Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Aquí, presentamos un protocolo para el desarrollo y validación de buenas prácticas de laboratorio en la detección compatible de vectores virales adenoasociados en lágrimas humanas por reacción en cadena de la polimerasa digital de gotitas en apoyo del desarrollo clínico de vectores de terapia génica.
El uso de vectores virales para tratar enfermedades genéticas ha aumentado sustancialmente en los últimos años, con más de 2.000 estudios registrados hasta la fecha. Los vectores virales adenoasociados (AAV) han tenido un éxito particular en el tratamiento de enfermedades relacionadas con los ojos, como lo ejemplifica la aprobación del voretigene neparvovec-rzyl. Para llevar nuevas terapias al mercado, las agencias reguladoras generalmente solicitan estudios de biodiseminación calificados o validados para evaluar la liberación del vector en el medio ambiente. Sin embargo, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos no ha publicado directrices oficiales para el desarrollo de ensayos moleculares para respaldar tales estudios de desprendimiento, lo que deja a los desarrolladores determinar las mejores prácticas por sí mismos. El propósito de este protocolo es presentar un protocolo validable para la detección de vectores AAV en lágrimas humanas por reacción en cadena de la polimerasa digital de gotitas (ddPCR) en apoyo de estudios clínicos de bioderramamiento. Este manuscrito analiza los enfoques actuales de la industria para la validación de ensayos moleculares y demuestra que el método excede los criterios de aceptación del ensayo objetivo actualmente propuestos en los libros blancos. Finalmente, se discuten los pasos críticos en el desempeño de cualquier ensayo de ddPCR, independientemente de la aplicación.
Las definiciones de terapia génica varían, pero generalmente inducen una alternancia permanente intencional y a menudo esperada de una secuencia específica de ADN del genoma celular para modificar o manipular la expresión de un gen o alterar las propiedades biológicas de una célula viva con un propósito clínico 1,2. Los vectores virales se utilizan cada vez más como vehículos para la terapia génica debido a su eficiencia de transducción, con un informe que sugiere que más del 70% de los ensayos clínicos actuales de terapia génica utilizan vectores virales3. El interés en los vectores virales para la terapia génica ha ido ganando constantemente. El Informe de datos trimestrales del cuarto trimestre de 2022 sobre el panorama de la terapia génica, celular y de ARN de la Sociedad Americana de Terapia Génica y Celular informó que en 2022, la línea de terapia de genes, células y ARN desde la preclínica hasta el registro previo creció un 7%, lo que elevó el número total de terapias en desarrollo a 3,726, de las cuales 2,053 (55%) fueron terapias génicas4. La Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (EE.UU. FDA) ha aprobado actualmente 27 terapias celulares y genéticas para uso clínico en humanos, cinco de las cuales utilizan específicamente vectores virales5.
Los virus adenoasociados (AAV) han ganado un interés específico como vehículos para la terapia génica. Un metaanálisis reciente reveló que ha habido aproximadamente 136 ensayos clínicos que investigan el uso de AAV en las últimas dos décadas6. Además, tres de las cinco terapias génicas aprobadas por la FDA de EE.UU. están basadas en AAV. Esto se debe a su naturaleza altamente editable, amplia gama de huéspedes que puede ajustarse en función del uso de vectores naturales específicos o artificialmente diseñados, baja patogenicidad y toxicidad en humanos y, en general, baja inmunogenicidad 7,8. Los AAV también se han utilizado con éxito para tratar enfermedades oculares en un entorno clínico aprobado. Voretigene neparvovec-rzyl es una terapia basada en AAV2 que fue aprobada por la FDA de EE.UU. en 2017 y por la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) en 2018 para tratar la distrofia retiniana asociada a la mutación bialélica RPE65 9.
