Artículo de método

Enfoque único para aislar neutrófilos de médula ósea de rata con capacidad comparable

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DOI:

10.3791/65506

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26 de abril de 2024

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1Department of Cardiovascular Surgery, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Sichuan Provincial Pancreatitis Centre, West China Hospital, Sichuan University, 3West China-Liverpool Biomedical Research Centre, West China Hospital, Sichuan University, 4Cardiovascular Surgery Research Laboratory, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Esta investigación describe dos técnicas para aislar abundantes trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) de la médula ósea de rata. Un método combina un kit comercial de aislamiento de neutrófilos con centrifugación en gradiente de densidad, mientras que el otro emplea solo centrifugación en gradiente de densidad. Ambos enfoques producen TNE funcionales que superan a los de los neutrófilos de sangre periférica.

Resumen

El objetivo principal de esta investigación fue desarrollar un enfoque fiable y eficiente para aislar las trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) de la médula ósea de rata. Este esfuerzo surgió debido a las limitaciones asociadas con el método tradicional de extracción de TNE de sangre periférica, principalmente debido a la escasez de neutrófilos disponibles para su aislamiento. El estudio reveló dos metodologías distintas para obtener neutrófilos de rata a partir de la médula ósea: un procedimiento simplificado de un solo paso que produjo niveles de purificación satisfactorios, y un proceso de dos pasos más intensivo en tiempo que exhibió una mayor eficiencia de purificación. Es importante destacar que ambas técnicas produjeron una cantidad sustancial de neutrófilos viables, que oscilaban entre 50 y 100 millones por rata. Esta eficiencia reflejó los resultados obtenidos al aislar neutrófilos de fuentes humanas y murinas. Significativamente, los neutrófilos derivados de la médula ósea de rata exhibieron capacidades comparables para secretar TNE en comparación con los neutrófilos obtenidos de sangre periférica. Sin embargo, el método basado en la médula ósea produjo consistentemente cantidades notablemente mayores tanto de neutrófilos como de TNE. Este enfoque demostró el potencial de obtener cantidades significativamente mayores de estos componentes celulares para aplicaciones posteriores. En particular, estos NET y neutrófilos aislados son prometedores para una variedad de aplicaciones, que abarcan los ámbitos de la inflamación, la infección y las enfermedades autoinmunes.

Introducción

Los neutrófilos constituyen un subconjunto crítico de leucocitos que desempeñan un papel fundamental en la respuesta inmunitaria innata. Se caracterizan por núcleos multilobulados y gránulos que contienen diversas proteasas y péptidos antimicrobianos1. Los neutrófilos funcionan principalmente a través de la degranulación, la fagocitosis y la formación de NET. La observación de los TNE fue realizada por primera vez por Takei et al. en 1996 durante un experimento en el que se estimularon neutrófilos con acetato de miristato de forbol (PMA)2. Posteriormente, el proceso de formación de NET fue acuñado como "NETosis" por Brinkmann et al.3 en 2004. Su investigación iluminó aún más el papel crucial de los NET en las respuestas antimicrobianas mediadas por neutrófilos. Los TNE son estructuras en forma de red compuestas de cromatina, histonas y proteínas antimicrobianas que se liberan de los neutrófilos activados en respuesta a estímulos infecciosos e inflamatorios. Los TNE pueden inmovilizar y matar patógenos invasores atrapándolos y exponiéndolos a una alta concentración de péptidos antimicrobianos y proteasas 1,3. Además, los NET contribuyen a la eliminación de las células apoptóticas y participan en la resolución de la inflamación. Estudios recientes también indican que una formación excesiva de TNE o una degradación deficiente de los TNE puede conducir a daño tisular, trastornos autoinmunes, trombogénesis y alteración de la revascularización 4,5,6,7,8,9,10.

El papel patogénico de los TNE en la fibrosis no controlada después del infarto de miocardio y en la formación de aneurismas ventriculares ha sido demostrado a través de la expansión de la fibrosis perivascular 4,11. El modelo de infarto de miocardio y el aislamiento de neutrófilos de la médula ósea en ratones están bien establecidos. Los leucocitos polimorfonucleares (PMN), un tipo de glóbulo blanco abundante en la sangre humana, sirven como una excelente fuente para aislar neutrófilos humanos. Este método elimina la necesidad de recolectar médula ósea, lo que mejora la seguridad y la eficiencia.

