Prueba de compresión uniaxial de vértebras lumbares de ratón con incrustación de la superficie de carga

Resumen

En este protocolo, se describen dos enfoques para hacer más asequible la prueba de compresión uniaxial de las vértebras lumbares de ratón. En primer lugar, se describe la conversión de una máquina dobladora de tres puntos en una máquina de ensayo de compresión. En segundo lugar, se adapta un método de incrustación para preparar la superficie de carga que utiliza cemento óseo para las vértebras lumbares de ratón.

Resumen

Cada vez hay más conciencia de que el hueso cortical y el hueso esponjoso difieren en la regulación y respuesta a las terapias farmacéuticas, las terapias hormonales y otros tratamientos para la pérdida ósea relacionada con la edad. La flexión de tres puntos es un método común utilizado para evaluar la influencia de un tratamiento en la región de diáfisis media de los huesos largos, que es rica en hueso cortical. Las pruebas de compresión uniaxial de vértebras de ratón, aunque son capaces de evaluar huesos ricos en hueso esponjoso, se realizan con menos frecuencia debido a desafíos técnicos. Aún menos común es el emparejamiento de pruebas de flexión y compresión de tres puntos para determinar cómo un tratamiento puede influir en la región de diáfisis media de un hueso largo y un centro vertebral de manera similar o diferente. Aquí, describimos dos procedimientos para hacer que la prueba de compresión de las vértebras lumbares del ratón sea un método menos difícil de realizar en paralelo con la flexión de tres puntos: primero, un procedimiento para convertir una máquina de flexión de tres puntos en una máquina de prueba de compresión, y segundo, un método de inclusión para preparar una superficie de carga de vértebras lumbares del ratón.

Introducción

Los cambios óseos relacionados con la edad son ampliamente reconocidos como problemáticos debido al mayor riesgo de fracturas óseas asociadas con estos cambios. Las fracturas óseas en humanos pueden provocar dolor crónico, movilidad reducida, discapacidad a largo plazo, un mayor riesgo de muerte y cargas^económicas. Las terapias comunes investigadas para abordar los síntomas de los cambios óseos relacionados con la edad incluyen suplementos dietéticos, tratamientos hormonales y medicamentos 2,3,4,5,6,7,8,9. Las investigaciones iniciales de estos tratamientos para sujetos humanos se realizan comúnmente utilizando modelos de animales pequeños (por ejemplo, ratas y ratones de laboratorio), que poseen los dos tipos principales de huesos que se encuentran en el esqueleto^humano. Los huesos largos apendiculares, como el húmero, el fémur y la tibia, son ricos en hueso cortical (es decir, compacto), mientras que las vértebras son ricas en hueso esponjoso (es decir, hueso tejido, esponjoso o trabecular)⁴. Cada vez se sabe más que los mecanismos de regulación ósea y las vías de señalización difieren entre el hueso cortical (p. ej., hueso largo, diáfisis media) y el hueso esponjoso (p. ej., centro vertebral)². Debido a esto, las terapias pueden tener efectos diferenciales que son específicos del hueso o incluso específicos del sitio dentro del mismo hueso ^2,3,4.

La aplicación de fuerza a un objeto (por ejemplo, un hueso) hace que el objeto sufra aceleración, deformación o ambas, dependiendo de las condiciones de contorno del objeto. Cuando el hueso está constreñido, una fuerza opuesta de igual magnitud resiste la aceleración del hueso y se produce una deformación. A medida que el hueso sufre deformación, se genera una resistencia interna llamada tensión, de la cual existen dos tipos básicos: Fuerza normal, en forma de tensión o compresión, y fuerza cortante¹⁰. A menudo, se genera una combinación de los tipos básicos de tensión, dependiendo del sistema de fuerza aplicado¹⁰. La resistencia de un material es su capacidad para soportar la tensión sin fallar. A medida que se aplican fuerzas cada vez mayores a un material, eventualmente sufre una deformación permanente, momento en el que se dice que ha pasado de un estado elástico (es decir, volverá a su forma original si se elimina la fuerza) a un estado plástico (es decir, no volverá a su forma original si se elimina la fuerza)¹¹. El punto en el que se produce la transición de un estado elástico a un estado plástico se denomina punto de fluencia. A medida que se aplican fuerzas aún mayores al material más allá del límite elástico, sufre cada vez más microfracturas (es decir, daños) hasta que se produce la fractura total; En este punto, se dice que el material ha fallado^11,12. La fractura de un hueso representa un fallo tanto a nivel estructural como tisular¹⁰. Por ejemplo, la rotura de un hueso vertebral se produce porque no solo fallan múltiples trabéculas a nivel estructural, sino que también hay una falla de elementos de la matriz extracelular como los cristales de colágeno e hidroxiapatita en una trabécula individual a nivel tisular.

Los eventos mecánicos que conducen a la falla de un material se pueden medir utilizando una variedad de métodos de prueba. La flexión de tres puntos es un método común para probar las propiedades mecánicas de los huesos largos del esqueleto apendicular. Este método es simple y reproducible, lo que lo convierte en el método preferido de pruebas biomecánicas para muchos investigadores¹³. Al bajar una viga de cruceta sobre la diáfisis media de un hueso largo que descansa sobre dos vigas de soporte inferiores, este método prueba específicamente las propiedades mecánicas de la región de la diáfisis media, que es un hueso cortical densamente organizado. A partir de curvas de carga-desplazamiento, se pueden determinar los efectos de la fuerza de tracción sobre la elasticidad, la tenacidad, la fuerza a la falla y la transición del comportamiento elástico al plástico de los materiales óseos, entre otras propiedades.

