Identificación de péptidos de pequeñas vesículas extracelulares a partir de macrófagos derivados de la médula ósea

Summary

Este protocolo describe un procedimiento para aislar pequeñas vesículas extracelulares de macrófagos mediante ultracentrifugación diferencial y extraer el peptidomo para su identificación por espectrometría de masas.

Abstract

Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) suelen ser secretadas por la exocitosis de los cuerpos multivesiculares (MVB). Estas nanovesículas con un diámetro de <200 nm están presentes en diversos fluidos corporales. Estos sEV regulan diversos procesos biológicos como la transcripción y traducción de genes, la proliferación y supervivencia celular, la inmunidad y la inflamación a través de sus cargas, como proteínas, ADN, ARN y metabolitos. En la actualidad, se han desarrollado diversas técnicas para el aislamiento de los sEV. Entre ellos, el método basado en ultracentrifugación se considera el estándar de oro y se usa ampliamente para el aislamiento de vehículos eléctricos. Los péptidos son naturalmente biomacromoléculas con menos de 50 aminoácidos de longitud. Estos péptidos participan en una variedad de procesos biológicos con actividad biológica, como hormonas, neurotransmisores y factores de crecimiento celular. El peptidomo está destinado a analizar sistemáticamente péptidos endógenos en muestras biológicas específicas mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Aquí, introdujimos un protocolo para aislar sEVs por ultracentrifugación diferencial y extrajimos peptidoma para su identificación por LC-MS/MS. Este método identificó cientos de péptidos derivados de sEVs de macrófagos derivados de la médula ósea.

Introduction

Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) con un diámetro inferior a 200 nm están presentes en casi todos los tipos de fluidos corporales y son secretadas por todo tipo de células, incluyendo la orina, el sudor, las lágrimas, el líquido cefalorraquídeo y el líquido amniótico¹. Inicialmente, los vehículos eléctricos se consideraron como receptáculos para la eliminación de desechos celulares, lo que llevó a una investigación mínima en la década siguiente². Recientemente, cada vez hay más pruebas de que los sEV contienen proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y otros metabolitos específicos. Estas moléculas son transportada....

Protocol

1. Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares

NOTA: Realice toda la centrifugación en los pasos 1.1-1.11 a 4 °C.

1. Preparación de suero fetal bovino (FBS) libre de sEVs: Centrifugar FBS durante la noche a 110.000 × g a 4 °C a través de una ultracentrífuga (ver Tabla de Materiales) para eliminar los sEVs endógenos. Recoja el sobrenadante, filtre, esterilícelo con una membrana de ultrafiltración de 0,2 μm y guárdelo a -20 °C.
2. Coloque aproximadamente 3 x 10⁷ macrófagos inmortalizados derivados de la médula ósea (iBMDM) en una placa de cultivo de 150 mm y agregue 20 m....

Results

Para los sEVs aislados por ultracentrifugación diferencial (Figura 1), se evaluó su morfología, distribución granulométrica y marcadores proteicos según la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV)¹⁷.

En primer lugar, la morfología de los sEV fue observada por TEM, mostrando una estructura típica en forma de copa (Figura 2A). La NTA mostró que los sEV aislados se concentraban principalmente a 13.......

Discussion

Al investigar la función de los sEV, es imperativo obtener sEV de alta pureza a partir de muestras biológicas complejas para evitar cualquier contaminación potencial. Se han desarrollado una variedad de métodos para el aislamiento de los sEV¹³, y entre estos métodos, los métodos basados en la ultracentrifugación diferencial han demostrado una pureza relativamente alta de los sEV. En este estudio, se recolectaron 200 mL de sobrenadante celular durante 6 h, y se obtuvieron alrededor de 200-300 μg de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de ensayo de proteínas BCA	Beyotime Technology	P0012
CD9	Beyotime Technology	AF1192
Tubo de filtro centrífugo	Millipore	UFC5010BK
Botellas de centrífuga de polipropileno	Beckman Coulter	357003	Centrífuga de alta velocidad
Sustrato quimioluminiscente	Thermo Fisher Scientific	34580
Dithiothreitol	Solarbio	D8220	100 g
DMEM medio	de cultivo Cell World	N? A
GRP94	Tecnología de señalización celular	20292
Centrífuga de alta velocidad	Beckman Coulter	Avanti JXN-26	Rotor centrífugo (JA-25.50)
Macrófagos derivados de la médula ósea inmortalizados (iBMDM)	Instituto Nacional de Ciencias Biológicas, China		Proporcionado por el Dr. Feng Shao (Instituto Nacional de Ciencias Biológicas, China)
Yodoacetamida	Sigma	l1149	5 g
Tubo de microfuga polipropileno	Beckman Coulter	357448	1,5 mL, Ultracentrífuga de sobremesa
sistema LC de nano-alto rendimiento	Thermo Fisher Scientific	EASY-nLC 1000
Análisis de seguimiento de nanopartículas	Malvern Panalytical	NanoSight LM10	NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X espectrómetro	Thermo Fisher Scientific	N/A
Solución salina tamponada con fosfato	Solarbio	P1020
Tubos de centrífuga de polialómero Beckman	Coulter	326823	Ultracentrífuga
Inhibidor de la proteasa	Bimake	B14002
Concentrador de vacío SpeedVac	Concentrador Eppendorf	plus
Ultracentrífuga de sobremesa	Beckman Coulter	Optima MAX-XP	Rotor de ultracentrífuga (TLA 55)
Microscopio electrónico de transmisión	HITACHI	H-7650B
TSG101	Sigma	AF8258
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	Optima XPN-100	Rotor ultracentrífugo (SW32 Ti)
Disruptor celular ultrasónico	Scientz	SCIENTZ-IID
Generador de imágenes Western Blot	Bio-Rad	ChemiDocXRs	Laboratorio de imágenes 4.0 (beta 7)
β-actina	Sigma	A3853