Los tumores neuroendocrinos también desempeñan un papel en la fibrilación auricular asociada con la remodelación cardíaca. Sin embargo, se utilizaron animales grandes como perros y cerdos para modelar la fibrilación auricular, ya que los ratones carecen de una aurícula lo suficientemente grande como para establecer un ciclo de reentrada o el modelo de FA, a menos que los canales iónicos específicos o las vías de señalización sean derribados o eliminados. Si bien es posible inducir fibrilación auricular en ratas y aislar neutrófilos de la sangre periférica de ratas como se describió anteriormente, los investigadores encontraron una limitación por la cual solo se podían aislar 2 x 105-5 x 105 neutrófilos de la sangre periférica (10 ml por rata). La extracción de suficientes NETs en cada punto de tiempo requirió aproximadamente 10-25 ratas (5 x 106 neutrófilos en total), lo que resultó en un proceso lento, costoso y, a menudo, de bajo rendimiento13. En este sentido, Li He y sus colegas presentan una estrategia orientada a la médula ósea para obtener TNE adecuados de ratas14. En su artículo, proporcionan una descripción completa del aislamiento de neutrófilos de la médula ósea de rata y comparan las capacidades de secreción de NET de los neutrófilos periféricos y de la médula ósea de rata. Los dos métodos descritos se adaptan a objetivos experimentales distintos, y ambos dan como resultado cantidades suficientes de neutrófilos de médula ósea de rata al tiempo que reducen el número de ratas necesarias. El método de aislamiento de dos pasos demostró una purificación superior de los neutrófilos, mientras que el método de un solo paso demostró ser eficiente en el tiempo con niveles de purificación aceptables. Además, los investigadores compararon la formación de NETosis y NET entre los neutrófilos de la médula ósea de rata y sus homólogos periféricos, encontrando la misma potencia que la PMN. Estos hallazgos contribuyen significativamente a los estudios relacionados con los neutrófilos de la fibrilación auricular y subrayan la importancia de seleccionar de manera flexible diferentes fuentes para el aislamiento de neutrófilos en varios animales de experimentación con diferentes distribuciones de neutrófilos.

Protocolo

El estudio se realizó bajo una licencia de proyecto (No. 20211404A) otorgada por el Comité de Ética Animal del Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan, en cumplimiento de las directrices del Comité de Ética Animal del Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan para el cuidado y uso de animales. De acuerdo con las directrices éticas, las ratas utilizadas en este estudio se mantuvieron en un ambiente controlado con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, temperatura a 22-24 °C y humedad del 50%-60%. A las ratas se les dio acceso a comida y agua ad libitum. Los animales utilizados en este estudio fueron ratas macho Sprague Dawley (SD) de 6-8 semanas de edad, con un peso aproximado de 250 g y libres de patógenos específicos. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Aislamiento de neutrófilos de rata

