Eliminación selectiva de genes en el plexo coroideo

A menudo se pensaba que el plexo coroideo (ChP) ayudaba a mantener la homeostasis funcional del cerebro mediante la secreción de líquido cefalorraquídeo (LCR) y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)^1,2. El aumento de la investigación en las últimas tres décadas ha revelado que la ChP representa una vía distinta para la infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC).

Las uniones estrechas (TJs) de la ChP, compuestas por un epitelio ChP monocapa, mantienen la homeostasis inmunológica impidiendo que las macromoléculas y las células inmunitarias entren en el cerebro³. Sin embargo, bajo ciertas condiciones patológicas, el tejido ChP detecta y responde a patrones moleculares asociados al peligro (DAMPs) en el LCR y la sangre, lo que conduce a una infiltración inmune anormal y a una disfunción cerebral ^4,5. A pesar de su papel crítico, el pequeño tamaño de la ChP y su ubicación única en el cerebro dificultan el estudio de su función sin afectar a otras regiones cerebrales. Por lo tanto, la manipulación de la expresión génica específicamente en la ChP es un enfoque ideal para comprender su función.

Inicialmente, las líneas transgénicas de enzimas de recombinación de ciclación (Cre), que expresan Cre bajo el control de promotores específicos de genes expresados en la ChP, se utilizaron comúnmente para eliminar genes diana mediante la cría con genes candidatos floxados ^6,7,8. Por ejemplo, el factor de transcripción Forkhead box J1 (FoxJ1) se expresa exclusivamente en el epitelio ChP del cerebro prenatal del ratón⁷. Por lo tanto, la línea FoxJ1-Cre se utilizó a menudo para eliminar genes localizados en la ChP ^6,9. Sin embargo, el éxito de esta estrategia depende en gran medida de la especificidad del promotor. Poco a poco se descubrió que el patrón de expresión de FoxJ1 no era lo suficientemente distintivo, ya que FoxJ1 también estaba presente en células epiteliales ciliadas en otras partes del cerebro y del sistema periférico⁷. Para superar esta limitación, se realizó una inyección intracerebroventricular (ICV) de Cre recombinasa para administrar recombinasa en los ventrículos de las líneas transgénicas floxadas. Esta estrategia mostró una alta especificidad, como lo demuestra la presencia de fluorescencia de tdTomato únicamente en el tejido ChP^10,11. Sin embargo, este método todavía está limitado por la disponibilidad de líneas de ratones transgénicos floxed. Para abordar este problema, los investigadores han empleado la inyección de virus adenoasociados (AAV) en ICV para lograr la eliminación específica de ChP o la sobreexpresión de genes diana^12,13. Una evaluación exhaustiva de diferentes serotipos de AAV para la infección por ChP reveló que AAV2/5 y AAV2/8 exhiben una fuerte capacidad de infección en la ChP, mientras que no infectan otras regiones cerebrales. Sin embargo, se encontró que AAV2/8 infectaba el epéndimo que rodea a los ventrículos, mientras que el grupo AAV2/5 no mostró infección¹⁴. Este método tiene la ventaja de superar las limitaciones de la adquisición de animales transgénicos floxados.

Este artículo describe un protocolo paso a paso para la eliminación de genes en la ChP utilizando dos métodos: ICV de AAV2/5 portador de shRNA del receptor de adenosina A 2A (A 2A R) y proteína recombinasa Cre que consiste en la recombinasa de secuencia TAT (CRE-TAT) para lograr la eliminación específica de ChP de A_2A R. Los hallazgos del estudio sugieren que la reducción de A_2AR en la ChP puede aliviar la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Este protocolo detallado proporciona una guía útil para los estudios de la función de ChP y la eliminación específica de genes en ChP.

Todos los procedimientos con animales descritos en este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas descritas en la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Wenzhou.

1. Animales

1. Compre ratones machos C57BL/6 de 8 a 12 semanas de edad y con un peso de 20 a 22 g.
2. Obtener la línea de ratones transgénicos Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9) y ratones machos A_2AR flox^/flox .
3. Asigne aleatoriamente a los ratones a dos grupos y los aloje en jaulas, con un máximo de cinco ratones por jaula, bajo un ciclo estándar de 12 h de luz/12 h de oscuridad durante 1 semana.
4. Proporcione a los ratones suficiente comida y agua y manténgalos a una temperatura constante a 25 °C.

