Transformación de la raíz peluda de soja para el análisis de la función génica

La soja (Glycine max) es uno de los cultivos más valiosos en la agricultura. Tiene miles de usos comerciales e industriales, como alimentos, piensos, aceite y como fuente de materias primas para la fabricación¹. Su capacidad para formar una relación simbiótica con los microorganismos del suelo fijadores de nitrógeno, a saber, los rizobios, eleva aún más la importancia de estudiar la genética de la soja². Por ejemplo, ajustar las propiedades de fijación de nitrógeno en las raíces de soja puede conducir a la reducción de las emisiones de carbono y reducir en gran medida los requisitos de fertilizante nitrogenado³. Por lo tanto, comprender la genética que controla aspectos de la biología de la raíz de la soja, en particular, tiene amplias aplicaciones en la agricultura y la industria. Teniendo en cuenta estos beneficios, es importante contar con un protocolo confiable para analizar la función de los genes de la soja.

Agrobacterium tumefaciens es quizás la herramienta más utilizada para la transformación genética de plantas, ya que tiene la capacidad de integrar el ADN de transferencia (ADN-T) en el genoma nuclear de muchas especies de plantas. Cuando Agrobacterium infecta una planta, transfiere el plásmido inductor de tumores (Ti) al cromosoma huésped, lo que lleva a la formación de un tumor en el sitio de la infección. La transformación mediada por Agrobacterium ha sido ampliamente utilizada durante décadas para el análisis funcional de genes y para modificar los rasgos de los cultivos⁴. Aunque cualquier gen de interés puede transferirse fácilmente a las células vegetales huésped a través de la transformación mediada por A. tumefaciens, este método tiene varios inconvenientes; Requiere mucho tiempo, es costoso y requiere una amplia experiencia para muchas especies de plantas, como la soja. Aunque algunas variedades de soja pueden ser transformadas por el enfoque de nodo cotiledonario utilizando A. tumefaciens, la ineficiencia de este enfoque requiere la necesidad de una tecnología alternativa de transformación genética que sea rápida y altamente eficiente ^4,5. Incluso un no experto puede usar este método de transformación de raíz pilosa (HR) mediado por Agrobacterium rhizogenes para superar estas desventajas.

La transformación de HR es una herramienta relativamente rápida, no solo para analizar la función de los genes, sino también para aplicaciones biotecnológicas, como la producción de metabolitos especializados y productos químicos finos, y glicoproteínas bioactivas complejas⁶. La producción de HRs de soja no requiere una amplia experiencia, ya que pueden generarse hiriendo las superficies de los cotiledones, seguido de la inoculación con Agrobacterium rhizogenes⁷. A. rhizogenes expresa genes de virulencia (Vir) codificados por su plásmido Ti que transfieren, transportan e integran su segmento de ADN-T en el genoma de las células vegetales mientras estimulan simultáneamente el crecimiento de raíces ectópicas⁸.

En comparación con otros sistemas de expresión génica de soja, como los biolistics o la transformación de tejidos, células y cultivos de órganos basados en A. tumefaciens, el sistema de expresión de HR exhibe varias ventajas. En primer lugar, los HR son genéticamente estables y se producen rápidamente en medios libres de hormonas ^1,9,10. Además, los HR pueden producir metabolitos especializados en cantidades equivalentes o mayores que las raíces nativas^11,12. Estas ventajas hacen de los HR una herramienta biotecnológica deseable para especies vegetales que son incompatibles con A. tumefaciens o que requieren condiciones especiales de cultivo de tejidos para formar tejidos compatibles. El método HR es un enfoque eficiente para analizar las interacciones proteína-proteína, la localización subcelular de proteínas, la producción de proteínas recombinantes, la fitorremediación, la mutagénesis y los efectos de todo el genoma utilizando la secuenciación de ARN^13,14,15. También puede ser utilizado para estudiar la producción de metabolitos especializados que tienen valor en la industria, incluyendo glicomolinas, que medican la defensa de la soja contra el importante patógeno microbiano Phytophthora sojae y tienen impresionantes actividades anticancerígenas y neuroprotectoras en humanos^16,17.

Este informe demuestra un protocolo fácil y eficiente para producir HR de soja. En comparación con los métodos anteriores de transformación de HR, este protocolo proporciona una mejora significativa (33% -50%) en la tasa de formación de HR mediante la preselección de transformadores de A. rhizogenes para detectar la presencia del plásmido Ti antes de inocular cotiledones de soja. Demostramos la aplicabilidad de este protocolo transformando varios vectores binarios que sobreexpresan o silencian los genes del factor de transcripción de soja.

NOTA: Se recomienda que todos los pasos del procedimiento se lleven a cabo en condiciones estériles.