Con el creciente interés en el desarrollo de terapias basadas en AAV viene la necesidad de orientación regulatoria sobre ensayos. La detección y cuantificación precisas de cualquier vector viral es una parte integral de las fases de descubrimiento, fabricación y pruebas preclínicas / clínicas del desarrollo del producto. La FDA de los Estados Unidos ha comenzado a emitir algunas directrices para las terapias génicas, incluidas las aplicaciones de nuevos fármacos en investigación de la química, la fabricación y el control de la terapia génica humana 10, el seguimiento a largo plazo después de la administración de la terapia génica11, las pruebas de retrovirus competentes en replicación 12 y las recomendaciones para los vectores microbianos utilizados en las terapias génicas 13. La EMA también ha publicado una serie de directrices sobre el desarrollo de productos de terapia génica que generalmente se alinean con las recomendaciones de la FDA, aunque existen algunas diferencias14. Es importante tener en cuenta que, si bien estas directrices no establecen responsabilidades legalmente exigibles, excepto cuando se hace referencia a regulaciones específicas, proporcionan claridad sobre el pensamiento actual de las agencias reguladoras sobre el tema y sus expectativas para los ensayos requeridos para la presentación de medicamentos y la aprobación regulatoria.
La FDA recomienda específicamente que se realicen estudios para evaluar la distribución, persistencia y eliminación de un vector desde el sitio de administración hasta los tejidos oculares y no oculares, los fluidos intraoculares y la sangre15. Estos toman la forma de estudios de biodistribución y desprendimiento. Los estudios de biodistribución evalúan la exposición investigando cómo se propaga un producto por todo el cuerpo de un paciente desde el sitio de administración. El derramamiento evalúa específicamente la liberación del producto del paciente al medio ambiente y plantea la posibilidad de transmisión del vector a individuos no tratados16. La FDA hace recomendaciones para el diseño de estudios de biodistribución y derramamiento con respecto a la frecuencia de recolección de muestras, la duración de la recolección de muestras, los tipos de muestras recolectadas y las condiciones de almacenamiento.
Además, la FDA recomienda el uso de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR o PCR en tiempo real) para la detección cuantitativa de genomas de vectores debido a su facilidad de rendimiento, formato de alto rendimiento, tiempos de respuesta rápidos y sensibilidad al ensayo. Sin embargo, hay una relativa falta de recomendaciones para el diseño y la evaluación del rendimiento de los métodos moleculares en comparación con los que existen para moléculas pequeñas y grandes. Muchas de las directrices para tales estudios son difíciles de aplicar a los métodos moleculares debido al diseño único y complejo tanto de los productos como de los propios ensayos, lo que plantea dudas sobre la idoneidad de las plataformas disponibles para las evaluaciones recomendadas y los métodos apropiados para la validación de ensayos. Hasta la fecha, la FDA no ha requerido la validación formal de los ensayos basados en PCR, aunque la EMA ha impuesto este requisito17. A la luz de este vacío, diferentes grupos y talleres han emitido libros blancos y recomendaciones que los fabricantes y las organizaciones de investigación por contrato han tratado de seguir 18,19,20,21,22,23,24,25. La mayoría de estas recomendaciones están escritas específicamente teniendo en cuenta los ensayos de qPCR, con sugerencias o alteraciones para plataformas emergentes, como la PCR digital de gotas (ddPCR), incluidas solo cuando se consideran relevantes. Las recomendaciones más recientes se han centrado en las consideraciones para los ensayos de ddPCR, pero se han centrado en gran medida en sus aplicaciones a la cuantificación del genoma vectorial en un entorno de fabricación en lugar de en las complejas matrices biológicas encontradas en los estudios de biodesprendimiento.
Dependiendo de la aplicación clínica y los objetivos, se puede preferir la ddPCR a la qPCR en apoyo de los estudios de biodistribución y eliminación debido a la mayor sensibilidad y capacidad de la ddPCR para manejar la interferencia de la matriz en comparación con la qPCR. Además, debido a la partición de muestras en aproximadamente 20.000 gotas, se puede lograr una cuantificación precisa del número de copias sin el uso de una curva estándar utilizando estadísticas de Poisson, simplificando el desarrollo y la validación del método. El objetivo de este protocolo es describir un enfoque estandarizado para el desarrollo y validación de un método basado en ddPCR para la detección de vectores AAV en lágrimas recogidas de la superficie ocular en apoyo de estudios clínicos de biodesprendimiento.