2. Eliminación específica de ChP de A _2ARs con AAV2/5-shRNA

1. Pesa cada ratón y anota los valores.
2. Anestesiar a los ratones por vía intraperitoneal con pentobarbital sódico al 1% a una dosis de 6-8 ml/kg equivalente a 60-80 mg/kg de pentobarbital, y colocar el ratón sobre una almohadilla térmica para mantenerlo caliente.
   NOTA: Es crucial administrar la dosis correcta de pentobarbital sódico de acuerdo con el peso del ratón para garantizar el éxito de la cirugía. La anestesia no debe ser demasiado profunda, ya que puede provocar la mortalidad, pero no debe ser demasiado superficial, ya que el ratón puede despertarse durante el procedimiento, lo que podría afectar la eficacia de la inyección del virus. Verifique la dosis adecuada de anestesia pellizcando los dedos de los pies y asegurándose de que los ratones no respondan.
3. Usa una afeitadora de ratón especializada para recortar el vello superior de los ratones anestesiados.
4. Aplique ungüento ocular en ambos ojos para evitar que se sequen y fije a los ratones en un aparato estereotáxico para inmovilizar el cerebro. Cubra al animal con una cortina estéril.
5. Esterilizar a fondo la piel de la cabeza y el cuello de los ratones con tres rondas de desinfectante yodóforo y alcohol al 75% para reducir la infección postoperatoria. A continuación, aplique lidocaína al 1% por vía tópica en el cuero cabelludo de ratones y haga una pequeña incisión para exponer completamente el cráneo bajo un microscopio.
   NOTA: Utilice instrumentos estériles durante todo el procedimiento.
6. Prepare dos jeringas de 10 μL: una con AAV2/5-A_2AR-shRNA comprado (título: 6,27 × 10 9 vg/μL) y la otra con AAV2/5-Scramble comprado (título: 6,21 × 10⁹ vg/μL).
   NOTA: Cuando se usa la jeringa, el extremo frontal debe conectarse a un capilar de vidrio, y se puede obtener un rango de 10 μL controlando la longitud del capilar de vidrio.
7. Utilice el microscopio para localizar el bregma y la lambda y establezca el punto de coordenadas (AP: -0,58; ML: ±1,10; DL: -2,20) en la jeringa de 10 μL (Figura 1). El punto de coordenadas se basa en el atlas estereotáxico¹⁵ del cerebro del ratón.
8. Perfora un pequeño agujero en el cráneo en el punto de coordenadas ajustado.
   NOTA: Bajo el microscopio, la perforación se realiza con un microtaladro estéril contra la superficie del cráneo. Después de la perforación, al extirpar las meninges que cubren el cerebro y exponer el parénquima cerebral subyacente, se previene la lesión de los vasos sanguíneos. Este paso evita que la punta del capilar de vidrio se rompa por las meninges. El diámetro del orificio perforado debe ser suficiente para permitir que la punta de la aguja entre en el tejido cerebral.
9. Administrar 2 μL de virus AAV2/5-A_2AR-shRNA en el ventrículo cerebral mediante inyección lateral a una velocidad constante de 100 nL/min. Mantenga la aguja en su lugar durante 10 minutos antes de retirarla. Hay que tener en cuenta que el virus se administró con inyección unilateral.
10. Selle la piel lesionada con pegamento médico de biofibrina rápidamente para evitar la pérdida de virus, que se puede enjuagar con líquido cefalorraquídeo después de quitar la aguja si el pegamento no se aplica rápidamente. Además, no use bastoncillos de algodón para limpiar el líquido cefalorraquídeo, ya que también puede causar la pérdida del virus.
11. Para facilitar la recuperación, coloque el ratón sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal entre 37,0 ± 0,5 °C, y aplique lidocaína al 1% por vía tópica en el cuero cabelludo del ratón. Dejar que los ratones se recuperen durante 2 semanas antes de inducir el modelo EAE, ya que este período es necesario para la expresión del virus AAV2/5-A 2A R-shRNA y la posterior eliminación de A_2AR.

3. Derribo específico de ChP de A _2AR con un sistema Cre/locus de X-overP1 (Cre/LoxP)

NOTA: Los siguientes procedimientos se pueden lograr utilizando el método descrito anteriormente. Consulte los pasos 2.1-2.11 para conocer los métodos de inyección detallados.