En el segundo tipo de hueso, denominado hueso trabecular, esponjoso, tejido o esponjoso, los elementos óseos se forman en una serie de varillas y vigas llamadas trabéculas, lo que da una apariencia "esponjosa". Los cuerpos vertebrales principales (es decir, el centro) son ricos en hueso esponjoso y a menudo son los sitios de fracturas óseas por compresión relacionadas con la edad en humanos¹⁴. Las vértebras lumbares (es decir, la parte baja de la espalda) son las vértebras más grandes, soportan la mayor parte del peso del cuerpo y son el sitio más común para las fracturas vertebrales^15,16. La mejor manera de evaluar directamente las propiedades mecánicas de los cuerpos vertebrales es utilizando métodos de ensayo de compresión uniaxial, ya que la compresión axial es la carga de fuerza normal impuesta a las columnas vertebrales in vivo¹⁷. La compresión de los cuerpos vertebrales in vivo ocurre como resultado de las contracciones musculares y ligamentosas, la fuerza de la gravedad y las fuerzas de reacción del suelo¹⁸.

Las pruebas de compresión ex vivo de vértebras de animales pequeños pueden ser difíciles debido a su pequeño tamaño, forma irregular y fragilidad. La forma de los cuerpos vertebrales puede estimarse como un paralelogramo con leve inclinación ventral y ligera concavidad craneal¹⁷. Esta forma presenta desafíos para lograr pruebas de compresión uniaxial ex vivo porque, sin una preparación adecuada de la superficie de carga, las fuerzas de compresión se aplicarán solo a una parte de la superficie de carga, lo que dará como resultado un "contacto local"^17,19. Esto puede causar resultados inconsistentes y fallas prematuras¹⁹. Este no es el caso in vivo porque la superficie de carga está rodeada por discos intervertebrales en las articulaciones vertebrales, lo que permite que la carga se distribuya por toda la placa terminal craneal. El complejo disco intervertebral-placa terminal craneal juega un papel importante en la aplicación de fuerza en todo el cuerpo vertebral y en la biomecánica de la fractura en el cuerpo vertebral^14,20. Si bien las pruebas de compresión no son nuevas en el campo de la biología, existen limitaciones en los métodos actuales de pruebas mecánicas de huesos. Estas limitaciones incluyen la falta de modelos predictores y simulaciones para la mecánica ósea, la arquitectura espacial geométrica única e incluso las variaciones biológicas inherentes basadas en muestras²¹. Más importante aún, el campo se ve desafiado por la falta de estandarización entre los métodos y la falta general de métodos reportados en la literatura²².

Existen dos métodos reportados en la literatura para la preparación de vértebras lumbares de roedores para lograr la prueba de compresión uniaxial: el método de corte y el método de inclusión 17,19,23,24,25,26. El método de corte requiere que las apófisis vertebrales, la placa terminal craneal y la placa terminal caudal se corten del cuerpo vertebral. Pendleton et ^al.19 han descrito previamente un método detallado para el uso de este método en vértebras lumbares de ratón. Este método presenta los desafíos de lograr cortes perfectamente paralelos en las placas terminales caudal y craneal y, al mismo tiempo, evitar cualquier daño a la muestra. También tiene la limitación de que se retira la placa final craneal. La placa terminal craneal contiene una densa capa de hueso cortical y desempeña un papel importante en la distribución de las cargas de los discos intervertebrales in vivo y está involucrada en la falla del hueso para fracturas in vivo 17,20,27. Por el contrario, el método de inclusión consiste en extirpar las apófisis vertebrales manteniendo intacta la placa terminal craneal del cuerpo vertebral. A continuación, la superficie de carga se hace aproximadamente horizontal colocando una pequeña cantidad de cemento óseo en el extremo craneal del cuerpo vertebral. Este método tiene la ventaja de que supera los desafíos técnicos asociados con el método de corte y puede imitar mejor el mecanismo de aplicación de carga y falla ósea in vivo debido a la preservación de la placa terminal craneal. Este enfoque se ha documentado previamente en estudios que involucran pruebas de compresión uniaxial en huesos de rata. Sin embargo, hasta donde sabemos, no se ha documentado previamente en el contexto de vértebras lumbares de ratón más pequeñas 17,25,26. El método en cuestión fue previamente detallado por Chachra et ^al.25 y originalmente utilizó una muestra ósea sostenida entre dos placas, cada una con una cavidad cilíndrica, que luego se rellenó con polimetilmetacrilato (PMMA). Posteriormente, el mismo grupo de investigación mejoró el método en el que un extremo se lija suavemente (caudal) y al otro extremo se le agrega una pequeña mancha de cemento óseo (craneal)²⁶. Este método es una mejora con respecto al método anterior porque minimiza el material entre las platinas y es el enfoque de este artículo. A pesar de los desafíos asociados con las pruebas de compresión vertebral uniaxial, es un método que puede proporcionar información valiosa sobre los efectos de una terapia propuesta en el hueso, especialmente cuando se combina con la flexión de tres puntos.

