Un modelo de criolesión para estudiar la regeneración del músculo esquelético del pedúnculo caudal en peces cebra adultos

En los vertebrados, las partes dañadas de varios tejidos se someten a renovación y restauración homeostática durante la vida útil. Esta capacidad de renovación y restauración depende típicamente de la presencia de células madre competentes o de la capacidad proliferativa de las células maduras ^1,2. El músculo esquelético comprende miofibras postmitóticas, que están asociadas con células madre locales, llamadas células satélite 3,4,5,6. Por lo tanto, este tejido contiene fuentes celulares para el sellado eficiente de áreas de continuidad interrumpida o para la reparación de heridas menores. Sin embargo, las mayores pérdidas volumétricas en el músculo esquelético de los mamíferos a menudo son seguidas por una reparación no regenerativa, como la fibrosis⁷. Los modelos animales podrían proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos biológicos que promueven la regeneración de órganos extensamente dañados.

El pez cebra es un organismo modelo bien establecido con una alta capacidad regenerativa. El pez cebra adulto puede regenerar una parte amputada de su aleta caudal o el ápice resecado del ventrículo cardíaco 8,9,10,11. Además, se ha aplicado previamente un método de criolesión para estudiar la regeneración de aletas y corazón en peces cebra^12,13,14,15. En el caso de los órganos internos, el método de criolesión tiene la ventaja de inducir la muerte celular sin alterar la integridad del órgano, imitando así las condiciones fisiológicas^16,17. Los restos de tejido se desintegran por la eliminación natural durante la cicatrización de la herida, seguida de los procesos reparadores. Sin embargo, queda por establecer si este método podría aplicarse al músculo esquelético.

En los peces, la musculatura lateral permite la flexión de lado a lado del tronco durante la natación¹⁸. Los músculos esqueléticos están organizados en unidades metaméricas, llamadas miómeros, que están separadas por tejido conectivo ^5,19. El pez cebra puede regenerar su músculo después de pequeñas alteraciones tisulares, como las causadas por la ablación con láser o una puñalada 20,21,22,23,24^, pero aún se desconoce si los miómeros enteros pueden regenerarse después de una lesión extensa. Esta brecha en el conocimiento se debe probablemente a la falta de un modelo de lesión adecuado. Este protocolo establece un nuevo enfoque para inducir una lesión extensa del músculo esquelético, que abarca múltiples miómeros. El método de criolesión descrito se basa en la rápida congelación y descongelación de las miofibras con un instrumento de acero inoxidable preenfriado. A pesar del extenso daño, el bienestar de los peces no se vio gravemente afectado. Se podrían restaurar miómeros enteros y, por lo tanto, este trabajo proporciona un nuevo sistema modelo para estudiar los mecanismos de regeneración de la musculatura en peces cebra adultos.

Este estudio se realizó de acuerdo con todas las regulaciones éticas relevantes. El pez cebra fue criado, criado y mantenido de acuerdo con las directrices de la Federación Europea de Asociaciones de Ciencia de Animales de Laboratorio (FELASA)²⁵. El alojamiento de los animales y todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por la oficina veterinaria cantonal de Friburgo, Suiza.

1. Equipo y configuración

1. Organizar la producción de una criosonda de acero inoxidable en un taller técnico que pueda fabricar instrumentos para la investigación.
   NOTA: Proporcione un diseño del instrumento con las dimensiones específicas (Figura 1A).
2. Para evitar la congelación mientras manipula la sonda durante el procedimiento, inserte el mango en la punta de una pipeta y envuélvalo con cinta adhesiva.
3. Prepare un vaso de precipitados para la solución de trabajo de anestesia, una cuchara para manipular los peces, una esponja húmeda y un tanque con agua del sistema para permitir que los peces se recuperen después del procedimiento.
4. Prepare la solución de trabajo fresca antes de cada experimento. Para preparar la solución de trabajo, agregue 4 ml de solución madre de tricocaína a 100 ml de agua del sistema en un vaso de precipitados.
   NOTA: La solución madre de anestesia consiste en 4 g de tricocaína disuelta en 980 ml de agua destilada. Después de ajustar el pH a 7 con 1 M Tris-HCl, pH 9, llene la solución a 1 L con agua destilada. La solución madre es sensible a la luz y debe almacenarse a 4 °C en un frasco de color ámbar.