  1. Extracción de médula ósea
    1. Coloque a la rata en un recipiente apropiado para la anestesia (ver Tabla de materiales). Administrar isoflurano al 3% a la rata hasta que el animal quede inconsciente. Verifique la ausencia de respuesta a un pellizco en el dedo del pie o en la cola para asegurarse de la profundidad de la anestesia.
    2. Una vez que la rata esté profundamente anestesiada, realice la dislocación cervical colocando a la rata boca arriba y sosteniendo su cola con una mano mientras agarra la cabeza con la otra mano. Disloque el cuello rápida y firmemente aplicando una fuerza ascendente repentina y fuerte sobre la cola mientras tira de la cabeza hacia abajo hasta que se corte la columna cervical. Espere la confirmación de la muerte, como el cese de la respiración y la falta de latidos cardíacos, antes de proceder con la recolección o eliminación de tejidos.
    3. Sumerge la rata en etanol al 75% y déjala reposar durante unos minutos para esterilizar el pelaje y la piel. Coloca a la rata boca arriba y corta las extremidades inferiores a la altura de la cadera para proteger la cabeza del fémur. Use tijeras de disección para cortar el ligamento en la articulación del corvejón y doble la articulación de la rodilla hacia atrás para exponer el fémur y la tibia.
    4. Con fórceps y tijeras, retire con cuidado los músculos, tendones y otros tejidos conectados a los huesos. Enjuague los huesos con la solución salina equilibrada de Hank (HBSS, por sus siglas en inglés) para eliminar cualquier resto de restos de tejido y sangre. Repita dos veces más, para un total de tres lavados. Coloque los huesos limpios en un recipiente estéril.
    5. Use una jeringa de 5 o 10 ml con una aguja para introducir la médula a través de ambos extremos del hueso para aflojar la matriz de la médula. Enjuague la médula ósea con 10-15 ml de medios del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con otra jeringa, hasta que no se pueda eliminar la médula ósea visible.
    6. Centrifugar las células de la médula ósea a 300 x g durante 10 min a 20 °C. Agregue 5-10 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (consulte la tabla de materiales) para resuspender las células e incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos. Agregue 4 veces el volumen de HBSS a la mezcla. Centrifugar las células a 600 x g durante 5 min a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante con una pipeta y utilizar el gránulo resultante para su uso posterior.
  2. Aislamiento de neutrófilos de la médula ósea
    1. Para el método de dos pasos, realice los siguientes pasos adicionales:
      1. Aísle las células de la médula ósea utilizando el kit de aislamiento de neutrófilos de rata comercializado siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
      2. Prepare un gradiente de densidad colocando 2 ml de reactivo de percolla al 55 % (consulte la tabla de materiales), 2 ml del 65 % del reactivo, 2 ml de reactivo al 70 % y 2 ml de reactivo al 80 % en un tubo de centrífuga nuevo de 15 ml. Centrifugar el tubo a 800 x g durante 40 min a 20 °C, con la aceleración ajustada a 5 y la desaceleración a 0 o 1.
      3. Recoja la capa de gradiente del 70 %, incluidas las capas celulares en el límite entre el reactivo de gradiente del 65 % y el 70 %, utilizando una pipeta estéril. Transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml. Agregue 15 ml de HBSS en el tubo e invierta suavemente el tubo varias veces para lavar las células. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente para granular las células.
    2. Para el método de un solo paso, realice los siguientes pasos adicionales:
      1. Sométase las células de la médula ósea a los gradientes sin utilizar el kit de aislamiento de neutrófilos de rata.
      2. Recoja la capa de gradiente del 70 %, incluidas las capas de células en el límite entre el 65 % y el 70 % de gradiente, utilizando una pipeta estéril. Transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml y lave las celdas con HBSS. Centrifugar el tubo a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente para granular las células.
      3. Contar los neutrófilos aislados con un hemocitómetro y evaluar la viabilidad mediante tinción con azul de tripano.
        NOTA: El protocolo puede ser modificado dependiendo del número de ratas y del número deseado de neutrófilos aislados. Se obtiene una cantidad aceptable de huesos de tres ratas cuando este método se utiliza por primera vez en un nuevo entorno experimental. Todos los procedimientos deben realizarse en condiciones estériles. El aislamiento de los neutrófilos de la médula ósea debe realizarse lo más rápidamente posible para minimizar el daño celular y la pérdida de viabilidad.

2. Adquisición de redes electrónicas para ratas

  1. Resuspender 0,5 x 108-1 x 108 8 neutrófilos aislados en un medio RPMI de 4 ml (suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% y penicilina-estreptomicina al 1%) en una placa de Petri estéril de 10 cm.
  2. Añadir 500 nM de PMA (ver Tabla de Materiales) a la suspensión de neutrófilos para inducir NETosis. Incubar durante 3 h a 37 °C y 5% de CO2.
  3. Para el control negativo, agregue DNasa I (10 U/mL) en la suspensión de neutrófilos para degradar los NET secretados.
  4. Para cosechar los NET, retire el medio y lave suavemente los NET adheridos a la placa de Petri con HBSS. Luego, use un lavado intenso con 4 ml de medios frescos para cada placa para separar los NET de la placa.
  5. Recoja el medio de lavado y pipetee con frecuencia para la resuspensión completa de los NET.
  6. Centrifugar la suspensión a 300 × g durante 10 min a 20 °C para eliminar las células flotantes.
  7. Transfiera la suspensión que contiene los NET a un tubo estéril y guárdela a -20 °C para su uso posterior en un plazo de 2 semanas.
    NOTA: Los NET son sensibles a la degradación, por lo que se recomienda utilizar material recién cosechado para obtener mejores resultados.

