Aquí, presentamos un protocolo para realizar imágenes de calcio de dos fotones en el prosencéfalo dorsal de pez cebra adulto.
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Artículo de método
Imágenes de calcio de dos fotones de la actividad del prosencéfalo en peces cebra adultos que se comportan
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En este artículo
Resumen
Resumen
El pez cebra adulto (Danio rerio) exhibe un rico repertorio de comportamientos para estudiar las funciones cognitivas. También tienen un cerebro en miniatura que se puede utilizar para medir las actividades en todas las regiones del cerebro a través de métodos de imágenes ópticas. Sin embargo, los informes sobre el registro de la actividad cerebral en el pez cebra adulto han sido escasos. El presente estudio describe los procedimientos para realizar imágenes de calcio de dos fotones en el prosencéfalo dorsal del pez cebra adulto. Nos centramos en los pasos para evitar que los peces cebra adultos muevan la cabeza, lo que proporciona una estabilidad que permite la obtención de imágenes de escaneo láser de la actividad cerebral. Los animales con la cabeza sujeta pueden mover libremente las partes de su cuerpo y respirar sin ayudas. El procedimiento tiene como objetivo acortar el tiempo de la cirugía del reposacabezas, minimizar el movimiento del cerebro y maximizar el número de neuronas registradas. Aquí también se describe una configuración para presentar un entorno visual inmersivo durante las imágenes de calcio, que se puede utilizar para estudiar los correlatos neuronales subyacentes a los comportamientos desencadenados visualmente.
Introducción
Las imágenes de fluorescencia de calcio con indicadores codificados genéticamente o colorantes sintéticos han sido un método poderoso para medir la actividad neuronal en animales que se comportan, incluidos primates no humanos, roedores, aves e insectos. La actividad de cientos de células, hasta aproximadamente 800 μm por debajo de la superficie del cerebro, puede medirse simultáneamente utilizando imágenes multifotónicas 2,3. La actividad de tipos celulares específicos también se puede medir mediante la expresión de indicadores de calcio en poblaciones neuronales definidas genéticament....
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados y realizados de acuerdo con los lineamientos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Academia Sinica. Los detalles de las herramientas de investigación se pueden encontrar en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de la cámara de registro
- Prepare un tanque semihexagonal, una placa base y una etapa de cabeza (Figura 1A; Legajos Complementarios 1-3). La etapa principal consta de dos postes metálicos unidos a una placa circular. La placa circular contiene ranuras que se pueden bloque....
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Resultados
El protocolo consta de dos partes: cirugía de reposacabezas e imágenes de calcio de dos fotones de las actividades neuronales en el prosencéfalo. El éxito de la cirugía se define por la supervivencia del animal y la estabilidad del reposacabezas. La tasa de supervivencia puede mejorarse en gran medida mediante la perfusión frecuente de una solución de TMS al 0,01% a través de la boca durante la cirugía. Los peces deben recuperarse de la anestesia y respirar activamente dentro de 1-2 minutos después de sumergirse en el ag.......