Aquí, se presenta el uso de una máquina convertible de prueba de flexión / compresión de tres puntos para permitir una fácil prueba tanto de huesos largos como de cuerpos vertebrales utilizando una sola máquina. Además, se presenta el uso de un método de inclusión para lograr pruebas de compresión uniaxial de vértebras lumbares de ratón. El presente estudio se realizó como parte de un estudio más amplio que tuvo como objetivo investigar las influencias de la suplementación con semillas de cáñamo en la dieta sobre las propiedades del hueso esquelético en ratones hembra C57BL/6 jóvenes y en crecimiento ^5,6. El probador de flexión de tres puntos fue construido originalmente por profesores y estudiantes del Departamento de Ingeniería de la Universidad Estatal de Colorado-Pueblo y utilizado por nuestro grupo de investigación en pruebas de flexión de tres puntos en huesos largos [fémur y tibia de rata⁷ y húmero, fémur y tibia de ratón ^5,6,8,9]. Sin embargo, no se exploró su modificación y aplicación para su uso en pruebas de compresión del cuerpo vertebral en ratones. El diseño y la construcción de la máquina dobladora de tres puntos han sido descritos anteriormente⁷. Este informe se centrará en los métodos utilizados para modificar la máquina para las pruebas de compresión y para corregir el desplazamiento del sistema. En segundo lugar, se describe el método de inclusión para la preparación de la superficie de carga del cuerpo vertebral del ratón, junto con los métodos para los ensayos de compresión uniaxial y el análisis de los datos de carga-desplazamiento.

Protocolo

Todos los experimentos y protocolos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y recibieron la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Colorado-Pueblo (Número de Protocolo: 000-000A-021). Los procedimientos detallados para el cuidado de los animales han sido descritos previamente ^5,6. Los ratones se obtuvieron a las tres semanas de edad como parte de un estudio más amplio destinado a investigar los efectos de una dieta suplementada con semillas de cáñamo en ratones hembra C57BL/6 jóvenes y en crecimiento (ver Tabla de materiales). De las 5 a las 29 semanas de edad, los ratones se criaron con una de tres dietas: control (0% de semillas de cáñamo), 50 g/kg (5%) de semillas de cáñamo o 150 g/kg (15%) de semillas de cáñamo, con ocho ratones por grupo ^5,6. A lo largo del estudio, los ratones tuvieron acceso ad libitum a sus respectivas dietas y agua, se alojaron en parejas en jaulas de policarbonato y se mantuvieron en un ciclo de luz de 12 h: 12 h de oscuridad (con luces encendidas de 06:00 a 18:00 h). El peso y la salud de los ratones se evaluaron semanalmente, y todos los ratones completaron con éxito el estudio sin desarrollar ninguna condición de salud adversa. A las veintinueve semanas de edad, los ratones fueron anestesiados profundamente con gas isoflurano y sacrificados a través de la luxación cervical ^5,6. Se realizó una incisión en la línea media de la superficie ventral desde el esternón hasta la cola, y se extrajeron todos los órganos intratorácicos, peritoneales y retroperitoneales de las canales. Los cadáveres eviscerados se conservaron en una solución de cloruro de sodio al 0,9% a -70 °C hasta el momento de la disección ósea para la prueba de vértebras, que ocurrió aproximadamente un año después.

1. Conversión de una máquina dobladora de tres puntos en una máquina de prueba de compresión

1. Desatornille la viga de cruceta conectada al sensor de carga en la máquina dobladora de tres puntos⁷ (consulte la Tabla de materiales) (Figura 1A, B).
2. Atornille una platina superior autoalineable en el sensor de carga (consulte la Tabla de materiales) con rosca idéntica a la viga de cruceta (Figura 1C).
3. Taladre dos agujeros horizontales en cada uno de los soportes inferiores, donde la platina inferior se fijará más tarde (Figura 1D).
4. Golpee las roscas en los dos lados de una platina inferior de acero inoxidable para alinearlas con los orificios perforados en los soportes inferiores (Figura 1E).
5. Asegure la platina inferior a los dos soportes inferiores con tornillos hexagonales roscados y apriete hasta que esté segura (Figura 1F).
   NOTA: Los tornillos hexagonales deben tener roscas que coincidan con los orificios roscados en los soportes inferiores y las placas superior e inferior. El uso de una platina superior autoalineable puede ayudar a lograr un contacto uniforme entre la platina superior y la superficie de carga, pero no es suficiente dada la concavidad del extremo craneal de los cuerpos vertebrales. Se requiere una preparación adicional utilizando un método de preparación de la superficie de carga. Al construir una máquina de prueba de compresión para huesos de animales pequeños, que son más pequeños y débiles que muchos materiales industriales / de ingeniería, es esencial considerar la capacidad de carga del sensor de carga y el tamaño del marco de carga. Además, las máquinas deben limpiarse y lubricarse regularmente para garantizar resultados precisos y un funcionamiento sin problemas.

