que estén disponibles. Los investigadores pueden usar una sola plataforma para recuperar y analizar datos sobre un cáncer específico mediante la creación de un compendio o base de datos que combine datos de diferentes estudios. Esto ayudará a acelerar los esfuerzos de investigación y, en última instancia, conducirá a tratamientos más efectivos y mejores resultados para los pacientes con cáncer.

El desarrollo del compendio de cáncer incorpora datos de estudios de bajo y alto rendimiento. Este compendio será un recurso valioso para los investigadores que buscan identificar posibles objetivos diagnósticos o terapéuticos para el cáncer. Una forma de construir esta colección es mediante la revisión de estudios de microarrays disponibles en repositorios de acceso público como Gene Expression Omnibus (GEO). Los estudios de microarrays pueden proporcionar información sobre los niveles de expresión génica en las células cancerosas, y estos datos se pueden utilizar para identificar genes expresados diferencialmente (DEG) que pueden desempeñar un papel en el desarrollo y la progresión del cáncer.

Sin embargo, debe tenerse en cuenta que diferentes estudios pueden haber utilizado diferentes métodos para analizar sus datos, lo que puede haber llevado a la identificación de diferentes DEG. Por lo tanto, es importante revisar cuidadosamente cada estudio y considerar cualquier posible sesgo o limitación al agrupar los datos para el compendio. Una vez que los datos se recopilan en una plataforma común, los investigadores pueden usarlos para identificar posibles objetivos moleculares para estudios posteriores. Estos incluyen el examen de la expresión de un gen en particular en muestras clínicas o la realización de estudios mecanicistas para comprender cómo un gen o proteína en particular está involucrado en el desarrollo y la progresión del cáncer. En general, la creación de un conjunto de datos sobre el cáncer será un recurso valioso para los investigadores del cáncer y ayudará a identificar nuevos objetivos para el diagnóstico y las intervenciones terapéuticas.

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Protocolo

1. Curación manual de las moléculas reguladas diferencialmente en ESCC

  1. Encontrar estudios relevantes de bajo rendimiento utilizando PubMed
    NOTA: Es importante comprender la diferencia básica entre las técnicas de bajo rendimiento y las de alto rendimiento. En el primer caso, solo se estudia un número limitado de muestras, y el proceso suele llevar mucho tiempo, por el contrario, más tarde es más rápido y el número de muestras se puede analizar de una sola vez, lo que es significativamente mayor que en los métodos de bajo rendimiento, como el Northern blot y el Western blot, que son técnicas de bajo rendimiento, mientras que el microarray de ADNc y la proteómica cuantitativa basada en LC-MS/MS son técnicas de alto rendimiento14. Los motores de búsqueda como NCBI-PubMed (ver Tabla de Materiales) son una buena fuente para encontrar estudios relevantes para cualquier cáncer, ya que es un recurso disponible públicamente para que los científicos biomédicos encuentren literatura sobre cualquier enfermedad como ESCC. Para encontrar estudios relevantes, se deben seguir los siguientes pasos.
    1. Haga clic en el motor de búsqueda de Google (ver Tabla de Materiales) para abrirlo. Esto también es utilizado por los investigadores, ya que hay revistas que no están indexadas en PubMed, pero siguen siendo artículos de buena calidad. Siempre es bueno buscar en más de un motor de búsqueda para anular la probabilidad de perderse algún artículo importante.
    2. Seleccione la barra de búsqueda de PubMed y use operadores booleanos (AND, OR, NOT). Los operadores booleanos refinan los buscadores a las palabras clave relevantes utilizadas por los investigadores para encontrar los resultados.

2. Encontrar estudios relevantes usando PubMed

  1. Escriba NCBI web-address (consulte la tabla de materiales) y haga clic para abrirla.
  2. Seleccione PubMed en el menú de la barra lateral izquierda en la pestaña Todas las bases de datos .
  3. Escriba en la barra de búsqueda las palabras clave relevantes, que obtendrán los artículos relevantes. Las palabras clave deben usarse en combinación con los operadores booleanos, ya que estos podrían ayudar a obtener los artículos que están estrechamente relacionados con el cáncer / enfermedad en cuestión (por ejemplo, carcinoma de células escamosas de esófago).

3. Búsqueda de estudios relevantes utilizando el ómnibus de expresión génica (GEO)

NOTA: Gene expression omnibus (GEO) es un repositorio disponible gratuitamente para almacenar datos en microarrays de ADN. La gran cantidad de datos disponibles en GEO es un buen recurso para la minería de datos con el fin de identificar moléculas reguladas diferencialmente entre el cáncer/enfermedades y las condiciones normales.