2. Procedimiento de criolesión muscular

1. Comience el procedimiento sumergiendo la sonda en nitrógeno líquido durante un mínimo de 3 minutos. Moje la esponja en agua del sistema y colóquela sobre una superficie plana.
2. Transfiera un solo pez cebra adulto a la solución de trabajo de tricocaína y confirme su falta de respuesta tocando el pescado suavemente con la cuchara después de 1 minuto o 2 minutos. Si el pez sigue siendo reactivo, espere un poco más.
3. Coloque el pescado anestesiado sobre la esponja húmeda. Localiza el pedúnculo caudal posterior a la aleta anal y anterior a la aleta caudal.
4. Retire la criosonda del nitrógeno líquido. Agite la sonda suavemente para asegurarse de que no quede nitrógeno líquido residual en la punta.
5. Coloque el borde de la espátula perpendicularmente al cuerpo sobre el pedúnculo caudal (Figura 1C). Mantenga la sonda en esta posición durante 6 s sin aplicar presión (Figura 1D).
   NOTA: El peso de la criosonda es suficiente para asegurar el contacto entre el instrumento y el tejido.
6. Suelte la criosonda del tejido y transfiera los peces al tanque con agua del sistema.
7. Controle al pez mientras reanuda la respiración y la natación después de despertarse de la anestesia. Si los movimientos operculares no ocurren después de 30 s, estimule a los peces mediante el pipeteo de agua del sistema en las branquias hasta que el animal inicie la respiración por sí mismo.
   NOTA: Los peces deben reanudar la natación en pocos minutos en el tanque de recuperación.
   NOTA: En los días siguientes, los peces pueden ser filmados para monitorear su actividad de natación (Video 1 y Video 2). Antes de la grabación de video, transfiera el control y los peces heridos a un tanque de apareamiento translúcido, y déjelos habituar durante al menos 1 minuto.

3. Recolección y fijación del pedúnculo caudal

1. Prepare 2 ml de formalina al 4% u otro fijador que sea adecuado para los ensayos posteriores, una placa de Petri, fórceps y tijeras quirúrgicas.
2. Eutanasia de los peces en un momento seleccionado después de la criolesión de acuerdo con el permiso legal otorgado por la oficina veterinaria regional.
   NOTA: La eutanasia se realiza por una sobredosis de solución de tricaína (300 mg / L) durante aproximadamente 10 min. La pérdida del movimiento branquial y el reflejo de pellizco de la aleta caudal confirman la muerte. Los puntos de tiempo de la eutanasia deben seleccionarse de acuerdo con la fase de regeneración: por ejemplo, de 1 día después de la criolesión (dpci) a 3 dpci para la eliminación de la herida; de 3 dpci a 10 dpci para el inicio de la regeneración muscular; de 10 dpci a 30 dpci para la regeneración progresiva; y después de 30 dpci para la finalización de la restauración del tejido. Por lo tanto, para evaluar los diferentes pasos y procesos biológicos de la degeneración y regeneración muscular, los grupos de peces deben ser sacrificados en varios puntos de tiempo después de la criolesión.
3. Coloque el pescado sacrificado en una placa de Petri que contenga agua desionizada. Use tijeras para realizar un corte a través del cuerpo anterior y posterior al pedúnculo caudal (Figura 1E). Deje que el tejido se desangre en el agua desionizada de la placa de Petri.
4. Recoja el pedúnculo caudal y transfiéralo con fórceps a la solución fijadora preparada en un tubo de microcentrífuga.
   NOTA: Invierta cuidadosamente los tubos varias veces y manténgalos durante la noche a 4 °C.

4. Montaje del pedúnculo caudal

1. Lave el pañuelo fijo en 1x PBS durante 10 minutos en un balancín. Luego, transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 2 ml con sacarosa al 30% preenfriada en agua desionizada a 4 ° C, e invierta suavemente el tubo varias veces. Dejar los tubos de microcentrífuga durante un mínimo de 24 h a 4 °C en posición vertical.
   NOTA: El pedúnculo caudal flotará sobre la solución de sacarosa y comenzará a hundirse a medida que el tejido se deshidrata.
2. Llene un molde de incrustación con una capa de 5 mm de medio de montaje O.C.T. Use fórceps para ajustar el pedúnculo caudal en el medio. Colóquelo en la parte inferior del molde y ajuste su orientación para secciones transversales o coronales (Figura 1F).
3. Deje que el medio se congele en una caja de hielo seco. Tan pronto como el tejido se estabilice en la posición deseada, llene el resto del molde antes de que el O.C.T. se congele por completo. Guarde el molde durante un mínimo de 1 h a -80 °C.
   NOTA: En estas condiciones, los tejidos se pueden almacenar durante muchos meses.

5. Corte de las secciones con un criostato

1. Coloque un criostato con un espesor de corte de 25 μm. Ajuste la temperatura de la cámara a -26 °C, la temperatura de la muestra a -24 °C y el ángulo de corte a 12 °.
2. Coloque el bloque congelado con la muestra en el criostato y fije su orientación para cortar paralelo a la parte inferior del bloque. Corte hasta llegar a la muestra y luego recorte el bloque para facilitar la recolección de muestras.
3. Prepare seis diapositivas de adhesión. Etiquete las diapositivas con números consecutivos para preparar réplicas de la muestra.
4. Comience a cortar y recoja las secciones de tejido en los portaobjetos de adhesión etiquetados. Organice las secciones en las diapositivas según las demandas experimentales adicionales.
5. Deje secar los portaobjetos durante 1 h a temperatura ambiente. Guárdelos en cajas cerradas a -20 °C.
   NOTA: Los portaobjetos se pueden almacenar de forma segura en esta condición hasta por 1 año.