1. Esterilización de semillas de soja

1. En un gabinete de bioseguridad, coloque 16-20 semillas de soja Williams 82 redondas en perfectas condiciones (es decir, sin grietas ni manchas) en un tubo de centrífuga de 50 ml.
2. Agregue 30 ml de alcohol isopropílico al 70%, agite suavemente durante 30 s y luego decanta el alcohol.
3. Agitar suavemente las semillas con 30 ml de lejía al 10% durante 10 s y dejar que las semillas reposen en la solución durante 5 min a temperatura ambiente (RT, 25 °C). Después de 5 minutos, escurrir la lejía.
4. Repita la agitación tres veces con 30 mL de H2O ultrapuro estéril durante 1 minuto por enjuague y deseche el_H2Oentrecada enjuague.
5. Coloque las semillas esterilizadas en papel de filtro saturado con 5 ml de medio de germinación y cocultivo (GC) (medio líquido de autoclave de media fuerza Murashige y Skoog [MS] con 1% de sacarosa [pH = 5.8] y luego agregue 2.5 ml / L de vitaminas) en placas de Petri estériles.
6. Coloque las placas en la oscuridad a RT (25 °C) durante 3 días antes de transferir las placas a 22 °C bajo 16 h de luces fluorescentes T5 de color blanco frío (100 μE ^m-2·s-1) durante 4 días para permitir que las semillas germinen.
   NOTA: Deseche las semillas que están arrugadas o agrietadas. Las mejores semillas son aquellas que son grandes y uniformemente amarillas. Esterilice al menos el doble del número de semillas requeridas para el experimento para seleccionar semillas de buena calidad, ya que algunas semillas pueden no ser óptimas debido a daños, enfermedades o falta de germinación.

2. Infección de cotiledones con K599

NOTA: Utilice vectores de la serie pGWB, ya que su selección dual garantiza la integración genómica de todo el casete de ADN-T. La electroporación se utilizó para transformar un vector binario que alberga el gen de interés en A. rhizogenes pRi2659¹⁸.

1. En base a la secuencia del plásmido A. rhizogenes pRi2659¹⁸, se diseñaron cebadores para detectar el plásmido Ti del gen VirD2 (VirD2 hacia adelante: 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'; Reverso de VirD2: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; Tamaño de amplificación esperado: 221 pb). Después de la transformación, pruebe las colonias de Agrobacterium para la retención de VirD2 por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando un kit de PCR (consulte la Tabla de materiales). Ciclo de PCR: 94 °C durante 3 min; 35 ciclos (94 °C durante 1 min, 58 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 1 min); y 72 °C durante 10 min.
2. Tras la selección de la colonia de A. rhizogenes que contiene tanto VirD2 como el gen de interés (GOI), colocar algunas placas medianas de Luria-Bertani (LB) que contengan los antibióticos apropiados (50 mg/L) para el plásmido de interés e incubar durante la noche a 30 °C. Si usa espectinomicina, agregue una concentración de 100 mg / L.
3. Utilice una punta de pipeta P200 para raspar una longitud de ~1,5 cm de la K599 Agrobacterium de las placas LB y resuspender las células en 1 ml de tampón fosfato (PB; 0,01 M Na₂HPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,5).
4. Diluir el Agrobacterium en_H2Oultrapuro esterilizado (v/v = 1:1) y acetosiringona (AS; 100 mM de stock en dimetilsulfóxido [DMSO], v/v = 1:1000). Mida la absorbancia utilizando un tubo de cubeta a una densidad óptica de 600 nm (OD600). El rango óptimo esperado está entre 0,5 y 0,8.
5. En un gabinete de bioseguridad, sumerja un bisturí esterilizado en la solución K599 Agrobacterium y haga varios cortes profundos de 1 mm a lo largo de la superficie interna (adaxial, lado plano) del cotiledón. Durante la inoculación, use fórceps esterilizados para estabilizar el cotiledón.
6. Coloque alrededor de 6-8 cotiledones cortados con el lado hacia abajo en una placa de Petri que contenga papel de filtro saturado con medio GC con AS.
   NOTA: Para preparar 6 placas, 50 mL de medio GC y 50 μL de 100 mM AS para alcanzar una concentración final de 100 μM es suficiente.
7. Incubar las placas a RT (25 °C) durante 3 días bajo un fotoperiodo de 16 h (~65 μE).
8. Transfiera los cotiledones infectados a placas de crecimiento de raíces peludas (HRG) (MS de fuerza media en autoclave con sacarosa al 3% [pH = 5.8] y 2.6 g / L de Gelzan, luego agregue una mezcla de vitaminas de 2.5 ml / L y 500 mg / L de timentina).
   NOTA: Hubo algunos problemas con la timentina de algunos proveedores alternativos, de los cuales el K599 no fue eliminado. Se recomienda utilizar placas de Petri más altas (100 mm x 25 mm) para el medio HRG.
9. Incubar las placas de HRG a 22 °C en una cámara de crecimiento con los parámetros ajustados a 100 μE de luz en un fotoperiodo de 16 h hasta que se observen raíces primarias con raíces secundarias de 2-3 cm de longitud (~3-4 semanas).

