Artículo de método

Detección de análogos de fentanilo mediante LC-TIMS-TOF MS/MS

DOI:

10.3791/65562

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8 de noviembre de 2024

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1Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Miami-Dade County Medical Examiner Department, 4Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

En este artículo

Resumen

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Un método para el cribado de análogos del fentanilo basado en su tiempo de retención, movilidad y patrón de fragmentación de espectrometría de masas.

Resumen

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El uso de fentanilo y la aparición de análogos del fentanilo en las últimas décadas se ha convertido en una preocupación cada vez mayor para la comunidad en general. El fentanilo y sus análogos son los principales contribuyentes a las sobredosis fatales y no fatales en los Estados Unidos. Los casos más recientes de sobredosis relacionadas con el fentanilo están relacionados con el fentanilo fabricado ilícitamente y su extrema potencia asociada. En el presente trabajo, describimos un protocolo analítico de alto rendimiento para el tamizaje de análogos del fentanilo. El uso de cromatografía líquida complementaria, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas en tándem permite la separación y asignación de cientos de análogos de fentanilo a partir de una sola muestra en un solo escaneo. El enfoque descrito aprovecha el reciente desarrollo de la adquisición dependiente de los datos y la adquisición independiente de los datos utilizando la acumulación paralela en la trampa de movilidad seguida de la fragmentación secuencial utilizando la disociación inducida por colisión. Los análogos del fentanilo se asignan con confianza en función de su tiempo de retención, movilidad y patrón de fragmentación de la EM.

Introducción

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El fentanilo y sus análogos son los principales contribuyentes a las sobredosis fatales y no fatales en los Estados Unidos 1,2. Los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) informaron que el número de muertes por sobredosis relacionadas con opioides sintéticos entre 2013 y 2021 fue de más de 258,000. Solo en 2021, más de 68,000 muertes por sobredosis podrían atribuirse a los opioides sintéticos, lo que representa un total del 82% de todas las muertes relacionadas con sobredosis en el país3. Desde 2013, se han identificado cientos de análogos del fentanilo, con diferente potencia4. Con la aparición de análogos de fentanilo fabricados ilícitamente, el opioide sintético de la lista II sigue siendo el opioide sintético más popular disponible en los Estados Unidos3. Según el Centro de Investigación y Educación en Ciencias Forenses (CFSRE), el principal análogo del fentanilo reportado en 2022 fue el fluorofentanilo, y ahora se están introduciendo opioides sintéticos adicionales no relacionados con el fentanilo en el suministro del mercado de drogas volátiles a un ritmo rápido5.

Debido al abrumador volumen de fentanilo y análogos relacionados con el fentanilo que circulan en el mercado de drogas, la DEA ha implementado un programa de perfiles de firmas de fentanilo titulado Operación Dragón de la Muerte, con el fin de rastrear la metodología utilizada para sintetizar estos compuestos con la esperanza de vincular las incautaciones de drogas a su origen6. En 2018, el 94% de las incautaciones de drogas fueron identificadas como sintetizadas por el método de Janssen, mientras que el 6% restante fueron sintetizadas con el método de Siegfried6. La principal diferencia entre los dos métodos es la presencia del análogo del fentanilo, el fentanilo bencilo, detectado como una impureza en el método de Janssen, mientras que la presencia de fentanilo despropionilo (4-ANPP), un metabolito/precursor del fentanilo, es una impureza detectada al sintetizar con el método de Siegfried7.

El uso de la cromatografía de gases y líquidos junto con la espectrometría de masas (GC-MS y LC-MS, respectivamente) para el cribado y la cuantificación dirigidos de opioides sintéticos se implementa regularmente en los laboratorios de toxicología. La GC-MS ha sido considerada el estándar de oro para la detección de drogas de abuso en muestras biológicas. El acceso a bibliotecas de espectros de masas disponibles públicamente8 y a la instrumentación comercializada como sistemas plug and play9 son algunas de las razones por las que la GC-MS ha seguido siendo una parte integral en los laboratorios, tanto para el cribado exhaustivo como para la cuantificación dirigida 9,10. Sin embargo, los métodos actuales de cuantificación de GC-MS en la literatura tienden a tener un alcance limitado de analitos11 y rápidamente se vuelven obsoletos y no aplicables a los casos actuales. Más importante aún, los límites de detección y cuantificación no son comparables con los métodos de LC-MS (< 1 ng/mL)12, lo que aumenta el potencial de resultados falsos negativos. Una de estas comparaciones entre GC-MS y LC-MS que analizó muestras postmortem, observó que de 134 casos identificados positivamente de carfentanilo, uno de los opioides sintéticos más potentes hasta la fecha, 104 de esos casos dieron negativo para carfentanilo utilizando GC-MS13. En los laboratorios de análisis de fármacos, el GC-MS se utiliza con mayor frecuencia y se puede modificar para los opioides sintéticos debido a la alta concentración de las muestras analizadas. Sin embargo, la GC-MS todavía se utiliza junto con técnicas adicionales como la espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR) y la microscopía electrónica de barrido (SEM) para la confirmación de estos compuestos14. La aplicación de GC-MS al análisis de muestras biológicas en toxicología forense requiere métodos de preparación de muestras que incluyen la extracción de estos compuestos mediante extracción líquido-líquido (LLE) o extracción en fase sólida (SPE)15. El LLE se puede realizar con una variedad de solventes, sin embargo, en un laboratorio de alta producción, el LLE puede no ser rentable u oportuno. El LLE consume grandes cantidades de disolventes, así como el volumen de muestra, mientras que la alternativa, el SPE, puede automatizarse y requiere un volumen mínimo de muestra16. Un estudio reciente de GC-MS informó de la separación de 20 análogos diferentes del fentanilo isomérico utilizando tres programas térmicos de GC separados17. Si bien la separación de referencia entre isómeros fue exitosa, la aplicabilidad de este método a los casos y flujos de trabajo forenses relevantes es limitada.