1. Preparación de un fragmento de ADN sintético
2. Preparación de cebadores y sonda
3. Preparación del tampón de dilución de la muestra
Tabla 1: Preparación del tampón de dilución de la muestra. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
4. Preparación de la mezcla maestra
Tabla 2: Ejemplo de preparación de la mezcla maestra de PCR. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Figura 1: Ejemplo de mapa de placas para la validación de la exactitud y la ejecución de precisión. Abreviaturas: ULQC = control de calidad del límite superior; HQC = control de alta calidad; MQC = control de calidad medio; LQC = control de baja calidad; LLQC = control de calidad de límite inferior; NTC = sin control de plantilla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Preparación de QCs
Tabla 3: Ejemplo de preparación de control de calidad (QC) utilizando fragmentos sintéticos de ADN bicatenario. Abreviaturas: ULQC = control de calidad del límite superior; HQC = control de alta calidad; MQC = control de calidad medio; LQC = control de baja calidad; LLQC = control de calidad de límite inferior; NTC = sin control de plantilla. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
6. Preparación de muestras
7. Adición de plantillas
8. Generación automatizada de gotas, ciclos térmicos y lectura de gotas
Tabla 4: Condiciones típicas de ciclos térmicos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
9. Análisis de datos
NOTA: Se necesita un mínimo de 10.000 gotas por pocillo para el cálculo adecuado de la concentración utilizando las estadísticas de Poisson. No intente analizar ningún pozo con menos de 10,000 gotas.
Figura 2: Ejemplo de establecimiento de umbral. Abreviaturas: ULQC = control de calidad del límite superior; HQC = control de alta calidad; MQC = control de calidad medio; LQC = control de baja calidad; LLQC = control de calidad de límite inferior; NTC = sin control de plantilla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
10. Criterios de aceptación del ensayo
Con fines demostrativos, se desarrolló un ensayo diseñado para detectar un vector AAV2 que expresa la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) disponible comercialmente, con un fragmento de ADN bicatenario sintético que contiene eGFP como control de calidad. Actualmente, existe un debate en curso sobre si el vector en sí mismo o un fragmento de ADN sintético o plásmido linealizado es el más apropiado para su uso como QC. Generalmente, se puede usar un fragmento de ADN sintético o un plásmido linealizado si se demuestra la equivalencia con el vector en el desarrollo del método (datos no mostrados). Se diseñaron y optimizaron cebadores y sondas para detectar el transgén eGFP. Consulte la Tabla Suplementaria S1 para las secuencias utilizadas en este trabajo. La concentración del stock de fragmentos de CC se determinó empíricamente mediante ddPCR. Todos los ensayos se realizaron utilizando las concentraciones y las condiciones de PCR dadas como ejemplos en la sección de protocolo.
Para los ensayos de qPCR, se recomienda evaluar la linealidad, sensibilidad, rango dinámico, exactitud y precisión de la curva estándar. Dado que la ddPCR no se basa en una curva estándar para la cuantificación del objetivo, estas recomendaciones deben modificarse. En cambio, se utilizaron QC que consisten en fragmentos sintéticos de ADN bicatenario diluidos a varias concentraciones para abarcar el rango cuantificable esperado de una reacción ddPCR basada en el modelo estadístico de Poisson 29,30,31,32 para definir el rango dinámico y la sensibilidad y para evaluar la exactitud y la precisión. La elección de las concentraciones de control de calidad se basó principalmente en la proporción esperada de gotas positivas a totales dentro de un pocillo a una concentración dada. Matemáticamente, la ddPCR es teóricamente más precisa cuando aproximadamente el 80% de las particiones se amplifican positivamente. A medida que la relación de gotas positivas a totales aumenta por encima de 0,8, la precisión disminuye debido a la saturación de las particiones, y la cuantificación no es posible una vez que el 100% de las gotas son positivas. En el extremo inferior, teóricamente, se puede detectar y cuantificar tan solo una gota positiva, aunque la precisión es menor y el ensayo está sujeto a falsos positivos de bajo nivel. Por lo general, al menos tres gotitas deben ser positivas para que un resultado se calcule con un 95% de confianza, que es el umbral para calcular una concentración que usamos aquí.