Monitoreo de los peces después de la criolesión
Para determinar el efecto de la criolesión de miomeros en animales, se realizó una grabación de video de peces control y criolesionados a 1 día después de la criolesión (dpci) y 5 dpci. Cada grupo contenía cinco peces. A 1 dpci, los peces criolesionados nadaban menos activamente, pero no mostraban ningún movimiento anormal, como remolinos, convolución o equilibrio reducido (Video 1). En el sistema de cría, su posición en el tanque y la ingesta de alimentos eran similares a las de los peces no heridos. El comportamiento normal persistió durante los días siguientes, como lo ejemplifica el video a 5 dpci (Video 2). En conclusión, el procedimiento de criolesión del pedúnculo caudal no afectó gravemente el bienestar de los animales.

Análisis histológico de las secciones del pedúnculo caudal
Para evaluar la extensión de la lesión, se seleccionó el punto de tiempo de 4 dpci, ya que es cuando los restos de miofibras se han reabsorbido completamente en la herida. Para analizar los efectos de la criolesión a lo largo de los ejes dorso-ventral y anterior-posterior del cuerpo, se utilizaron dos grupos de peces (es decir, secciones coronal y transversal del pedúnculo caudal, respectivamente) (Figura 1F).

Las secciones se analizaron mediante tinción tricrómica compuesta de Azul de Anilina, Fucsina Ácida y Naranja G (AFOG). Usando esta combinación de reactivos, los músculos intactos se mostraron en naranja, la médula espinal en rojo oscuro y la matriz de colágeno en azul. Para determinar el número de miómeros dañados, que son las unidades metaméricas de la musculatura de los peces, se analizaron una serie de secciones (Figura 2). Los límites de los miomeros, llamados miocomas, se identificaron por deposición de colágeno, detectada por la coloración azul. Las áreas dañadas fueron determinadas por la ausencia de manchas naranjas. Un examen más detallado de especímenes con miocommas evidentes reveló que aproximadamente cuatro miómeros consecutivos estaban dañados, como se infiere de la falta de tinción naranja (n, número de peces = 4; Figura 3A,A'). El lado ileso del mismo pez sirvió como referencia interna.

Para examinar la profundidad de la herida perpendicular al eje del cuerpo, se prepararon secciones transversales utilizando pez cebra a 4 dpci y 7 dpci. Este último punto de tiempo corresponde a la activación del programa miogénico y, por lo tanto, al inicio de la regeneración muscular. La tinción AFOG de estos especímenes mostró una extensa falta de tinción naranja en el flanco criolesionado del cuerpo, demarcando la zona del músculo esquelético degenerado (Figura 3B, C). A 4 dpci y 7 dpci, el área de la herida abarcaba los tejidos de la piel hacia el tabique vertical. Esto demuestra que el método de criolesión se dirigió profundamente a una mitad lateral del pedúnculo caudal, que permaneció desprovisto de músculo funcional durante 7 días después del procedimiento. Tomados en conjunto, cuatro miómeros fueron profundamente dañados en un lado del pedúnculo caudal.

Análisis de inmunofluorescencia de las secciones transversales
Para evaluar la dinámica de la regeneración muscular, grupos experimentales de peces fueron sacrificados a 4 dpci, 7 dpci, 10 dpci y 30 dpci. Las secciones transversales del pedúnculo caudal se marcaron mediante tinción de fluorescencia multicolor utilizando faloidina (que se une a la actina filamentosa [actina F]), anticuerpo tropomiosina-1, que detecta una proteína sarcómera, y DAPI, que etiqueta los núcleos. En todos los puntos de tiempo, la mitad ilesa del cuerpo proporcionaba un control interno; tanto la actina F como la tropomiosina 1 se detectaron fuertemente en las partes de control no lesionadas, lo que indica tejido no dañado (Figura 4).

A 4 dpci, el lado lesionado del pedúnculo caudal contenía abundantes células DAPI-positivas, pero se observó poca o ninguna inmunofluorescencia de F-actina y tropomiosina 1, lo que indica la zona de la herida con músculos degenerados (Figura 4A-B'). A 7 dpci, se pudo detectar tropomiosina 1 y F-actina en una parte de la herida cercana a la línea media vertical del cuerpo (Figura 4C-D'). Este patrón de expresión demarca la posición donde comienza la formación de nuevas miofibras en el pedúnculo caudal. A 10 dpci, ambos marcadores musculares se expandieron hacia la superficie del cuerpo, lo que sugiere una regeneración progresiva del músculo esquelético (Figura 4E-F'). A 30 dpci, ambos lados del cuerpo mostraron una distribución similar de tinción de actina F (Figura 4G-H'). Este hallazgo indica que el músculo esquelético se restauró eficientemente después de la criolesión del pedúnculo caudal.