2. Corrección del desplazamiento de la máquina de prueba de compresión

1. Sin material de prueba entre la platina superior y la platina inferior, baje la platina superior sobre la platina inferior hasta que se haya hecho contacto con la luz (~0,3-0,5 N de fuerza de precarga).
2. Encienda la máquina a una velocidad de descenso constante (~1 mm/min) para comenzar la prueba de compresión. Recopile mediciones de carga (N) y desplazamiento (mm) utilizando un software de recopilación de datos digitales (consulte la Tabla de materiales) para la recopilación de datos de las pruebas mecánicas.
   NOTA: Dado que no hay material entre la placa superior e inferior, todo el desplazamiento observado se deberá únicamente al desplazamiento de la máquina (_máquina Δx) (bastidor, célula de carga, placas, acoplamientos, etc.).
3. Continúe bajando la platina superior sobre la platina inferior a una velocidad constante (es decir, monótona) hasta que se alcancen fuerzas superiores a las que se obtendrán de todas las muestras óseas.
4. Repita los pasos 2.1 a 2.3 un total de tres veces.
5. Grafique los datos para el desplazamiento del sistema (_máquina Δx, mm) frente a carga aplicada (Fuerza, N).
6. Ajuste una línea de regresión de mejor ajuste a los datos (Figura 2A-D).
7. En una hoja de cálculo con los datos de una prueba de compresión ósea, utilice la ecuación proporcionada por el análisis de regresión para determinar la cantidad de desplazamiento de la máquina (_máquina Δx) que influye en el desplazamiento registrado (Δx_{total registrado}) para un punto de datos de una prueba de compresión de vértebras lumbares de ratón.
   NOTA: Por ejemplo, considere un punto de datos en el que se aplican 18 N de fuerza y se han registrado 2.730 mm de desplazamiento (Δx_{total registrado}). De acuerdo con la ecuación de regresión polinómica de tercer orden de ejemplo (Figura 2D) [_Máquina Δx = (4 × 10-7 x Carga Aplicada³) - (8 × ^10-5 x Carga Aplicada²) + (0.0044 x Carga Aplicada)], 0.056 mm del desplazamiento registrado se debe al desplazamiento de la máquina (_máquina Δx).
   Δx_{total registrado =} Δx_máquina + Δx_muestra
8. Corrija el desplazamiento registrado para el punto de datos.
   NOTA: Por ejemplo, considere el ejemplo anterior. Si se registran 2.730 mm de desplazamiento (Δx_{total registrado}) y el desplazamiento de la máquina ₍Δx_máquina) representa 0.056 mm del total, entonces el desplazamiento que experimentó el espécimen (es decir, el hueso) de interés (_espécimen Δx) es de 2.664 mm. Por lo tanto, 2.664 mm es el desplazamiento real que experimentó la vértebra (_espécimen Δx) y es el valor que se utilizará para el análisis de la curva de carga-desplazamiento.
   Δx_muestra = Δx_{total registrado - Máquina} Δx
9. Repita los pasos 2.7-2.8 para cada punto de datos recolectado para cada espécimen (hueso).
   NOTA: Este paso es importante porque durante la prueba de compresión, el desplazamiento observado no solo se debe al desplazamiento de la muestra, sino que el desplazamiento observado es una combinación del desplazamiento de la máquina (_máquina Δx) (por ejemplo, compresión/desplazamiento del marco, la celda de carga, las placas, los acoplamientos, etc.) y la muestra (_muestra Δx). Por lo tanto, para muestras que experimentan cantidades relativamente pequeñas de desplazamiento, como las de un animal pequeño (por ejemplo, ratón), el desplazamiento del sistema (_máquina Δx) puede causar grandes errores. Los procedimientos aquí descritos para corregir el desplazamiento del sistema fueron reportados previamente por Kalidindi y Abusafieh²⁸, quienes también detallan otros dos métodos además del aquí descrito. Se ha observado que algunos investigadores utilizan más de un método para determinar el desplazamiento del sistema¹⁷. Cada máquina puede mostrar patrones y grados únicos de desplazamiento del sistema cuando se le aplican cargas. Por esta razón, el factor de corrección de desplazamiento del sistema debe determinarse para cada máquina y no será el mismo entre dos máquinas. A diferencia de la prueba de compresión de un hueso vertebral, no se observará una gran reducción de la fuerza cuando se mida el desplazamiento del sistema porque no hay material entre la platina superior e inferior.

3. Disección de la ^5ª vértebra lumbar (L5) del cadáver del ratón

1. Descongele la canal de ratón congelada a temperatura ambiente, teniendo cuidado de mantener hidratados los tejidos blandos y los huesos mediante la aplicación regular de una solución isotónica de NaCl al 0,9%.
2. Haga una pequeña incisión (<0,5 cm) en la piel de la línea media dorsal cerca de la base de la cola, luego extienda el corte a través de cada extremidad posterior y tire suavemente para quitar la piel desde la base de la cola hasta la cabeza del animal.
3. Cortar la musculatura de la pared abdominal hasta que la columna vertebral sea fácilmente visible.
4. Bajo un microscopio de disección, visualice las dos articulaciones sacroilíacas y el extremo craneal del sacro.
5. Con una cuchilla de afeitar o un bisturí, haga un corte fino para separar la última vértebra lumbar (L6) del extremo craneal del sacro.
6. De nuevo, cortando entre el espacio intervertebral, se extraen las L6 y L5 de la columna vertebral, reservando la L5 para su análisis (Figura 3).
7. Inspeccione la vértebra bajo un microscopio de disección y extraiga todos los tejidos blandos del hueso, incluido el disco intervertebral, utilizando principalmente almohadillas de gasa y suavemente con fórceps cuando sea necesario.
   NOTA: En el presente estudio, se eligió la L5 como la vértebra de interés, pero se pueden elegir otras vértebras lumbares para la prueba de compresión.

4. Preparación de la superficie de carga de la vértebra L5 para la prueba de compresión uniaxial utilizando el método de inclusión de cemento óseo PMMA