Se preparó una serie de cinco concentraciones de CC diferentes, y se espera que el número de copias objetivo/μL de volúmenes de reacción de PCR calculados produzca relaciones positivas a gotas totales que abarcan el rango cuantificable de ddPCR, como se muestra en la Tabla 5. Estos se utilizaron para evaluar la exactitud y precisión del ensayo. En la evaluación aquí, los límites superior e inferior de cuantificación no se llevaron al máximo teórico posible en ddPCR. La cuantificación precisa puede ser posible a niveles más altos y más bajos que los demostrados aquí. La gama debe desarrollarse en consonancia con las aplicaciones posteriores de este método.
Se prepararon un total de tres series de dilución preparadas independientemente de estos CC en tampón de dilución de muestra para cada lote para evaluar la exactitud y precisión intraensayo. Se incluyeron pocillos duplicados de cada dilución de control de calidad. Para simular un protocolo de validación real, varios analistas realizaron un total de seis lotes de exactitud y precisión durante varios días. Los resultados de estos seis lotes se analizaron para definir la exactitud intraensayo e interensayo y la precisión del método y para definir el rango dinámico del ensayo.
El rendimiento intraensayo se evaluó para cada lote en cada nivel de control de calidad. Esperábamos que todos los pozos de control de calidad y NTC tuvieran al menos 10.000 gotas. Esto se cumplió en 216 de los 216 pozos probados en los seis lotes, con un recuento promedio de gotas de 19,748 gotas / pocillo (Tabla 6). A continuación, se esperaba que el %CV entre pozos de cada conjunto de pozos duplicados de cada QC fuera de ≤25,0%, excepto para el límite superior e inferior de QC, donde se esperaba un ≤30,0%. Esto se cumplió en conjuntos de 90 de los 90 pozos probados en los seis lotes para los QC, con un promedio de %CV entre pozos de 3.9% en todos los niveles de QC (Tabla 7). Todos los QC produjeron relaciones medias positivas a gotas totales dentro de los rangos esperados descritos anteriormente (Tabla 6).
Dentro de cada lote, se calcularon la media intraensayo y la desviación estándar para cada uno de los puntos de la serie de dilución preparados de forma independiente, y se utilizaron para calcular una media intraensayo para cada concentración en cada ensayo. Esto se utilizó para evaluar la exactitud y precisión del ensayo (Tabla 8). La precisión se refiere a la variabilidad en los datos de las réplicas de la misma muestra homogénea en condiciones normales de ensayo y se evalúa calculando el %CV de las múltiples alícuotas incluidas. Se esperaba que las tres alícuotas probadas dentro de cada lote produjeran un %CV intraensayo ≤25,0%, excepto para el límite superior e inferior de CC, donde se esperaba un ≤30,0%. Esto se cumplió para los cinco niveles de control de calidad en cada uno de los 60 lotes (30 de 30 actuaciones totales). En general, se pudo lograr una mayor precisión intraensayo que los criterios objetivo, con un %CV intraensayo medio del 7,7% en todos los niveles de control de calidad. La precisión se refiere a la cercanía de acuerdo entre el valor determinado experimentalmente y el valor nominal. Esto se evalúa calculando el porcentaje de error relativo (%RE o %Bias) entre las concentraciones calculadas de cada QC y sus concentraciones nominales teóricamente esperadas. Se esperaba que la media intraensayo de las tres alícuotas fuera de ±25,0% RE de la concentración nominal, excepto para el límite superior e inferior de CC, donde se esperaba un ±30,0%. Esto se cumplió para los cinco niveles de control de calidad en cada uno de los 60 lotes (30 de 30 actuaciones totales). En general, se pudo lograr una mayor precisión intraensayo que nuestro objetivo, con un % de ER intraensayo absoluto medio del 4,2% en todos los niveles de control de calidad. En todas las actuaciones del NTC (30 en total), no se detectaron gotitas positivas.