  1. Escriba la dirección web GEO (consulte la Tabla de materiales) y haga clic para abrirla.
  2. Escriba Carcinoma de células escamosas de esófago Y Homo sapiens y pulse Intro.
    NOTA: Para hacer un compendio de genes regulados diferencialmente para el cáncer, es importante seleccionar los estudios relevantes de donde los investigadores seleccionarán las moléculas que están reguladas diferencialmente entre el cáncer y las condiciones normales. El aspecto principal es establecer los criterios para la selección de moléculas en función del cambio de pliegue. El cambio de plegamiento indicará si un gen/proteína está regulado al alza o a la baja. El cambio de pliegue y los valores de corte del valor p pueden alterar significativamente el significado de los datos en un experimento dado, incluidos los estudios de microarrays, RNAseq o proteómica15.

4. Análisis de microarrays con GEO2R

NOTA: Lo primero es encontrar estudios relevantes utilizando operadores booleanos (AND, OR, NOT). Se utilizarán en combinación con las palabras clave 'carcinoma de células escamosas de esófago', 'ESCC' o 'carcinoma de células escamosas de esófago'. GEO2R (ver Tabla de Materiales) es un paquete de lenguaje R de libre acceso que está integrado con GEO, lo que permite a los usuarios analizar datos de estudios de microarrays de una manera fácil de usar. Interactúa con los ID de entrada GEO y proporciona una interfaz para realizar análisis complejos basados en R para identificar DEG utilizando paquetes Bioconductor R para el back-end. Este paquete no solo transforma los datos GEO, sino que también presenta su salida en forma de tablas .txt, que pueden modificarse aún más según las necesidades de los usuarios16. El paquete GEO2R presenta los genes en un orden de significación estadística basado en el valor p, pero el orden se puede ordenar en función del cambio logarítmicode 2 veces. Además, los usuarios pueden ver los perfiles de expresión génica como imágenes de perfil GEO. A diferencia de otras herramientas de análisis, GEO2R es independiente de los registros de conjuntos de datos seleccionados y puede interrogar datos reales enviados directamente por los investigadores. Más del 90% de los estudios GEO pueden ser analizados utilizando este método17. En la Figura 1 se muestra el flujo de trabajo de GEO2R con los pasos involucrados en el análisis de datos de microarrays utilizando GEO2R.

  1. Abre el sitio web de GEO2R.
  2. Introduzca la adhesión GSE utilizando el GEO en el espacio de búsqueda etiquetado como "Adhesión GEO" y haga clic en el botón Establecer. Cree las etiquetas cáncer y luego normal.
  3. Asigne muestras en función del tipo asignando primero Cáncer seguido de Normal.
  4. Haga clic en Analizar sin cambiar ningún parámetro predeterminado.
  5. Haga clic en la lista completa de genes y descargue los datos en formato de archivo .tsv. .tsv debe convertirse en .xlsx antes de seguir procesando los datos.
  6. Convierta el cambio logarítmicode 2 veces en cambio de pliegue usando la fórmula [=(2)^(Nx), donde N es la posición de la celda] en el excel.
  7. Además, someta los datos obtenidos en el paso 4.6 para obtener los DEG aplicando una tasa de descubrimiento falso (FDR) del 5% o un valor p ajustado (valor p ajustado) <0,05, y un cambio de >2,0 veces para los genes regulados al alza y un cambio de <0,5 veces para los genes regulados a la baja.
    NOTA: FDR es una corrección aplicada a los valores p para tener en cuenta múltiples pruebas, y estos dos no se pueden tratar como sinónimos entre sí. El ajuste de FDR es crucial para controlar la tasa de falsos descubrimientos cuando se realiza un gran número de pruebas de hipótesis.
  8. Identifique la lista de genes únicos en comparación con el estudio publicado anteriormente sometiendo los DEG utilizando una herramienta generadora de diagramas de Venn disponible en línea y gratuitamente (Pangloss) para generar el diagrama de Venn para la segregación de DEG comunes y únicos (ver Tabla de materiales).
  9. Además, someta la lista única de genes para identificar la Ontología de Genes.
    NOTA: Diferentes funciones de GO como Ontología de Genes: Función Molecular (GO: MF), Ontología de Genes: Procesos Biológicos (GO: BP) y Ontología de Genes: Componente Celular (GO: CC) se pueden generar utilizando g: Profiler (ver Tabla de Materiales) o PANTHER (ver Tabla de Materiales), ambos son programas en línea disponibles gratuitamente. El análisis basado en GO se realiza con g: Profiler.
  10. Para obtener la distribución de DEGs en el genoma de cromosomas individuales, utilice ShinyGO (ver Tabla de Materiales).
  11. Pegue toda la lista de genes únicos obtenidos de GEO2R en la pestaña de búsqueda de ShinyGO, y la especie mejor coincidente seleccionada fue Homo sapiens. El punto de corte utilizado por FDR fue del 5%.
  12. Realizar la selección de DEGs obtenidos de GEO2R para su posterior estudio de validación a nivel de proteína. En la Figura 2 se muestra el flujo de trabajo para extraer la información adicional pero crucial sobre los DEG.