3. Verificación de la presencia de redes electrónicas

  1. Fijar las celdas (a partir del paso 2.4) en cubreobjetos con paraformaldehído al 4% durante 15 min y NETs (a partir del paso 2.7) durante 30 min a 1 h.
  2. Invierta el cubreobjetos sobre una gota de PBS/PBST en un soporte para tubos de ensayo cubierto con película de parafina y repita el proceso de lavado tres veces durante 5 minutos cada una.
  3. Permeabilizar las células con Triton-X-100 al 0,5% durante 10 min a temperatura ambiente y lavar tres veces en PBS/PBST durante 1 min cada una. Selle las células con el suero de burro normal al 10% (ver Tabla de Materiales) a temperatura ambiente durante 1 hora.
  4. Incubar las células con el anticuerpo anti-neutrófilos elastasa de rata y el anticuerpo anti-mieloperoxidasa de rata (ver Tabla de Materiales) durante la noche a 4 °C. A continuación, lave el cubreobjetos en PBS/PBST tres veces durante 5 minutos cada una.
  5. Incubar las células con el anticuerpo secundario A488-conjugado burro anti-conejo IgG (H + L), A594-conjugado burro anti-ratón IgG (H + L) y A594-conjugado cabra anti-Ratón IgG1 (ver Tabla de Materiales) a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad. A continuación, lave el cubreobjetos en PBS/PBST tres veces durante 5 minutos cada una.
  6. Tiñe los núcleos celulares y los esqueletos NET con 10 mg/mL de DAPI. A continuación, lave el cubreobjetos en PBS/PBST tres veces durante 5 minutos cada una.
  7. Coloque una gota de medio de montaje en un portaobjetos de vidrio e invierta el cubreobjetos con celdas sobre él. Déjalo secar durante 1 h para análisis microscópico con lentes de inmersión; de lo contrario, está listo para su inspección.
    NOTA: Se debe tener mucho cuidado al manipular los NET, incluso después de la fijación, ya que son extremadamente frágiles y pueden perderse fácilmente durante la preparación.

4. Cuantificación de las NETs

  1. Prepare el tampón Tris-EDTA (TE) y la solución de trabajo PicoGreen (reactivo de ensayo dsDNA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
  2. Prepare patrones diluyendo el ADN madre a concentraciones de 1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL y 1 μg/mL.
    NOTA: Para cuantificar la concentración de NETs, se empleó el kit de ensayo dsDNA (ver Tabla de Materiales), siguiendo las directrices del fabricante. El tampón Tris-EDTA (TE) y los reactivos de ensayo de ADNds se prepararon utilizando un volumen de 19 veces de agua destilada doble o un volumen de 199 veces de tampón TE, respectivamente. Posteriormente, se prepararon soluciones patrón (1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL y 1 μg/mL) y se combinaron 50 μL de la muestra con 450 μL de tampón TE.
  3. Añadir 50 μL de cada muestra a 450 μL de tampón TE.
  4. Agregue 100 μL de patrones o muestras junto con un volumen igual de solución de trabajo de reactivo de ensayo a cada pocillo en una placa de 96 pocillos, incluidos los patrones y las muestras.
  5. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 2-5 min, evitando la luz directa.
  6. Lea las muestras utilizando un lector de microplacas de fluorescencia con un espectro de emisión de unos 530 nm y un espectro de absorbancia de unos 480 nm.
  7. Calcule la concentración de NETs en cada muestra utilizando la curva estándar generada por los estándares.