3. Selección y recolección de HRs

1. Cosecha raíces primarias (5-7 cm de longitud) que crecen desde el callo y contienen raíces secundarias (2-3 cm de longitud) usando un bisturí estéril y fórceps. Transfiera a la selección las placas de HRG que contienen los antibióticos apropiados. Deje que los HR crezcan durante 5 días más en las placas HRG de selección.
   NOTA: Kanamicina (50 mg/L), higromicina (50 mg/L) o fosfinotricina (10 mg/L) se utilizan típicamente para la selección. Para vectores de expresión, pGWB2 se usa para la sobreexpresión, pANDA35HK se usa para silenciar ARNi, pGWB6 se usa para localización subcelular y pMDC7 se usa para expresión inducible.
2. En el día 5, cosechar HRs transgénicos con raíces secundarias de 3-6 cm de longitud. Si se observan proteínas fluorescentes, las raíces secundarias tienen poca autofluorescencia. Si realiza tratamientos elicitores o químicos, corte las raíces secundarias en trozos de 1 cm y coloque ~ 100 mg en agar HRG en una pila. A continuación, saturar las pilas con 80 μL del tratamiento adecuado y dejar que las placas se incuben a RT (25 °C).
3. Después del tiempo de tratamiento deseado, proceda con extracciones de ARN o metabolitos.
4. Para el ARN, seque rápidamente las raíces en una toalla de papel esterilizada y coseche directamente en un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
5. Selle inmediatamente la parte superior del tubo con parafilm, haga dos orificios pequeños con pinzas puntiagudas y sumerja los tubos en nitrógeno líquido. Liofilizar durante 3 días, luego almacenar las muestras a -80 °C.
   NOTA: Es esencial seleccionar HR que sean blancos. Después de 5 días de crecimiento en la placa selectiva, las HR transgénicas permanecerán blancas, pero las raíces no transgénicas se volverán marrones.

Los resultados representativos provienen de los datos publicados19,20. Los resultados de la PCR de colonias (cPCR) de la K599 Agrobacterium transformada se muestran en la Figura 1. Como indican las colonias positivas en la Figura 1, el gen de interés fue detectado por cPCR (Figura 1A). Sin embargo, entre un tercio y la mitad de las colonias fueron negativas para el cribado del gen VirD2 (Figura 1B), lo que indica la pérdida del plásmido Ti, y serían incapaces de generar callos o raíces peludas. La Figura 2 ilustra el procedimiento general de preparación de HR de soja y el análisis de expresión génica. La Figura 3 muestra la localización subcelular de GFP-GmJAZ1-6. La Figura 4 es un análisis de expresión génica que muestra la sobreexpresión del factor de transcripción de gliceolina GmHSF6-1 y el silenciamiento de ARNi de GmMYB29A2 en raíces peludas de Williams 82. Resultados similares se han obtenido en varios informes recientes20,21.

Figura 1: PCR de colonias (cPCR) de la Agrobacteria K599 utilizando cebadores de PCR de colonias del gen de interés o VirD2. (A) Gen de interés cPCR. (B) VirD2 cPCR. Abreviaturas: C = colonia; +ve = control positivo; -ve = control negativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Descripción general del cultivo de raíz pilosa de soja (HR) y procedimiento de análisis de la función génica. Callos formados en el sitio de la herida 2 semanas después de la infección por K599 Agrobacterium . La diferenciación celular ocurrió después de 1 semana, luego transcurrió 1 semana para el alargamiento de la FC. Esto fue seguido por la recolección HR y el elicitor de glucano de pared (WGE) / tratamiento simulado durante 24 h. Los HR se sometieron a extracción de metabolitos para análisis de cromatografía líquida de ultra resolución (UPLC) y aislamiento de ARN para análisis de expresión génica, respectivamente. WGE es el elicitor de glucano de pared de Phytophthora sojae. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Microscopía de fluorescencia de GmJAZ1-6 fusionada traduccionalmente a una proteína fluorescente verde (GFP) en raíces transgénicas Williams 82 peludas. (A) Canal verde (GFP). (B) Canal azul (DAPI). (C) Canales verdes y azules fusionados. Todas las imágenes fueron recolectadas usando un microscopio confocal Zeiss. Las imágenes DAPI (6 μg/mL) indican tinción nuclear. Las barras de escala son de 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis de expresión génica. (A) Expresión génica en la sobreexpresión de GmHSF6-119 Williams 82 HRs de soja bajo tratamiento simulado de 24 h o provocado durante 24 h con WGE. (B) Expresión génica en RNAi-GmMYB29A2 20 Williams 82 HRs de soja provocados durante 24 h con WGE. WGE es el elicitor de glucano de pared de Phytophthora sojae. unSignificativamente mayor y bsignificativamente menor que el control, estudiantes pareados t-test (p < 0,01). Las barras de error representan SE (n ≥ 3 réplicas biológicas). Las raíces secundarias recolectadas de una raíz primaria indicaron una réplica biológica. Esta cifra ha sido modificada con permiso de Lin et al.19 y Jahan et al.20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.