Figura 1: Configuración experimental para criolesión de miomeros. (A) Dimensiones de la criosonda fabricada a medida de acero inoxidable. La parte distal del instrumento consiste en una espátula con un borde cóncavo a una profundidad de 1 mm para tener en cuenta la curvatura del cuerpo del pez cebra. La parte media de la herramienta comprende un cilindro que funciona como un peso y un depósito para mantener la baja temperatura de la espátula durante el procedimiento. El extremo proximal del instrumento tiene la forma de un mango de metal delgado. (B,C) Peces adultos anestesiados en una esponja húmeda con la criosonda en el pedúnculo caudal. La sonda estaba a temperatura ambiente. (B) El margen de la sonda se coloca horizontalmente en las proximidades del pedúnculo caudal para mostrar el tamaño relativo entre el pez y la herramienta. (C) Para la criolesión, la punta de la herramienta se coloca perpendicular al pez. (D) Ilustración esquemática del procedimiento de criolesión desde el lado ventral del pez para mostrar las manipulaciones de manera exhaustiva. La criosonda se enfrió previamente en nitrógeno líquido e inmediatamente se colocó en un lado del pescado durante 6 s. (E) En un momento específico después de la criolesión, los peces fueron sacrificados y sus pedúnculos caudales fueron recolectados para su fijación. (F) El material fijo fue procesado histológicamente y seccionado a lo largo de los planos coronal o transversal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Análisis histológico de los miómeros dañados en el pedúnculo caudal desde la posición dorsal hasta la ventral del cuerpo. Tinción AFOG de una serie de secciones coronales a los 4 días después de la criolesión (dpci). Las secciones son desde el lado dorsal hacia el ventral, como se indica en la parte superior del primer y último panel. Las secciones son no adyacentes, con un intervalo de aproximadamente 150 μm entre ellas. El músculo no lesionado se detecta por tinción naranja del músculo, mientras que el tejido lesionado carece de esta tinción y aparece grisáceo (área rodeada con una línea discontinua). Los tejidos que contienen colágeno, como la piel, se tiñen de azul. La médula espinal aparece como una estructura en forma de varilla y está teñida de rojo. Número de peces, n = 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Evaluación de la profundidad de la lesión en el pedúnculo caudal mediante tinción AFOG. (A,A') La sección coronal está al nivel de la médula espinal (una varilla horizontal teñida de rojo). La imagen inferior muestra un área ampliada abarcada con un marco en la imagen superior. Los límites secuenciales de los miomeros aparecen como rayas colágenas (azules) colocadas oblicuamente a la médula espinal (flechas rojas en la imagen ampliada A'). (B,C) Las secciones transversales muestran el flanco no lesionado con músculos teñidos de naranja y el flanco criolesionado con tinción grisácea. El área dañada está rodeada con una línea discontinua negra. El tabique vertical (representado con una línea discontinua roja) subdivide el cuerpo en los lados de control y criolesionados. Número de peces, n = 4 por punto de tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Detección inmunofluorescente de proteínas musculares después de criolesión. Tinción fluorescente de secciones transversales a 4 dpci, 7 dpci, 10 dpci y 30 dpci, tal como están etiquetadas en el lado izquierdo y en la parte superior de los paneles (A-B'). A 4 dpci, el tejido lesionado (rodeado con la línea discontinua) es DAPI-positivo (azul) pero desprovisto de tinción de faloidina (verde) o inmunorreactividad de tropomiosina-1 (rojo), lo que sugiere la degeneración de las fibras musculares después de la criolesión. (C-D') A 7 dpci, ambos marcadores musculares emergen progresivamente en el área herida, lo que indica el proceso regenerativo. La tropomiosina-1 parece más intensa que la actina F en las fibras recién formadas. (E-F') A 10 dpci, la zona de lesión se llena con nuevas miofibras que muestran una mayor intensidad de inmunorreactividad de tropomiosina-1 en comparación con la actina F. (G-H') A 30 dpci, se detecta un patrón similar de miofibras en ambos lados del cuerpo. Los marcos de los paneles A, C, E y H abarcan las áreas que se magnifican en las imágenes adyacentes a la derecha. Las escamas dérmicas, que emanan fluorescencia fuera del miómero, se borraron de las imágenes utilizando Adobe Photoshop. Número de peces, n = 4 por punto de tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.