1. Inyectar 2 μL de CRE-TAT recombinasa en cada ventrículo lateral de un ratón Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato como grupo experimental y 2 μL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) como grupo de control. Utilizando el mismo protocolo anterior (sección 2), inyectar 2 μL de CRE-TAT recombinasa en cada uno de los ventrículos laterales de ratones A_2AR flox^/flox junto con 2 μL de PBS estéril como grupo de control.
2. Preparar secciones de tejido congelado y realizar la tinción nuclear 2 semanas después de la inyección de recombinasa CRE-TAT. Consulte los pasos 4.1-4.3 para obtener más información.

4. Perfusión transcárdica en ratones

1. Administrar 60-80 mg/kg de pentobarbital sódico para anestesiar profundamente a los ratones. Confirme el plano de anestesia con un pellizco en el dedo del pie y realice la perfusión transcardíaca con 40 ml de solución estéril de PBS seguida de 20 ml de paraformaldehído (PFA) al 4%.
   NOTA: El éxito de la perfusión se indica por un color blanco en el hígado, mientras que la presencia de pulmones agrandados o de salida de PBS de la boca durante la perfusión sugiere un fracaso del procedimiento.
2. Extrae rápidamente el cerebro del ratón, asegurando una degradación mínima de las proteínas.
3. Sumergir el cerebro del ratón en PFA/PBS al 4% durante la noche para la postfijación, seguido de la sustitución con una solución de PB de sacarosa al 30% durante 72 h.
   NOTA: Es fundamental evitar la deshidratación excesiva del tejido cerebral, por lo que el cerebro no debe dejarse en la solución de sacarosa PB durante demasiado tiempo.

5. Corte y tinción de tejido congelado

1. Incruste el cerebro de ratón previamente deshidratado en pegamento de temperatura óptima de corte (OCT), congele el cerebro incrustado y use un micrótomo deslizante para cortar secciones coronales con un grosor de 20 μm.
2. Coloque las secciones del cerebro en el portaobjetos de vidrio. Una vez que las secciones del cerebro estén secas, guárdelas en un refrigerador a -20 ° C para experimentos posteriores.
3. Coloque cada portaobjetos de vidrio en una caja con marco y sumérjalo en un recipiente lleno de PBS para enjuagar bien el portaobjetos. Enjuague suavemente los portaobjetos cerebrales con la solución de PBS tres veces, durante 10 minutos cada vez.
   NOTA: Se debe tener precaución para evitar que las secciones del cerebro se caigan del portaobjetos de vidrio.
4. Tiñe los portaobjetos cerebrales con una solución de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 10 min.
5. Enjuague los portaobjetos cerebrales con una solución de PBS durante 5 minutos.
6. Aplique una gota de medio de montaje antidecoloración en las secciones del cerebro.
7. Coloque un cubreobjetos en las secciones del cerebro, selle el cubreobjetos con esmalte de uñas y analice las secciones con un microscopio de fluorescencia convencional.

6. Inducción EAE

NOTA: Realizar la inducción de EAE después de 2 semanas de la inyección de recombinasa de shRNA o CRE-TAT¹¹.

1. Cree una solución acuosa mezclando 2,5 mg de glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG_35-55) con 2 ml de PBS. Prepare una solución completa de aceite de adyuvante de Freunds (CFA) mezclando M. tuberculosis (H37Ra) con adyuvante de Freunds incompleto (IFA).
2. Mezcle las soluciones acuosa y oleosa en una proporción de 1:1. Use un tubo en T para batir la mezcla a un estado de aceite en agua.
   NOTA: La tubería en T también se denomina tubería de tres vías. Es un tubo de plástico que puede controlar la dirección de flujo de la solución para mezclar completamente el MOG_35-55 y el CFA.
3. Utilizar un homogeneizador de alta velocidad para hacer la emulsión de antígeno MOG para el modelo EAE en condiciones de baño de hielo.
4. Anestesiar a los ratones por vía intraperitoneal con pentobarbital sódico al 1% a una dosis de 6-8 mL/kg equivalente a 60-80 mg/kg de pentobarbital.
5. Inyectar por vía subcutánea la emulsión de antígeno MOG en cuatro puntos diferentes (cuello, espalda, caderas izquierda y derecha) a un volumen de 10 ml/kg para un total de cuatro inyecciones cada uno.
   NOTA: Es importante seleccionar cuidadosamente el lugar de inyección, ya que los diferentes sitios pueden tener efectos variables en la morbilidad y mortalidad de los ratones. Además, las inyecciones repetidas de MOG pueden provocar tolerancia inmunitaria, por lo que el equipo de investigación eligió un solo método de inyección para prevenir este posible problema.
6. Inyectar inmediatamente 500 ng/ml de toxina pertussis (TP) por vía intraperitoneal a una dosis de 5 mg/kg después de la inyección de MOG.
   NOTA: La TP aumenta la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BHE) y facilita la infiltración de células T en el cerebro.
7. Después de 48 h, inyectar intraperitonealmente la solución de TP al mismo volumen.