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Discusión
Aquí, describimos un protocolo detallado para sujetar la cabeza de un pez cebra adulto para obtener imágenes de calcio de dos fotones. Hay dos pasos críticos para lograr un reposacabezas que sea lo suficientemente estable para las imágenes de escaneo láser. Primero, la barra de la cabeza debe pegarse a los sitios de fijación específicos de los cráneos. Otras partes del cráneo suelen ser demasiado delgadas para proporcionar estabilidad mecánica e incluso pueden fracturarse durante los movimientos fuertes del cuerpo. En se.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo contó con el apoyo del Instituto de Biología Molecular, la Academia Sinica y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Taiwán. El Taller de Máquinas del Instituto de Física de la Academia Sinica ayudó a fabricar piezas diseñadas a medida. También queremos agradecer a P. Argast (Instituto Friedrich Miescher de Investigación Biomédica, Basilea, Suiza) por el diseño del mecanismo de bloqueo rápido de la platina de la cabeza.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Carta de adquisición | MBF Biociencia | Vidrio vDAQ | Microscopio |
| Película de retroproyección | Kimoto | Pantalla Diland - GSK | Estímulo visual presente |
| Filtro pasa-banda (510/80 nm) | Chroma | ET510/80m | Microscopio |
| Placa base para el tanque semihexagonal | Hechos a medida | véase archivos suplementarios | Cámara de grabación |
| Filtro de cámara (< 875 nm) | Óptica de Edmund | #86-106 | Registro de conducta |
| Filtro de cámara (>700 nm) | Óptica de Edmund | #43-949 | Registro de conducta |
| Lente de cámara | Thorlabs | MVL50M23 | Registro de conducta |
| Visión Camaleón-S | Coherente | Visión-S | Láser |
| Placa circular para la etapa principal | Hechos a medida | véase archivos suplementarios | Cámara de grabación |
| Controlador para actuador piezoeléctrico | Instrumento Physik; | E-665. CR | Microscopio |
| Amplificador de corriente | Thorlabs | TIA60 | Microscopio |
| Elitedent Q-6 | Rolence Enterprise | Q-6 | Cirugía: Lámpara UV |
| Filtro de emisión 510/80 nm | Chroma | ET510/80m | Microscopio |
| Barra de cabeza | Hechos a medida | véase archivos suplementarios | Cámara de grabación |
| Luz infrarroja | Thorlabs | M810L3 | Registro de conducta |
| Proyector LED | AAXA | Proyector Pico LED P2B | Estímulo visual presente |
| Papel de seda húmedo (Kimwipe) | Ciencia Kimtech | 34155 | Cirugía: papel de seda húmedo |
| Etapa de muestreo XY motorizada | Zaber | X-LRM050 | Microscopio |
| Filtros de densidad neutra (50% de transmisión) | Thorlabs | NE203B | Estímulo visual presente |
| & Oslash; Soporte de poste de 1/2" | ThorLabs | PH1.5V | Cirugía: tubo hueco para cañón |
| & Oslash; Poste óptico de acero inoxidable de 1/2" | ThorLabs | TR150/M | Cirugía: módulo de carga de peces |
| Objetivo 16x, 0,8NA | Nikon | CF175 | Microscopio |
| Arcilla para modelar a base de aceite | Ly Hsin Clay | C4086 | Cirugía: soporte para la barra de la cabeza |
| Adhesivo óptico | Productos Norland | NOA68 | Cirugía: pegamento curable por UV |
| Tubo fotomultiplicador | Hamamatsu | H11706P-40 | Microscopio |
| Actuador piezoeléctrico | Instrumento Physik; | P-725.4CA PIFOC | Microscopio |
| Pockels Cell | Conópticos | M350-80-LA-BK-02 | Microscopio |
| Filtro Red Wratten (> 600 nm) | Óptica de Edmund | #53-699 | Estímulo visual presente |
| Sistema de escaneo resonante-galvo-galvo | INSS | RGE-02 | Microscopio |
| Abrazadera en ángulo recto para Ø Poste de 1/2" | ThorLabs | RA90/M | Cirugía: módulo de carga de peces |
| Abrazadera giratoria para Ø Poste de 1/2" | ThorLabs | SWC/M | Cirugía: módulo de carga de peces |
| ScanImage | MBF Biociencia | Versión básica | Microscopio |
| Tanque semihexagonal | Hechos a medida | véase archivos suplementarios | Cámara de grabación |
| Super-Bono C& Equipación B | Sun Medical Co. | Super-Bono C& B | Cirugía: cemento dental |
| Metanosulfonato de tricaína | Sigma Aldrich | E10521 | Cirugía: anestesia |
| Cámara USB | FLIR | BFS-U3-13Y3M-C | Registro de conducta |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Cirugía: pegamento de tejido |
Referencias
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
- Mittmann, W., et al.
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Reimpresiones y permisos