La exactitud y la precisión entre ensayos también se calcularon utilizando la media intraensayo de cada nivel de control de calidad dentro de cada lote. Se esperaba que la precisión entre ensayos fuera de ≤25,0% CV, excepto para el límite superior e inferior de control de calidad, donde se esperaba ≤30,0%. Asimismo, para la precisión entre ensayos, se esperaba una RE de ±25,0%, excepto para el límite superior e inferior de CC donde se esperaba ±30,0%. Se observó una exactitud y precisión entre ensayos significativamente mayor que estos objetivos (Tabla 9), con una precisión entre ensayos que varió de 4,0% a 8,5% y una exactitud absoluta entre ensayos que varió de 1,0% a 3,2%. En conjunto, estos resultados demuestran que este método puede lograr suficiente exactitud y precisión dentro y entre ensayos dentro de los objetivos actuales de la industria. Se puede definir un rango dinámico de este ensayo de 2.500-2,5 copias por μL de reacción de PCR en función de estos resultados, con una sensibilidad general del ensayo de 2,5 copias por μL de reacción de PCR. Como se mencionó anteriormente, puede ser posible validar rangos dinámicos más amplios.
A continuación, fue necesario evaluar la exactitud y la precisión del ensayo dentro de la matriz objetivo, en este caso, las lágrimas. Por lo general, los ensayos se validan antes del inicio de los estudios clínicos, lo que significa que es poco probable que las lágrimas recogidas de pacientes tratados con vectores estén disponibles para fines de validación. Esto se puede crear artificialmente clavando el vector AAV objetivo en lágrimas recolectadas de donantes voluntarios para crear QC con púas de matriz. Las lágrimas humanas agrupadas fueron recolectadas por un tercero (BioIVT). Como prueba de principio, se utilizó un vector AAV2 que expresa eGFP adquirido de una fuente comercial. La concentración del stock vectorial AAV2 se determinó empíricamente mediante ddPCR, sin el uso de un paso de aislamiento de ADN, como se describe en este protocolo. En cada ejecución, el AAV2 se introdujo de forma independiente en las tres alícuotas lagrimales a un nivel alto (reacción esperada de PCR de 1,41 x 103 copias/μL) y bajo (reacción de PCR de 28,2 copias/μL). Se incluyeron alícuotas sin púas como control para demostrar la especificidad del método.
El rendimiento intraensayo se evaluó para cada lote en cada nivel de pico. Se esperaba que todas las muestras de lágrimas tuvieran al menos 10.000 gotas. Esto se cumplió en 108 de los 108 pozos probados en los seis lotes, con un número total medio de gotas de 20.208 gotas / pocillo (Tabla 10). A continuación, se esperaba que el %CV entre pozos de cada conjunto de pozos duplicados de cada QC fuera de ≤25.0% para los niveles de pico alto y bajo. Esto se cumplió en 36 de los 36 conjuntos de pozos probados en los seis lotes para los QC, con un promedio de %CV entre pozos de 3.2% (Tabla 11).