7. Puntuación de déficit neurológico

1. Evaluar y calificar diariamente a los ratones mediante una escala de valoración¹⁶ de 0 a 15 para valorar la incidencia y gravedad de la EAE en función de los siguientes déficits neurológicos:
   Cola: 0 indica que no hay signos, 1 representa una cola medio paralizada y 2 indica una cola completamente paralizada.
   Extremidades: 0 indica que no hay signos, 1 representa una marcha débil o alterada, 2 indica paresia y 3 representa una extremidad completamente paralizada.
2. Asigne a un animal tetrapléjico que tenga parálisis completa una puntuación de 12 y asigne a la mortalidad una puntuación de 15.

8. Tinción de hematoxilina-eosina (H&E)

1. Tome el cerebro de ratón deshidratado e insértelo en parafina fundida. Deje que el bloque de parafina se enfríe y solidifique para su uso posterior.
   NOTA: El bloque de parafina debe estar completamente seco y frío para evitar daños en los tejidos.
2. Corta el bloque de parafina cerebral de ratón en portaobjetos de 5 μm de grosor. Coloque la sección de cerebro de ratón de parafina en un portaobjetos de vidrio y séquelo en un horno a 60 °C durante 3 h.
3. Sumerja los portaobjetos secuencialmente en la solución de xileno I durante 10 minutos, la solución de xileno II durante 10 minutos, el 100 % de alcohol I durante 3 minutos, el 100 % de alcohol II durante 3 minutos, el 95 % de alcohol durante 3 minutos, el 90 % de alcohol durante 3 minutos, el 80 % de alcohol durante 3 minutos, el 70 % de alcohol durante 3 minutos y el agua destilada durante 1 minuto.

9. Análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa (qPCR)

1. Después de perfundir a los ratones con PBS, retire la ChP de los ventrículos y extraiga el ARN con Trizol. Sintetiza el ADNc con el primer kit de síntesis de ADNc de hebras.
2. Realice análisis de qPCR utilizando la premezcla Ex Taq SYBR-green y un sistema de PCR en tiempo real. Utilice los siguientes cebadores A_2AR: adelante - GCCATCCCATTCGCCATCA; reverso - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA.

Eliminación de A2AR específica de ChP mediante inyección ICV de AAV2/5-shRNA o CRE-TAT
El papel de A2AR en la ChP como un potente regulador de la información neuronal en la patogénesis de EAE sigue sin estar claro. La reducción de la expresión de A2AR específica de ChP podría arrojar luz sobre los efectos reguladores de A2AR sobre el sistema inmune central en EAE y otras inflamaciones del sistema nervioso. En este estudio se utilizó la inyección de CRE-TAT por ICV para disminuir la expresión de A 2A R en la ChP de ratonesA 2AR flox/flox. Para garantizar la especificidad de ChP, primero inyectamos CRE-TAT en los ventrículos laterales de ratones Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9). Las imágenes indican que la fluorescencia espontánea de tdTomato estaba restringida al tejido ChP (Figura 2). De manera similar, el estudio administró la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) mejorada con AAV2/5-CMV-CMV-CMV2AR-shRNA-CMV en ratones C57BL/6 y encontró que la fluorescencia de EGFP se limitaba a la capa de células epiteliales de la ChP y no infectaba las células parenquimatosas circundantes cerca de los ventrículos laterales (Figura 3).