5. Encontrar un alias para un gen/proteína

  1. Abra la página de HPRD (consulte la Tabla de materiales) y haga clic en el botón Consulta .
  2. Introduzca el nombre de la proteína o el identificador HPRD en la pestaña de búsqueda correspondiente, pulse el botón Buscar en la parte inferior
    NOTA: Habrá una página abierta que tiene una pestaña etiquetada como "NOMBRES ALTERNATIVOS", haga clic en ella y aparecerá el alias de este gen o proteína.

6. Encontrar el símbolo genético oficial de los DEG

  1. Para encontrar el símbolo genético oficial, abra el Comité de Nomenclatura Genética de HUGO (HGNC) (consulte la Tabla de materiales).
  2. Escriba el nombre obtenido en el análisis GEO2R en la barra de búsqueda de la página HGNC y haga clic en el símbolo de búsqueda . Los resultados de la búsqueda mostrarán a qué símbolo genético oficial coincide exactamente el término.
  3. Haga clic en ese enlace y descubra el "símbolo genético" oficial mencionado allí.

7. Encontrar el locus genético de los DEG

  1. Abra la página de genes visitando el enlace en NCBI.
  2. Escriba el símbolo oficial del gen y haga clic en buscar.
  3. En el resultado, verifique cuidadosamente el gen y el organismo al que pertenece. Una vez que se haya asegurado de que la coincidencia es correcta, haga clic en el enlace y continúe.
    NOTA: En resumen, bajo el epígrafe "Contexto genómico" habrá una ubicación que en realidad es el locus del gen.

8. Búsqueda de información sobre los DEGs en OMIM Pagegene locus de los DEGs

  1. Abra la página OMIM (consulte Tabla de materiales).
  2. Introduzca el nombre o el símbolo del gen de la información del gen, en particular "gen-fenotipo".
  3. Haga clic en el botón de búsqueda y aparecerán los resultados del gen de interés. La pantalla proporciona información sobre la "Relación gen-fenotipo".

9. Encontrar la localización de la proteína, el dominio y el motivo, y la naturaleza secretora de la proteína codificada por el gen

  1. Abra la página HPRD (ver Tabla de Materiales).
  2. Una vez abierto, introduzca el nombre de la proteína o el identificador HPRD en la pestaña de búsqueda respectiva y pulse el botón Buscar en la parte inferior.
  3. Habrá una página abierta que tiene una pestaña etiquetada como "Resumen". Desplácese por completo en la página y consulte la pestaña de localización para conocer la localización principal y la "secundaria" alternativa.
    NOTA: En la misma página, debajo de "localización" hay una pestaña "Dominios y motivos" donde se enumeran los dominios y motivos de la proteína de interés (si los hay). De nuevo en la misma página, junto a la pestaña "Dominios y motivos" hay una pestaña "Expresión" con la subpestaña "sitio de expresión". Cualquier proteína que se haya reportado como detectada en cualquier fluido biológico puede ser considerada como "secretora" en la naturaleza. Si se ha reportado proteína de interés en alguno de los fluidos biológicos como plasma, suero, semen, lágrimas extra, se enumerará allí.