Dentro de cada lote, se calcularon la media intraensayo y la desviación estándar para cada uno de los picos lagrimales preparados de forma independiente, y se utilizaron para calcular una media intraensayo para cada concentración en cada ensayo. Esto se utilizó para evaluar la exactitud y precisión del ensayo en matriz (Tabla 12). Se esperaba que el %CV intraensayo fuera del ≤25,0% y niveles de pico altos y bajos. Esto se cumplió en seis de los seis lotes para cada nivel. En general, se pudo lograr una mayor precisión intraensayo en matriz que el objetivo, con un %CV intraensayo medio del 3,7% en el nivel alto y del 12,2% en el nivel bajo (8,0% global). También se esperaba que el %ER intraensayo fuera del ±25,0% en ambos niveles de pico. Esto se cumplió en seis de los seis lotes para cada nivel. Del mismo modo, se encontró en general que se podía lograr una mayor precisión intraensayo en la matriz que el objetivo, con un %ER absoluto medio intraensayo del 8,1% en el nivel bajo y del 11,3% en el nivel alto (9,7% global). Para el control sin picos, no se detectó ninguna señal de eGFP en ninguna de las alícuotas (Tabla 12), lo que demuestra la especificidad del método en la matriz lagrimal humana.
La exactitud entre ensayos y la precisión en la matriz lagrimal también se calcularon utilizando la media intraensayo de cada nivel de pico dentro de cada lote. Se esperaba que la precisión entre ensayos fuera ≤25,0% CV, y para la exactitud entre ensayos, se esperaba ±25,0% RE. Se observó una exactitud y precisión entre ensayos significativamente mayor que estos objetivos (Tabla 13), con una precisión entre ensayos del 5,5% en el nivel alto y del 7,1% en el nivel bajo, y con una exactitud absoluta entre ensayos del 11,3% en el nivel alto y del 8,1% en el nivel bajo. En conjunto, estos resultados demuestran la exactitud, precisión y especificidad del método en la matriz de lágrimas.
Tabla 5: Controles de calidad utilizados para definir el rango dinámico del ensayo. Abreviaturas: ULQC = control de calidad del límite superior; HQC = control de alta calidad; MQC = control de calidad medio; LQC = control de baja calidad; LLQC = control de calidad de límite inferior; NTC = sin control de plantilla. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 6: Recuentos totales de gotitas y proporciones positivas a totales de gotas de control de calidad de ADN bicatenario sintético y NTC. Abreviaturas: ULQC = control de calidad del límite superior; HQC = control de alta calidad; MQC = control de calidad medio; LQC = control de baja calidad; LLQC = control de calidad de límite inferior; NTC = sin control de plantilla. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 7: Estadísticas de QC entre pozos (objetivos de copia/reacción de PCR μL). Abreviaturas: ULQC = control de calidad del límite superior; HQC = control de alta calidad; MQC = control de calidad medio; LQC = control de baja calidad; LLQC = control de calidad de límite inferior; NTC = sin control de plantilla. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 8: Exactitud intraensayo y precisión de los QC (objetivos de copia/reacción de PCR de μL). Abreviaturas: ULQC = control de calidad del límite superior; HQC = control de alta calidad; MQC = control de calidad medio; LQC = control de baja calidad; LLQC = control de calidad de límite inferior; NTC = sin control de plantilla. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 9: Exactitud entre ensayos y precisión de los QC (objetivos de copia/reacción de PCR de μL). Abreviaturas: ULQC = control de calidad del límite superior; HQC = control de alta calidad; MQC = control de calidad medio; LQC = control de baja calidad; LLQC = control de calidad de límite inferior; NTC = sin control de plantilla. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 10: Recuentos totales de gotitas de muestras de lágrimas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 11: Estadísticas de la muestra de lágrimas entre pocillos (objetivos de copia/reacción de PCR μL). Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 12: Exactitud intraensayo y precisión de muestras de lágrimas (objetivos de copia/reacción de PCR μL). Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 13: Exactitud entre ensayos y precisión de muestras de lágrimas (objetivos de copia/reacción de PCR μL). Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla suplementaria S1: Secuencias de cebadores, sondas y control de calidad de ADN bicatenario sintético utilizados en este estudio. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Todos los autores son empleados de KCAS Bioanalytical and Biomarker Services, una organización de investigación por contrato que proporciona servicios integrales de desarrollo que cumplen con las Buenas Prácticas de Laboratorio / Buenas Prácticas Clínicas desde el soporte de descubrimiento temprano hasta el registro del producto, incluido el soporte de ensayos basados en AAV, como se describe en este protocolo. KCAS financió este proyecto y la publicación de este protocolo. Si bien no existen pautas actuales de la FDA para el diseño y la validación de los experimentos presentados en este documento, los expertos y líderes de opinión que desarrollan dichos estudios en KCAS han adoptado este enfoque como el enfoque de referencia. Los criterios y parámetros adicionales se discuten proyecto por proyecto y pueden incluirse en función del uso previsto.