5. Análisis de la secreción de NETs por citometría celular

  1. Agregue la tinción del núcleo (ver Tabla de Materiales) a las células incubadas en la placa de 96 pocillos para alcanzar una concentración final de 10 ng/mL e incube durante 30 min.
  2. Añadir ADN libre de células (cfDNA, ver Tabla de Materiales) a las células hasta alcanzar una concentración final de 300 nM e incubar durante 10 min.
  3. Mezcle los tintes fluorescentes mediante un pipeteo suave. No deseche el sobrenadante ni lave el pellet.
  4. Cargue la placa de muestra en el instrumento del citómetro.
  5. Ajuste los parámetros de enfoque y tiempo de exposición para los diferentes canales: azul (por ejemplo: 377/50 nm, em: 470/22 nm), normalmente con una exposición de 30.000 ms, verde (por ejemplo: 483/32 nm, eM: 536/40 nm) normalmente con una exposición de 5.000 ms.
  6. Capture imágenes altamente uniformes de toda la placa en diferentes canales.
  7. Analice los recuentos de tinción de núcleos para diferentes grupos. Si son similares, la secreción de NETs puede determinarse mediante el recuento de tinciones de ADNcf.

Resultados

El protocolo descrito en este documento describe dos métodos distintos, cada uno caracterizado por una purificación mejorada o pasos simplificados. Ambos métodos produjeron aproximadamente 0,5 x 108-1 x 108 neutrófilos por rata. El análisis de citometría de flujo, empleando el kit de detección de apoptosis de anexina V-FITC/PI, mostró una viabilidad celular superior al 90%, comparable a la de sus homólogos en ratones y humanos (Figura 1). Si bien la contaminación de los linfocitos parecía inevitable durante el aislamiento de neutrófilos de la médula ósea, el método de dos pasos demostró un nivel de pureza mejorado del 90% en comparación con el 50% logrado por el método de un solo paso (Figura 2).

Se observaron respuestas comparables en la secreción de NET entre los neutrófilos periféricos y de la médula ósea, independientemente de la estimulación de PMA (Figura 3). Además, los NET de rata mostraron capacidades limitadas de reticulación entre sí (Figura 4). En un esfuerzo por profundizar en el proceso de NETosis de ratas, se empleó PMA como inductor. Los NET se detectaron mediante tinción de ADNcf y se capturaron imágenes completas con un analizador de imágenes celulares. En particular, los neutrófilos de rata mostraron una mayor propensión a la NETosis espontánea en contraste con los neutrófilos de ratón y humanos, incluso sin estimulación externa. La incubación con PMA condujo a un aumento del 10% en el contenido de ADNcf después de 4 h (Figura 5). Cuando se expuso a 500 nM de PMA, la médula ósea de cada rata produjo una concentración final de 8-12 μg/mL NET-ADN. Cabe destacar que el contenido intracelular se extruyó de forma incompleta en los neutrófilos de rata durante la NETosis, lo que dio lugar a la observación de numerosos componentes intracelulares. Además, los NET de rata mostraron una inclinación a formar una película similar a una gasa debido a las tendencias de adhesión mejoradas, presentando una apariencia distintiva similar a una nube.