Inducción EAE con MOG35-55
Para inducir EAE estable, los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con una emulsión compuesta por MOG35-55 y CFA, seguida de una inyección intraperitoneal de TP en los días 0 y 2 después de la inmunización (Figura 4). Se utilizó la Escala de Síntomas Clínicos para evaluar diariamente las puntuaciones de EAE, en función del estado de la cola y las extremidades. El inicio de la EAE se definió como el primer día con una puntuación EAE ≥1, mientras que la duración entre el inicio y el pico de las puntuaciones de EAE se denominó etapa progresiva.

La reducción de A2A Respecífica de ChP alivia la patología EAE
Para investigar la implicación de la señal A2AR en la patología EAE, el estudio empleó un knockdown A2AR específico de ChP. El estudio eliminó específicamente A2AR en el ChP utilizando la inyección ICV de CRE-TAT o AAV2/5-A2AR-shRNA. A las 2 semanas después del derribo, EAE fue inducida por la inmunización MOG35-55. Los resultados mostraron que, en comparación con el grupo control, los ratones con A2AR knockdown desarrollaron una patología EAE más leve, como lo demuestran las puntuaciones más bajas y una menor infiltración de células inmunitarias en la médula espinal (Figura 5A, B, E, F). Además, se seleccionaron aleatoriamente cinco ratones inducidos por EAE de cada grupo en el día 20 después de la inmunización con MOG35-55. Después de la perfusión con PBS, las ChP se aislaron para la extracción de ARN y qPCR. El análisis de qPCR mostró que los niveles de ARNm de A 2A R estaban obviamente disminuidos en los grupos AAV2/5-shRNA (A2AR-Kd) y CRE-TAT, en comparación con cada control (Figura 5C,D).

Figura 1: Localización anatómica del lugar de inyección del ventrículo lateral. (A) Un diagrama esquemático que muestre el punto de inyección del virus. (B) El lugar de inyección del ventrículo lateral se encuentra 0,58 mm por debajo del bregma y 1,1 mm lateral a la sutura sagital, como indica el punto rojo. (C) Una imagen que muestre el sitio de inyección del virus en un ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Localización de la fluorescencia de tdTomato en el ChP. (A,B) Imagen representativa de ratones Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato tratados con inyección ICV de CRETAT. A las 2 semanas después, la autofluorescencia de tdTomato se localizó específicamente en el tejido ChP (n = 3/grupo). (C,D) Las imágenes fusionadas de la autofluorescencia tdTomato y DAPI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes representativas de ratones C57BL/6 tomadas 2 semanas después de la inyección de AAV2/5-scramble-EGFP o AAV2/5-shRNA-EGFP. (A,B) Las imágenes representativas de ratones inyectados con AAV2/5-scramble-EGFP (n = 3/grupo). (C,D) Las imágenes representativas de ratones inyectados con AAV2/5-shRNA-EGFP (n = 3/grupo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Inducción del modelo EAE. (A) En primer lugar, la emulsión de antígeno MOG se inyecta por vía subcutánea en cuatro lugares diferentes (cuello, espalda, caderas izquierda y derecha), que se indican con puntos rojos. (B) El TP se inyecta por vía intraperitoneal en el momento de la inmunización y se repite 2 días después. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: La reducción específica de ChP de A 2AR alivió la patología EAE. (A) La reducción específica de ChP de A 2A R en ratones A2AR flox/flox, lograda mediante la inyección de CRE-TAT en ICV, condujo a una disminución de las puntuaciones clínicas de EAE (n = 6-7/grupo). El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de RM de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak. (B) La reducción específica de ChP de A2AR en ratones de tipo salvaje (WT), lograda con la inyección de AAV2/5-shRNA en ICV, disminuyó las puntuaciones clínicas de EAE (n = 7-8/grupo). El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de RM de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak. (C,D) Resultados del análisis de qPCR de los niveles de ARNm de A2AR en tejido ChP (n = 5/grupo). El análisis estadístico se realizó mediante una prueba t no apareada. (E,F) Tinción de H&E. La infiltración atenuada de células inmunitarias en la médula espinal A2AR específica de ChP. La significación estadística se representa como ###p < 0,001, **p < 0,01 y ***p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores afirman que no tienen intereses financieros contrapuestos ni otras revelaciones que declarar.