1. Usando un disco de corte de diamante (ver Tabla de Materiales) conectado a una herramienta rotativa, haga un corte en cada pedículo para eliminar la apófisis transversal y espinosa (Figura 4). Si se dejan adheridas al centro, las apófisis vertebrales pueden dar lugar a contactos locales con las platinas superiores/inferiores en las propias apófisis, en lugar de una distribución de la carga a lo largo del centro.
2. Lija suavemente el extremo caudal de la vértebra con papel de lija fino de grano 120 (ver Tabla de materiales) para eliminar todos los discos intervertebrales, los tejidos blandos y las irregularidades.
3. Marque el extremo caudal lijado con un rotulador permanente para facilitar su posterior identificación.
4. Mezcle el cemento óseo de PMMA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
5. Con el cemento óseo de PMMA aún semiblando, coloque una cantidad mínima en el extremo craneal (sin marcas) de la vértebra hacia arriba, asegurándose de que toda la superficie esté cubierta mientras la vértebra se asienta en un baño salino para mantener la muestra ósea hidratada y fresca.
6. Con el PMMA aún semiblando, coloque la vértebra en la platina inferior con el lado caudal (marcado) hacia abajo (Figura 5).
7. Encienda la máquina para engranar los engranajes impulsores y baje lentamente la platina superior sobre el complejo de cemento óseo vértebra + PMMA hasta que se haga contacto con el cemento óseo y se aplique una fuerza mínima (<0,5 N) para distribuir el PMMA uniformemente en la superficie ósea. La platina superior en posición neutra puede estimarse como horizontal y, al presionar sobre PMMA semiblando, hará que el PMMA llene la concavidad en el extremo craneal de la vértebra y forme una superficie horizontal plana debajo de la platina superior.
8. Con la platina superior presionando suavemente el cemento óseo de PMMA, deje reposar la muestra sin tocar hasta que el cemento óseo de PMMA se haya endurecido por completo (~ 10 minutos según las instrucciones del fabricante para el cemento óseo de PMMA utilizado en el presente estudio). Mantenga la muestra en un baño de solución salina o rocíela con frecuencia con solución salina durante este período para mantener la muestra hidratada y fresca.
9. Una vez que el cemento óseo de PMMA se ha endurecido por completo, puede comenzar la prueba de compresión. Recopile datos de carga (es decir, fuerza) (N) y desplazamiento (es decir, deflexión) (mm) de los sensores en una hoja de cálculo en tiempo real utilizando un software digital diseñado para la recopilación de datos de pruebas mecánicas (consulte la Tabla de materiales).
10. Después de la recopilación de datos de referencia durante 5 s, aplicados a una fuerza de precarga mínima de <0,5 N, comience a bajar la platina superior sobre la muestra a una velocidad de descenso única (es decir, monótona) predeterminada para iniciar la prueba de compresión (~1 mm/min).
11. Deje de recopilar datos una vez que se haya observado una gran reducción en la carga (N), lo que indica una falla del material.
    NOTA: Las instrucciones del fabricante especificarán el tiempo aproximado de endurecimiento del cemento óseo de PMMA. El tiempo de endurecimiento del cemento óseo de PMMA puede diferir según el tipo de cemento óseo de PMMA utilizado. Siga las instrucciones del fabricante para determinar el tiempo de espera para el endurecimiento con PMMA. Sin embargo, como indicador de que el cemento óseo de PMMA se ha endurecido por completo, se puede mezclar una muestra adicional del cemento óseo de PMMA al mismo tiempo que la muestra que se colocará en la vértebra, pero se mantendrá a un lado y se verificará para ver si todavía está blanda o completamente endurecida. Si está completamente endurecido, esto puede indicar que el PMMA en el hueso también está completamente endurecido sin alterar el complejo hueso + PMMA. La muestra ósea debe permanecer bien hidratada y fresca durante los períodos de endurecimiento y prueba de PMMA. Tan solo unos pocos minutos de exposición al aire seco pueden provocar cambios en las propiedades biomecánicas. Algunos investigadores utilizan máquinas de ensayo de compresión equipadas con un baño salino¹⁹. La máquina de ensayo de compresión no disponía de baño salino en el presente estudio. En su lugar, se aplicó regularmente una fina niebla de solución salina durante todo el período de endurecimiento del PMMA y el período de prueba.

5. Análisis de curvas de carga-desplazamiento para ensayos de compresión uniaxial de vértebras L5

1. Copie y pegue los datos de carga (N) y desplazamiento corregido (mm) de la hoja de cálculo en un software de gráficos técnicos y análisis de datos (consulte la tabla de materiales).
2. Genere un gráfico con la carga (N) en el eje Y y el desplazamiento corregido de la muestra (Δx_muestra, mm) en el eje X (Figura 6). Haga esto en el software haciendo clic primero en Windows, Nueva tabla, luego Hacerlo para hacer una tabla. Copie los datos corregidos de desplazamiento (mm) y carga (N) de la hoja de cálculo de datos sin procesar en la nueva tabla.
3. A continuación, genere una forma de onda para representar datos sin procesar haciendo clic en Datos, luego haga clic en Par XY a Forma de onda y seleccione los datos de desplazamiento corregidos para la onda X y los datos de carga para la onda Y. Asegúrese de que el número correcto de puntos de datos esté en el cuadro "Número de puntos", asigne un nombre a la forma de onda y luego haga clic en Crear forma de onda. Una vez que se ha creado una forma de onda, genere un gráfico haciendo clic en Windows, luego en Nuevo gráfico, y coloque la forma de onda en el eje Y y "calculada" en el eje X.
4. Utilice la herramienta de cursor para marcar puntos/regiones de interés en el gráfico para su análisis. Algunos de los puntos/regiones de interés para calcular las propiedades mecánicas comunes de todo el hueso se mencionan en los pasos 5.4-5.8 (Figura 6), e incluyen el trabajo hasta la falla (N x mm), la carga máxima (N), la rigidez (N/mm), la carga de fluencia (N) y el desplazamiento posterior al límite elástico (mm).
5. Para el cálculo del trabajo hasta el fallo (N x mm), coloque un cursor (A) al inicio de la prueba y un cursor (B) en el punto inmediatamente anterior a la falla del material (es decir, a la carga máxima alcanzada durante la prueba antes de que se observe una gran disminución de la carga).
   NOTA: Por lo tanto, los cursores A-B colocarán entre paréntesis la totalidad de la prueba desde el momento en que el material comienza a soportar fuerzas y sufre desplazamiento hasta el punto en que el material falla. El trabajo hasta el fallo (N x mm) se puede medir como el área total debajo de la curva (es decir, el área debajo de la curva entre los cursores A y B).
6. Calcule la carga máxima (N) como el valor más alto para la carga que se observa durante la prueba (es decir, carga en el cursor B).
7. Calcule la rigidez (N/mm) del material como la pendiente de la región elástica lineal (es decir, la pendiente entre los cursores C y D).
8. La carga de fluencia (N) es la carga a la que la curva de carga-desplazamiento se desvía de la linealidad y entra en la región plástica, manteniendo así una deformidad permanente (es decir, carga en el punto D). Calcule esto midiendo la carga en el cursor D.
9. El desplazamiento posterior al límite elástico (mm) es un indicador de la ductilidad de un material. Mida esto como el desplazamiento entre el punto de fluencia y el punto de falla del material (es decir, el desplazamiento entre los cursores D y B).
   NOTA: Los parámetros enumerados anteriormente son solo algunas de las propiedades mecánicas comunes de hueso entero informadas. No es una lista completa de todas las propiedades mecánicas de hueso entero que se pueden obtener a partir de una curva de carga-desplazamiento. Otros parámetros de las propiedades mecánicas de todo el hueso incluyen el desplazamiento total (mm), la energía elástica absorbida (N x mm), el desplazamiento elástico (mm), la energía plástica absorbida (N x mm) y el desplazamiento plástico (mm), por nombrar algunos. Además, no se enumeran las propiedades mecánicas óseas a nivel tisular; Estos requieren transformaciones de datos utilizando medidas anatómicas específicas, como el diámetro del hueso. En el Archivo Suplementario 1 se ha incluido un código de ejemplo para realizar las mediciones de la curva de carga-desplazamiento en el software.