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Figura 1: Evaluación de la viabilidad de neutrófilos a partir del aislamiento de médula ósea. La fuente óptima para el aislamiento de neutrófilos en ratas es la médula ósea, lo que facilita la posterior adquisición de trampas extracelulares de neutrófilos. Esta figura es una adaptación de He et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Purificación de neutrófilos a partir de sangre periférica y médula ósea mediante tinción de Wright-Giemsa. (A) Origen de la sangre periférica. (B) Origen de la médula ósea mediante el método de un solo paso. (C) Origen de la médula ósea mediante el método de dos pasos. La extracción de médula ósea sirve como el enfoque preferido para el aislamiento de neutrófilos en ratas y la consiguiente adquisición de trampas extracelulares de neutrófilos. Barra de escala = 20 μm. Aumento = 400x. Esta figura es una adaptación de He et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Secreción de NET en la incubación con PMA o PMA + DNasa I. La extracción de médula ósea representa la ruta preferida para el aislamiento de neutrófilos en ratas y la posterior recolección de trampas extracelulares de neutrófilos. Esta figura es una adaptación de He et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Análisis inmunofluorescente. Tinción inmunofluorescente del núcleo (azul, A), MPO (verde, B) e imagen de fusión (C). NET: Trampa extracelular de neutrófilos; MPO: Mieloperoxidasa. La extracción de médula ósea es el método preferido para el aislamiento de neutrófilos en ratas y la posterior recolección de trampas extracelulares de neutrófilos. Barra de escala = 50 μm. Aumento = 200x. Esta figura es una adaptación de He et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Análisis exhaustivo del ADNcf a través de un analizador de imágenes celulares en diversas condiciones. Tinción fluorescente de cfDNA (verde) y núcleo (azul). La extracción de médula ósea es el enfoque principal para el aislamiento de neutrófilos en ratas y la consiguiente recolección de trampas extracelulares de neutrófilos. Barra de escala = 500 μm. Esta figura es una adaptación de He et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El aislamiento de neutrófilos constituye un paso fundamental en el estudio de la NETosis, donde la selección de un método de aislamiento apropiado es primordial para obtener resultados fiables. Un factor importante a tener en cuenta es la aparición de contaminación linfocitaria durante el aislamiento. Abordar este desafío es particularmente importante cuando se aíslan neutrófilos de rata de la médula ósea. A pesar del claro rango de densidad de neutrófilos (1,0814-1,0919, con un pico en 1,0919) en comparación con los linfocitos (1,0337-1,0765, con un pico en 1,0526), la contaminación con linfocitos sigue siendo ineludible. Esto puede atribuirse en parte a la abundancia de linfocitos en la médula ósea y al aumento de la densidad de linfocitos inmaduros15. Técnicas como la separación por gradiente de densidad, como el uso de Percoll y Ficoll, pueden ayudar a frenar la contaminación de los linfocitos, aunque lograr la eliminación completa de los linfocitos puede ser un desafío. Se puede emplear una solución de Percoll especializada, calibrada a un gradiente de densidad específico, para minimizar la contaminación aprovechando la variación de densidad entre los neutrófilos de rata y otras células de la médula ósea. Por lo tanto, los investigadores deben evaluar juiciosamente el impacto potencial de la contaminación de linfocitos en sus resultados experimentales y tomar medidas para mitigar su influencia.

Este estudio subraya la importancia de adaptar los métodos de aislamiento para que coincidan con requisitos experimentales específicos. En el método descrito anteriormente14, el método de un solo paso demostró ser menos exigente en términos de tiempo y esfuerzo. Como tal, fue aprobado para la adquisición de NET debido al impacto intrascendente de los linfocitos contaminantes en la secreción de NET. Estos linfocitos podrían ser eliminados posteriormente durante la etapa final de centrifugación. Por el contrario, para los esfuerzos que implican el aislamiento de neutrófilos y la posterior evaluación de la secreción de NETosis y NET, se recomendó el método de dos pasos14. Este enfoque permitió una cuantificación precisa de los NET producidos por los neutrófilos, al tiempo que minimizaba la influencia de los posibles factores de confusión derivados de otras contaminaciones celulares.

Se pueden realizar modificaciones en el protocolo de aislamiento para mejorar tanto el rendimiento como la pureza. Por ejemplo, la utilización de un conjunto de reactivos de gradiente de densidad optimizado puede producir más neutrófilos. Los métodos suaves de pipeteo y lavado también pueden mitigar la pérdida celular y reforzar la pureza. Las acciones de resolución de problemas, como el control del pH y la temperatura del tampón, junto con el ajuste de los parámetros de centrifugación, pueden abordar eficazmente los desafíos encontrados durante el proceso de aislamiento. Una limitación asociada al aislamiento de la médula ósea radica en la probabilidad de contaminación de neutrófilos inmaduros y otras células de la médula ósea, lo que afecta tanto a la pureza como al rendimiento. El diseño de un enfoque simplificado para expulsar los linfocitos podría mejorar la eficiencia general del aislamiento. Otra limitación se refiere a la necesidad de sacrificar animales para el aislamiento de la médula ósea, que podría ser inadecuado para las investigaciones longitudinales de neutrófilos de rata in vivo.

