Aquí, describimos un método para alterar selectivamente las expresiones génicas en el plexo coroideo mientras se evita cualquier impacto en otras áreas del cerebro.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Eliminación selectiva de genes en el plexo coroideo
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
El plexo coroideo (ChP) sirve como una puerta de entrada crítica para la infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC) tanto en condiciones fisiológicas como patológicas. Investigaciones recientes han demostrado que la regulación de la actividad de la CHP puede ofrecer protección contra los trastornos del SNC. Sin embargo, estudiar la función biológica de la ChP sin afectar a otras regiones cerebrales es un reto debido a su delicada estructura. Este estudio presenta un método novedoso para la eliminación de genes en el tejido ChP utilizando virus adenoasociados (AAV) o proteína recombinasa de la enzima de recombinación de ciclación (Cre) que consiste en la secuencia TAT (CRE-TAT). Los resultados demuestran que después de inyectar AAV o CRE-TAT en el ventrículo lateral, la fluorescencia se concentró exclusivamente en la ChP. Utilizando este enfoque, el estudio eliminó con éxito el receptor de adenosina A 2A (A2A R) en la ChP utilizando sistemas de ARN de interferencia (ARNi) o Cre/locus de X-overP1 (Cre/LoxP), y demostró que esta eliminación podría aliviar la patología de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Esta técnica puede tener implicaciones importantes para futuras investigaciones sobre el papel de la ChP en los trastornos del SNC.
Introducción
A menudo se pensaba que el plexo coroideo (ChP) ayudaba a mantener la homeostasis funcional del cerebro mediante la secreción de líquido cefalorraquídeo (LCR) y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)1,2. El aumento de la investigación en las últimas tres décadas ha revelado que la ChP representa una vía distinta para la infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC).
Las uniones estrechas (TJs) de la ChP, compuestas por un epitelio ChP monocapa, mantienen la homeostasis inmunológica impidiendo que las macromoléculas y las células inmunitarias entr....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los procedimientos con animales descritos en este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas descritas en la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Wenzhou.
1. Animales
- Compre ratones machos C57BL/6 de 8 a 12 semanas de edad y con un peso de 20 a 22 g.
- Obtener la línea de ratones transgénicos Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) y ratones machos A2AR flox/flox .
- Asigne aleatoriamente a los ratones a dos grupos y los aloje en jaulas, c....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Eliminación de A2AR específica de ChP mediante inyección ICV de AAV2/5-shRNA o CRE-TAT
El papel de A2AR en la ChP como un potente regulador de la información neuronal en la patogénesis de EAE sigue sin estar claro. La reducción de la expresión de A2AR específica de ChP podría arrojar luz sobre los efectos reguladores de A2AR sobre el sistema inmune central en EAE y otras inflamaciones del sistema nervioso. En este estudio se utilizó la inyección de CRE-TAT p.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La investigación presentó dos enfoques distintos para la eliminación dirigida de los genes ChP. El primer enfoque consistió en la inyección ICV de CRE-TAT, que contiene Cre recombinasa, en ratones A2AR flox/flox. El segundo abordaje consistió en la inyección de AAV2/5 portadora de ARNh de A2AR. Mediante la utilización de estas dos estrategias, el trabajo logró la eliminación selectiva de A 2A R dentro de la ChP y pudo demostrar los efectos protectores de la inhibición de la señalización d.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores afirman que no tienen intereses financieros contrapuestos ni otras revelaciones que declarar.
Agradecimientos
Agradecemos el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención Nº 31800903, otorgada a W. Zheng) y del Proyecto de Ciencia y Tecnología de Wenzhou (Nº Y2020426, otorgado a Y. Y. Weng) para este trabajo.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| A2ARflox/flox ratones | Laboratorio Estatal Clave de Oftalmología, Optometría y Ciencias Visuales, Universidad | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA | virus Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| medio de montaje antidecoloración | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| capilar de vidrio de borosilicato | Beijing Meiyaxian Technology Co., Ltd | B100-50-10 | |
| aparato estereotáxico cerebral | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 ratones | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT recombinasa | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| máquina cortadora de congelados | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson y compañía | 231141 | |
| jeringa Hamilton | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
| Coadyuvante de Freunds incompleto | Sigma | F5506 | |
| Microscopio confocal láser | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| Pegamento OCT | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehído | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sódico | Boyun Biotech PC13003 | ||
| Pistola de pipetas | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript Kit de síntesis de ADNc de 1ª hebra | Takara | 6110A | |
| Sistema de PCR en tiempo real | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdRatones de tomate | Laboratorio Jackson sacarosa | ||
| Sangon Biotech | A502792-0500 | ||
| homogeneizador de súper alta velocidad | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| solución | de xilenoCompañía de reactivos químicos de Chengdu Kelong | 1330-20-7 |
Referencias
- Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system.....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