Resultados

Con este protocolo paso a paso que utiliza la incrustación de la superficie de carga L5 y una máquina de flexión de tres puntos convertible / máquina de prueba de compresión, es posible realizar pruebas de compresión en vértebras lumbares de ratón para comparaciones entre grupos. Un total de veinticuatro vértebras L5 de ratón se prepararon utilizando el método de inclusión. Sin embargo, tres de las muestras resultaron dañadas durante la extracción de las apófisis vertebrales utilizando un disco de corte de diamante en una herramienta rotativa y, por lo tanto, no se analizaron. Teniendo en cuenta esto, las propiedades mecánicas enumeradas se obtuvieron con éxito a partir de veintiuna de veinticuatro muestras utilizando el método de incrustación. Las muestras se inspeccionaron visualmente después de cada prueba, y la tapa de PMMA no sufrió daños en ninguna de las pruebas. Como se señaló, los ratones utilizados en el presente estudio formaron parte de un estudio más amplio con el objetivo de determinar los efectos de la semilla de cáñamo dietética en los huesos de ratones hembra C57BL/6 jóvenes y en crecimiento. En la Tabla 1 se ofrecen estadísticas descriptivas de cinco propiedades mecánicas de hueso entero comúnmente reportadas. Las curvas de carga-desplazamiento para las veintiuna muestras se proporcionan en la Figura 7.

Figura 1: Conversión de una máquina dobladora de tres puntos en una máquina de ensayo de compresión. (A) La máquina está totalmente equipada para funcionar como una máquina dobladora de tres puntos con el sensor de desplazamiento y el sensor de carga indicados (flechas blancas). (B) La máquina después de que se haya retirado la viga de la cruceta. (C) La máquina después de que se haya colocado una platina superior autoalineable donde se colocó previamente la viga de la cruceta. (D) Las vigas de soporte inferiores con agujeros perforados en ellas. (E) La platina inferior de acero inoxidable con cuatro orificios roscados roscados y un tornillo parcialmente atornillado en uno de los orificios. Los otros dos agujeros que no se ven en la foto están en el lado opuesto. (F) Las vigas de soporte inferiores con la platina inferior unida a ellas por cuatro tornillos hexagonales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Un ejemplo de desplazamiento del sistema (_máquina Δx) frente a un gráfico de carga ajustado con una regresión lineal (A), logarítmica (B), polinomial de segundo orden (C) y polinomio de tercer orden (D). En este ejemplo, el polinomio de tercer orden proporciona el mejor ajuste según el valor de R² y su regresión se utiliza como factor de corrección de desplazamiento del sistema. Las imágenes representan datos de ejemplo para demostrar el ajuste de regresión y deberán ser obtenidas por los investigadores para máquinas individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Columna vertebral lumbar de ratón. Una columna vertebral lumbar de ratón bajo un microscopio de disección antes de que se extirpara L6 (A) y después de que se hubiera extirpado L6, quedando L5 adherida (B). Posteriormente, se retirará L5 y se preparará para la prueba de compresión. Las bandas de color blanco son los discos intervertebrales que fueron diseccionados y extirpados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Anatomía de la vértebra L5. Una vértebra L5 representativa de ratón en vistas craneal, caudal, dorsal y ventral bajo un microscopio de disección. Las dimensiones importantes para el cuerpo vertebral incluyen la altura, el ancho dorsoventral y el ancho lateral, como se muestra en las líneas de colores. Las líneas discontinuas negras muestran aproximadamente dónde se deben hacer los cortes para eliminar las apófisis vertebrales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Período de endurecimiento del cemento óseo PMMA. Un ejemplo de vértebra L5 con cemento óseo de PMMA (verde) colocado en la placa terminal craneal y la platina superior bajada sobre el cemento óseo de PMMA + complejo óseo. Una vez que el cemento óseo de PMMA se haya endurecido por completo, comenzará la prueba de compresión. La platina superior se bajará aún más hasta que se observe una falla del material. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Prueba de compresión ósea vertebral de ratón, curva de carga-desplazamiento y análisis de datos. El cursor A marca el inicio de la prueba de compresión. El cursor B marca el punto de falla del material. El cursor C marca el inicio de la región elástica lineal, mientras que el cursor D marca el final (es decir, el límite elástico). El área sombreada en gris claro es la región elástica lineal, donde el material volverá a su forma original si se elimina la carga. El área sombreada de gris oscuro es la región plástica, donde el material ha sufrido una deformidad permanente y no volverá a su forma original si se retira la carga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Curvas de carga-desplazamiento para las veintiún muestras óseas. Los patrones variaban entre los huesos. En general, la mayor variabilidad se produjo en el desplazamiento posterior a la producción, ya que algunos (n = 5) de los huesos tuvieron un desplazamiento posterior a la producción relativamente pequeño y otros (n = 16) tuvieron un desplazamiento posterior a la producción relativamente grande. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Grupo	Trabajo hasta el fallo (N*mm)	Carga máxima (N)	Rigidez (N/mm)	Límite elástico (N)	Desplazamiento posterior al rendimiento (mm)
CON (n = 7)	13.43 ± 2.44 A,B	37,93 ± 3,28	109,14 ± 11,86	22,68 ± 2,04	0,34 ± 0,06
5HS (n = 8)	12.12 ± 1.23 A	33,62 ± 2,43	99,70 ± 16,62	20,88 ± 2,69	0,38 ± 0,08
15HS (n = 6)	19,55 ± 2,13 B	41,82 ± 1,85	134,58 ± 19,73	28.07 ± 3.20	0,51 ± 0,07
Grupos combinados (n = 21)	14.68 ± 1.27	37.40 ± 1.63	121,82 ± 9,43	23.54 ± 1.60	0,40 ± 0,04