El aislamiento de neutrófilos en humanos se basa principalmente en la sangre periférica. Los métodos convencionales abarcan Ficoll-Paque, Percoll y la separación inmunomagnética de perlas 16,17,18. El enfoque de Ficoll segrega las poblaciones de leucocitos en función de la flotabilidad y se basa en un agente de contraste para diferenciar los neutrófilos. Ofrece simplicidad y rentabilidad, pero compromete la pureza y el rendimiento y presenta desafíos en la eliminación de glóbulos rojos. Por otro lado, Percoll explota los gradientes de densidad, produciendo una mayor pureza y rendimiento de neutrófilos a costa de equipos especializados y mayores gastos y tiempo19. La separación inmunomagnética de perlas es una técnica más nueva y específica que utiliza perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos que se unen específicamente a los neutrófilos con una contaminación mínima de otros leucocitos. Aunque es susceptible de automatización, requiere equipos especializados e incurre en costos más altos debido a los gastos de cordones. Al seleccionar un método de aislamiento de neutrófilos, los investigadores deben sopesar el rendimiento, la pureza, el costo y la complejidad. Actualmente, el método más conveniente para el aislamiento de neutrófilos humanos implica el uso de PolymorphPrep20. Este enfoque produce neutrófilos altamente purificados en cantidades significativas en un corto período de tiempo. El principio de PolymorphPrep se basa en la separación celular de acuerdo con la densidad.

En ratones, no se recomienda aislar los neutrófilos de la sangre periférica debido a los bajos volúmenes de sangre y al desafío de asegurar la cantidad y pureza suficientes para los experimentos posteriores. A pesar de que las ratas proporcionan cantidades suficientes de sangre (10 ml por rata), sus características de sangre periférica difieren de las de los humanos y los ratones. Las ratas presentan inherentemente deficiencias en la extracción de neutrófilos, siendo los monocitos las células nucleadas más abundantes 13,14. Por lo tanto, el aislamiento de sangre periférica solo proporciona 2 x 105-5 x 105 neutrófilos de una sola rata. La médula ósea sirve como una fuente de neutrófilos más viable, ofreciendo un suministro abundante y fácilmente disponible, independientemente del estado de infección del animal. Por otra parte, la inducción de un ambiente inflamatorio en la cavidad abdominal o el tórax para mejorar la infiltración de neutrófilos para el aislamiento es poco fiable e intrincada. Como tal, la extracción de médula ósea surge como una ruta práctica y confiable para el aislamiento de neutrófilos en ratas21.

La NETosis involucra diversos procesos celulares que abarcan la descondensación del ADN, la autofagia y la expulsión de la matriz intracelular1. En los seres humanos, la extrusión de NET es exhaustiva y deja restos de la membrana celular. Curiosamente, los estudios de neutrófilos en ratas exhiben patrones divergentes, revelando más contenido intracelular después de la estimulación. A pesar de la estimulación de PMA, los neutrófilos de rata exhiben una extrusión NET incompleta, alineándose con su NETosis espontánea. Curiosamente, los NET de rata demuestran una proclividad a las formas agregadas (aggNET) en lugar de a una estructura de red extensa, posiblemente debido a la reducción de la capacidad de reticulación. Este fenómeno podría tener un impacto significativo en la agregación de neutrófilos, influyendo en la respuesta inmunitaria más amplia en ratas. Las aplicaciones futuras del aislamiento de la médula ósea podrían implicar el sondeo de distintas vías de señalización y células inmunitarias en NETosis. Además, este método puede facilitar la exploración de NETosis en diversos modelos de enfermedades, desentrañando el papel de los neutrófilos en diferentes patologías. En última instancia, las nuevas técnicas para aislar y caracterizar los NET son prometedoras para desentrañar los mecanismos que impulsan la NETosis y sus implicaciones funcionales en diversos modelos animales.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Financiación: Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nos. 82004154, 81900311, 82100336 y 81970345).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
A488 conjugado burro anti-conejo IgG(H + L)Invitrogen, EE. UUA32790
A594-conjugado burro anti-ratón IgG(H + L)Invitrogen, EE. UUA32744
A594-conjugado cabra anti-ratón IgG1 Invitrogen, EE. UU.A21125
Anti-rata mieloperoxidasaAbcam, Inglaterraab134132
Elastasa de neutrófilos anti-rataAbcam, Inglaterraab21595
Celigo Citómetro de imagenNexelom, EE. UU.200-BFFL-5C
DNasa ISigma, EE. UU.10104159001
suero fetal bovino (FBS)Gibco, EE. UU.10099141C
Hank' s Solución salina equilibrada (HBSS)Gibco, EE. UU.C14175500BT
HoechstThermofisher, EE. UU.33342
IsofluranoRWD, ChinaR510-22-10
MowiolSigma, EE. UU.81381
Suero de burro normalSolarbio, ChinaSL050
Paraformaldehídobiosharp, ChinaBL539A
Penicilina-estreptomicinaHyclone, EE. UUSV30010
PercollGE, EE. UUP8370-1L
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)Sigma, EE. UU.  P1585
Kit de ensayo de dsDNA PicogreenInvitrogen, EE. UU.P11496
Kit de aislamiento de neutrófilos para ratasSolarbio, ChinaP9200
Tampón de lisis de glóbulos rojosSolarbio, ChinaR1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) mediosHyclone, EE. UU.SH30809.01B
RWD Máquina de anestesia animal universal RWD, ChinaR500
Sprague Dawley (SD) ratasDashuo, China
SytoxGreenThermofisher, EE. UU.Tampón S7020
Tris-EDTA (TE)Solarbio, ChinaT1120
Triton-X-100Biofroxx, Alemán1139ML100
. . . .