10. Selección selectiva de la proteína para su validación y evaluación posterior para el diagnóstico o pronóstico de la neoplasia maligna de interés

NOTA: Una vez que se identifican las moléculas únicas, el mayor desafío es cómo validarlas. Por lo general, el estudio de microarrays proporciona expresión a los niveles de ARNm, pero para el diagnóstico o pronóstico de la enfermedad, la lectura de los niveles de proteínas es crucial. Para el mismo, se deben examinar las muestras o líneas celulares de los pacientes o pacientes derivados del mismo cáncer para saber si la molécula se expresa realmente allí y si es capaz de discriminar entre cáncer vs. pronóstico normal, o bueno vs. malo, o diferenciar entre etapas tempranas y tardías de las enfermedades. Para validar la molécula candidata, el Western blot, los ensayos de inmunoadsorción enzimática, es decir, ELISA, inmunoprecipitación, inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o ensayo son técnicas útiles 18,19,20. Al mismo tiempo, todos estos ensayos requieren anticuerpos para detectar el antígeno presente en las muestras. Los anticuerpos son artículos costosos, por lo que siempre es mejor seleccionar los anticuerpos en función de los siguientes puntos:

  1. Compruebe si el anticuerpo ya informó de algún trabajo de investigación publicado anteriormente en otras neoplasias malignas.
  2. De lo contrario, consulte a la compañía proveedora de anticuerpos y vea si proporcionan una hoja de datos con una imagen del blot, o inmunocitoquímica, o inmunohistoquímica.
    NOTA: Si se desea realizar inmunohistoquímica, pero el anticuerpo solo está disponible para el ensayo ELISA, esto puede ser un riesgo para usar el anticuerpo, especialmente si la molécula objetivo es una molécula portadora de dominio transmembrana pero no el péptido señal. Además, si el anticuerpo es monoclonal o policlonal, es mejor preferir un anticuerpo monoclonal.

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Resultados

A modo de ejemplo, se utilizó el GSE161533 de acceso GEO para estudiar genes explorados diferencialmente en ESCC. Los resultados representativos del análisis se han mostrado en la Figura 3. GEO2R genera un diagrama de volcanes que es útil para identificar eventos que difieren significativamente entre dos grupos de sujetos experimentales. El gráfico del volcán presenta la distribución general de genes con una significación transformada de -log 10 (valor p) en el eje y, y c...

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Discusión

Desde la participación de las técnicas OMICS de alto rendimiento en la biología del cáncer, la tasa de generación de datos ha aumentado significativamente. Esto plantea un desafío para los investigadores, especialmente para aquellos que no tienen conocimientos informáticos. Para superar el paso de los años, a los bioinformáticos se les ocurre la idea de desarrollar una base de datos para proporcionar datos de manera organizada. Esto generó una respuesta positiva de los investigadores, es...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

MKK es beneficiario de la beca TARE (Subvención # TAR/2018/001054) (Subvención # 5/13/55/2020/NCD-III) de la Junta de Investigación en Ciencia e Ingeniería (SERB), Departamento de Ciencia y Tecnología, y el Consejo Indio de Investigación Médica (ICMR), Gobierno de la India, Nueva Delhi, respectivamente.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
NCBI-PUBMEDNCBIRefiriéndose a la sección 1. requerido para buscar en la literatura
Una computadora portátil / macbook o computadora personal con acceso a Internet y un navegador web.
g:ProfilerELIXIRinfrastructure https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gostSe refiere a la sección 4.10. requerido para el enriquecimiento de GO:MF, GO:BP y GO:CC
Expresión génica ómnibusNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/Se refiere a la sección 3.1. requerido para buscar en la base de datos de estudio de microarrays
GEO2RNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/Refiriéndose a la sección 3.2. requerido para analizar los datos utilizando la herramienta GEO2R
GoogleGoogle https://www.google.comRefiriéndose a la sección 1.1. requerido para buscar en la literatura
HGNC HGNCes un comité de la Organización del Genoma Humano (HUGO)https://www.genenames.orgRefiriéndose a la sección 6.1 requerido para conocer el símbolo genético oficial de los DEG 
Instituto de Bioinformática HPRD, Bangluru http://hprd.orgReferencia a la sección 5.1 requerida para obtener información sobre la arquitectura de las proteínas 
OMIM  Universidad Johns Hopkins, Baltimorehttp://www.omim.org/entryRefiriéndose a la sección 8.1 requerido para conocer el ID OMIM de un gen en particular / DEG
Pangloss ProgramDesarrollado por Chris Seidelhttp://www.pangloss.com/seidel/Protocols/venn.cgiRefiriéndose a la sección 4.9. requerido para generar el diagrama de Venn
PANTHERLaboratorio Thomas de la Universidad del Sur de Californiahttp://www.pantherdb.org/geneListAnalysis.doReferencia a la sección 4.10. requerido para el enriquecimiento de GO:MF, GO:BP y GO:CC
ShinyGO Universidad Estatal de Dakota del Surhttp://bioinformatics.sdstate.edu/goRefiriéndose a la sección 4.10. requerida para la asignación de DEG en los cromosomas
https://ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

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