Tabla 1: Valores representativos de las propiedades mecánicas de hueso entero comúnmente reportadas obtenidas utilizando el método de inclusión de preparación de la superficie de carga. Los valores se obtuvieron utilizando todos los protocolos detallados en el presente estudio. Por lo tanto, los valores representan aquellos que se pueden obtener utilizando los métodos aquí descritos. Los valores son medias ± SEM. Los grupos representan ratones hembra C57BL/6 alimentados con una dieta enriquecida con semillas de cáñamo enteras a concentraciones de 0% (CON), 50 g/kg (5%) (5HS) o 150 g/kg (15%) (15HS) entre las 5 y las 29 semanas de edad. Para uno de los parámetros (work-to-failure), parece que la dieta influyó en los valores de ANOVA de un factor (p < 0,05). Los valores que comparten el mismo superíndice de letras no son significativamente diferentes (p > 0,05), mientras que los valores con diferentes superíndices de letras son significativamente diferentes (p < 0,05), según el análisis post hoc de Tukey-Kramer.

Archivo complementario 1: Código de ejemplo para obtener propiedades mecánicas de hueso entero. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El objetivo del presente estudio fue describir la construcción de una máquina convertible de flexión de tres puntos/máquina de ensayo de compresión, así como el uso de un método de inclusión de cemento óseo PMMA para la preparación de muestras de vértebras lumbares de ratón antes de la prueba de compresión uniaxial. Se obtuvieron y reportaron estadísticas descriptivas para las muestras óseas, que serán útiles para la comparación en futuros estudios. En el presente estudio se analizaron algunas de las propiedades mecánicas de hueso entero más comúnmente reportadas. Sin embargo, vale la pena señalar que hay varias propiedades mecánicas adicionales a nivel de hueso entero y tejido que no se investigaron aquí.

Todavía no está claro cómo se comparan las propiedades mecánicas obtenidas de las muestras preparadas mediante el método de inclusión con las preparadas mediante el método de corte de las vértebras lumbares de ratón. Schumancher¹⁷ evaluó previamente las propiedades mecánicas de las vértebras de rata preparadas utilizando los dos métodos diferentes y encontró que las vértebras preparadas utilizando el método de inclusión tenían una rigidez significativamente menor, un mayor desplazamiento de fluencia y una mayor deformación de fluencia que las muestras preparadas con el método de corte. Se necesita una mayor caracterización para comprender cómo se comparan las propiedades mecánicas vertebrales de ratones u otros modelos animales cuando se miden utilizando los dos métodos diferentes de preparación de la superficie de carga. Se espera que algunos parámetros difieran entre las vértebras preparadas con diferentes métodos, dado que el método de inclusión agrega material a la muestra pero preserva la placa terminal, que es una estructura importante en las fracturas vertebrales in vivo^17,27. La adición de cemento óseo al extremo craneal agrega altura a la muestra, mientras que el corte de las placas finales elimina la altura, alterando la relación de aspecto y, por lo tanto, cambiando las propiedades mecánicas como la rigidez. Además, aunque el PMMA es más rígido que el hueso esponjoso vertebral, es posible que el PMMA sufra desplazamiento, y la extensión de este desplazamiento necesita una mayor caracterización. Además, no está claro cómo se comparan los resultados obtenidos con el método de inclusión o el método de corte con las predicciones de los parámetros óseos mediante el análisis de elementos finitos para las vértebras de ratón o cómo varían los resultados en diferentes condiciones (por ejemplo, velocidad de descenso, diferentes niveles vertebrales, composiciones de PMMA). No obstante, debido a que todas las muestras se preparan de manera similar, este método es apropiado y permite un medio fácil y rentable de hacer comparaciones entre grupos de tratamiento en un solo estudio en el que las muestras se preparan y analizan en condiciones similares.