Referencias

  1. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
  2. Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Li, T., et al. Neutrophil extracellular traps induce intestinal damage and thrombotic tendency in inflammatory bowel disease. Journal of Crohn's and Colitis. 14 (2), 240-253 (2020).
  5. Laridan, E., Martinod, K., De Meyer, S. F. Neutrophil extracellular traps in arterial and venous thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
  6. Dinallo, V., et al. Neutrophil Extracellular traps sustain inflammatory signals in ulcerative colitis. Journal of Crohn's and Colitis. 13 (6), 772-784 (2019).
  7. Dicker, A. J., et al. Neutrophil extracellular traps are associated with disease severity and microbiota diversity in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (1), 117-127 (2018).
  8. Franck, G., et al. Roles of PAD4 and netosis in experimental atherosclerosis and arterial injury: Implications for superficial erosion. Atherosclerosis. 275, e11(2018).
  9. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
  10. Marin-Esteban, V., et al. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells. Infection and Immunity. 80 (5), 1891-1899 (2012).
  11. Kang, L., et al. Neutrophil extracellular traps released by neutrophils impair revascularization and vascular remodeling after stroke. Nature Communications. 11 (1), 2488(2020).
  12. Schüttler, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
  13. Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified human neutrophil extracellular traps (NETs) isolation and handling. Journal of Visualized Experiments. 98, e52687(2015).
  14. He, L., et al. Bone marrow is the preferred source for isolation of rat neutrophils and the subsequent acquisition of neutrophil extracellular traps. Annals of Translational Medicine. 10 (15), 823-823 (2022).
  15. Freeman, G. E., Dalton, C. A., Brooks, P. M. A Nycodenz gradient method for the purification of neutrophils from the peripheral blood of rats. Journal of Immunological Methods. 139 (2), 241-249 (1991).
  16. Zindl, C. L., et al. IL-22-producing neutrophils contribute to antimicrobial defense and restitution of colonic epithelial integrity during colitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12768-12773 (2013).
  17. Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
  18. Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
  19. Lindena, J., Burkhardt, H. Separation and chemiluminescence properties of human, canine and rat polymorphonuclear cells. Journal of Immunological Methods. 115 (1), 141-147 (1988).
  20. Lauwers, M., et al. Optimization of the Transwell assay for the analysis of neutrophil chemotaxis using flow cytometry to refine the clinical investigation of immunodeficient patients. Clinical Immunology. 238, 108994(2022).
  21. Evrard, M., et al. Developmental analysis of bone marrow neutrophils reveals populations specialized in expansion, trafficking, and effector functions. Immunity. 48 (2), 364-379 (2018).

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