Aquí, presentamos un protocolo para el desarrollo y validación de buenas prácticas de laboratorio en la detección compatible de vectores virales adenoasociados en lágrimas humanas por reacción en cadena de la polimerasa digital de gotitas en apoyo del desarrollo clínico de vectores de terapia génica.
Nos gustaría agradecer a Nick Russell y Brandon McKethan de Bio-Rad por sus útiles discusiones durante el desarrollo de este método.
| Vector AAV-eGFP | Charles River Laboratories | RS-AAV2-FL | Lote AAV2-0720-FL, utilizado como vector de prueba de principio |
| AutoDG Sistema de PCR digital de gotas | Bio-Rad | QX200 | El sistema alternativo de ddPCR se puede utilizar según el fabricante. S protocolo. |
| Aceite AutoDG para sondas | Bio-Rad | 1864110 | O utilice material compatible con el sistema ddPCR. |
| Control de tampón ddPCR para sondas | Bio-Rad | 1863052 | O utilice material compatible con el sistema ddPCR y la química de PCR. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 1863004 | O utilice material compatible con el sistema ddPCR. |
| Sellos de lámina perforable ddPCR | Bio-Rad | 1814040 | O utilice material compatible con el sistema ddPCR. |
| Placas ddPCR de 96 pocillos, semifaldón | Bio-Rad | 12001925 | O utilice material compatible con el sistema ddPCR. |
| ddPCR Supermix para sondas (sin dUTP) | Bio-Rad | 1863023, 1863024 o 1863025 | Utilice una mezcla maestra compatible con cebadores/sondas y el sistema ddPCR. |
| DG32 AutoDG Cartidges | Bio-Rad | 1864108 | O utilice material compatible con el sistema ddPCR. |
| Lector de gotas | Bio-Rad | QX200 | El sistema alternativo de ddPCR se puede utilizar según las instrucciones del fabricante S protocolo. |
| Tampón GeneAmp PCR | Applied Biosystems | N8080129 | N/A |
| Agua libre de nucleasas | Ambion | AM9906 | N/A |
| Sellador de placas | PCR Bio-Rad | PX1 | O utilice material compatible con el sistema ddPCR. |
| Puntas de pipeta para AutoDG | Bio-Rad | 1864120 | O utilice material compatible con el sistema ddPCR. |
| Pluronic F-68 Surfactante no iónico | Gibco | 24040 | N/A |
| Sondas de cebador e hidrólisis | Varios | Varios Diseño basado en la secuencia objetivo utilizando enfoques generales para el diseño de cebadores / sondas. Seleccione fluorforos y extintores compatibles con el sistema ddPCR. | |
| Enzima de restricción | Varios | Varios Varía | con la secuencia de amplificación del objetivo. Utilice una enzima de restricción que no corte en la secuencia amplificada |
| ADN de esperma de salmón cortado | ThermoFisher | AM9680 | N/A |
| Fragmento de gen de ADN sintético o plásmido linealizado | Varios | Varios Diseñe | un fragmento de ADN sintético que contenga la región de amplificación objetivo para su uso como tampón de control de calidad |
| TE | Teknova | T0224 | Asegúrese de que se prepare o compre libre de nucleasas. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH = 8.0 |
| Termociclador | táctilBio-Rad | C1000 | O utilice material compatible con el sistema ddPCR. |