En cuanto a la preparación de la muestra antes de la prueba de compresión, es esencial preparar las muestras de manera reproducible. Una posible limitación del método descrito en el presente estudio es el uso de una herramienta rotativa para eliminar las apófisis vertebrales. Otro método para extirpar las apófisis vertebrales de las vértebras lumbares de ratón ha sido descrito por Pendleton et ^al.19, lo que puede permitir una preparación más consistente de la muestra. Además, pueden surgir inconsistencias de la aplicación de cemento óseo de PMMA. Por lo tanto, es importante aplicar el cemento óseo de manera consistente en términos de volumen, colocación y tiempo de endurecimiento. Sin embargo, el método de inclusión puede proporcionar un medio más simple para lograr una preparación de muestras consistente en comparación con el método de corte, ya que puede ser un desafío lograr cortes paralelos perfectamente uniformes y consistentes entre todas las muestras debido a su pequeño tamaño y fragilidad. Se necesitarán estudios futuros para evaluar la precisión de los resultados obtenidos a partir de muestras preparadas utilizando el método de inclusión vs. método de corte.

Como se mencionó, se necesita una mayor caracterización e investigación del método de inclusión para la preparación de muestras de vértebras lumbares de ratón antes de la prueba de compresión uniaxial. No obstante, este estudio demuestra que este método puede ser empleado, proporciona una descripción detallada del método propuesto y ofrece estadísticas descriptivas de los parámetros medidos a partir de muestras preparadas con el método. Este protocolo es valioso para el campo debido a la falta actual de metodología disponible. Además, este método puede imitar mejor el mecanismo por el cual ocurren las fracturas vertebrales in vivo en comparación con otros métodos^17,27. El método también tiene la ventaja de superar las dificultades técnicas asociadas con otros métodos actualmente reportados, lo que hace que las pruebas de compresión uniaxial sean más factibles en la investigación ósea. Esto es particularmente significativo porque los fármacos, las dietas u otras intervenciones pueden influir de manera diferente en los huesos ricos en corticales (p. ej., hueso largo de diáfisis media) y en los huesos ricos en trabecular (p. ej., cuerpos vertebrales), sin embargo, la flexión de tres puntos es el método predominante para evaluar las propiedades mecánicas de los huesos¹³. La combinación de la prueba de flexión de tres puntos y la prueba de compresión uniaxial puede ser aún más fácil de lograr mediante el uso de una máquina convertible de prueba de flexión / compresión de tres puntos. Por lo tanto, el presente estudio propone dos posibles medios para hacer que la evaluación del hueso rico en corticales y trabecular en el mismo estudio esté más disponible para los investigadores, lo que podría conducir a una mejor comprensión de cómo un tratamiento determinado afecta a diferentes tipos de hueso entre grupos experimentales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Papel de lija de grano 120	N/A	N/A	Para la eliminación de los tejidos blandos y las irregularidades de la placa terminal caudal Interfaz de
celda de carga de 24 bits	Sensores LoadStar, Freemont, California, EE. UU	DQ-1000	Para conectar sensores de carga y desplazamiento a un ordenador personal
Base Mouse Diet	Dyets, Inc, Bethlehem, PA, EE. UU	AIN-93G	Diet se alimentó a los ratones, sin semillas
de cáñamo añadidasDisco de corte de diamante con herramienta rotativa	Dremel US, Mt. Prospect, Illinois, EE. UU	F0130200AK	Para eliminar los procesos vertebrales
Sensor de desplazamiento	Mitutoyo, Aurora, Illinois, EE. UU	ID-S112EX Sensor de	desplazamiento con resolución de 0,001 mm y precisión de 0,00305 mm
Fuente de alimentación externa de voltaje variable	Extech Instruments, Nashua, New Hampshire, EE. UU	382213	Para proporcionar energía a las pruebas de compresión máquina
Hembra C57BL/6 Ratones	Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, EE. UU	027 (Código de cepa)	Modelo de ratón utilizado en el presente estudio
Semillas de cáñamo	Natera, Pitt Meadows, Canadá	670834012199	Semillas de cáñamo añadidas al software Base Mouse Diet
Igor Pro (Versión 8.04)	Wave Metrics, Portland, Oregón, EE. UU	/A	Software utilizado para el análisis
de la curva de carga-desplazamientoMini sensor de fuerza iLoad	Sensores LoadStar, Freemont, California, EE. UU.	MFM-010-050-S Sensor de	carga (fuerza) con una precisión del 1,0
% Solución salina isotónica (0,9%)	N/A	N/A	Para mantener hidratadas las muestras óseas
Miscoscopio Leica EZ4 W	Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania	NC1601884	Para disecciones óseas y extirpación de procesos vertebrales
Software	Microsoft ExcelMicrosoft Corporation, Redmond, Washington, EE. UU.	N/A	Para la transferencia de datos desde el software SensorVue
PALACOS R Bone Cement	Hareus Medical, Wehreim, Alemania	00-1112-140-01	Cemento óseo PMMA para la incrustación de la superficie de carga
Ordenador personal	N/A	N/A	Para el registro de datos (véase Interfaz de célula de carga de 24 bits, Software SensorVue, Software Microsoft Excel) y análisis (véase Software Igor Pro)
Software SensorVue	LoadStar Sensors, Freemont, California, EE. UU	/A	Software utilizado para la recopilación de datos en tiempo real durante las pruebas de compresión
Kit de disección de animales pequeños	N/A	N/A	Tijeras de disección, pinzas, bisturí, cuchillas, alfileres, almohadillas de gasa
Platina superior de acero inoxidable (autoalineable) y par de platina inferior	N/A	/A	Construido por el Departamento de Ingeniería de la Universidad Estatal de Colorado-Pueblo
Máquina dobladora de tres puntos	N/A	N/A	construida por el Departamento de Ingeniería de la Universidad Estatal de Colorado-Pueblo. Consulte Sarper et al. (2014) para obtener más detalles sobre la construcción