La LC-MS ha ganado popularidad en las pruebas forenses, especialmente debido a las limitaciones de la GC-MS cuando se trata de compuestos no volátiles y sensibles al calor18,19. El cribado de LC-MS que utiliza triples cuadrupolos (QQQ) e instrumentación de trampas iónicas ha sido exitoso en la detección de opioides sintéticos a bajas concentraciones (<1 ng/mL)12,20,21,22,23,24. Por lo general, estos métodos de LC-MS se utilizan como métodos de confirmación secundarios para complementar los resultados del inmunoensayo y/o GC-MS. En 2017, Shoff et al. en el laboratorio de toxicología del departamento médico forense del condado de Miami-Dade (MDME) desarrollaron un método de detección integral para 44 compuestos relacionados con opioides mediante cromatografía líquida de ultra alta presión (UHPLC)-trampa de iones MSn 13. De manera similar a los métodos de MRM dirigidos, este método de trampa de iones utilizó una lista de precursores programada (SPL) que contiene tiempos de retención, iones objetivo precursores, así como iones hijos primarios para la fragmentación espectral de MS3 cuando fue posible. Lo que separa este método de cribado de los métodos desarrollados en cuadrupolos triples y trampas de iones cuadrupolares lineales es el detalle adicional proporcionado en los datos espectrales. Lo que este método de cribado no puede proporcionar es el análisis cuantitativo, que rara vez se desarrolla en la instrumentación de trampas iónicas, así como la identificación de incógnitas13. Los métodos LC-QQQ para opioides sintéticos pueden examinar y cuantificar simultáneamente una lista de objetivos predefinida. El uso de transiciones de monitoreo de reacciones múltiples (MRM) para la identificación y cuantificación de compuestos es una técnica confiable de adquisición de datos y es la técnica más común utilizada en la literatura para la detección de opioides sintéticos12,20. Los rangos lineales reportados para la cuantificación de una variedad de opioides sintéticos abarcan entre 0,01 y 100 ng/mL, con opioides sintéticos más potentes, como el carfentanilo, detectados en el rango sub-ng/mL1 1,24,25,26,27.

La separación de opioides isoméricos sintéticos se ha abordado en los métodos de LC-MS. Uno de estos métodos separó 174 análogos isoméricos de fentanilo en un tiempo de ejecución de 16 minutos utilizando una columna de bifenilo28. Además, las fluctuaciones en los parámetros dependientes de la LC, como la eficiencia de la columna, el pH de la fase móvil y los cambios de presión, crean cambios en el tiempo de retención que deben tenerse en cuenta en ensayos específicos con un seguimiento constante y ventanas de recolección más grandes (>0,4 min), lo que puede dar lugar a una posible superposición de estos isómeros una vez resueltos. Se han explorado técnicas cromatográficas adicionales para la separación de isómeros, incluido el uso de cromatografía líquida bidimensional (2D-LC)29; Y si bien esta técnica tiene la capacidad de proporcionar una separación ortogonal de compuestos, las desventajas superan las ventajas, incluidos los tiempos de ejecución excesivos, el costo, la dificultad en el desarrollo del método y la utilidad en comparación con las separaciones alternativas30.

La espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) es cada vez más fiable para la identificación de opioides sintéticos. Varias empresas de instrumentación han comercializado métodos dirigidos desarrollados con el propósito de identificar una amplia gama de opioides sintéticos en matrices biológicas complejas 19,28,31. Estos métodos, a diferencia de los métodos discutidos anteriormente, pueden almacenar datos analíticos para análisis retroactivos. Por lo tanto, los especímenes que se analizaron previamente con resultados indeterminados pueden ser revisados posteriormente para el descubrimiento de compuestos recién identificados. Lo que separa a HRMS de QQQ es la identificación precisa de las masas. Si bien ambas técnicas de MS pueden cuantificar con precisión a bajas concentraciones, se ha demostrado que el HRMS es más efectivo para el cribado inicial y el descubrimiento de compuestos desconocidos 32,33,34. El HRMS, específicamente con analizadores de MS de tiempo de vuelo (TOF), ha estado a la vanguardia del descubrimiento de NPS, lo que permite a los laboratorios de pruebas forenses proporcionar datos sensibles al tiempo sobre nuevos compuestos tanto a las fuerzas del orden como a la comunidad científica para escalar la propagación de algunos de estos compuestos, al tiempo que aumenta la concienciación y la educación33. El uso de TOF para la detección de drogas de abuso se ha vuelto extremadamente completo, con métodos que contienen más de 600 compuestos separados dentro de un programa cromatográfico de 10 minutos. Estudios previos han reportado las ventajas de la espectroscopia de movilidad de iones atrapados (TIMS) acoplada a TOF para la detección y separación de opioides isoméricos35.

Aprovechando la ortogonalidad entre la cromatografía líquida, la espectrometría de movilidad de iones atrapados y la espectrometría de masas, el método presentado proporciona una amplia caracterización de los análogos del fentanilo en función del tiempo de retención, el patrón isotópico, la movilidad y el patrón de fragmentación.

Protocolo

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1. Preparación de la muestra

  1. Guarde el kit de detección de análogos de fentanilo a -20 °C una vez que se hayan recibido. Vuelva a suspender cada muestra a una concentración final de 400 μg/mL mediante la adición de 500 μL de metanol puro de grado LC/MS.
  2. Mezclar con una batidora de placas o vórtice a 400 rpm durante 1 h o vórtice a velocidad media durante 15 min. Después de la resuspensión, almacene los viales a -20 °C.
  3. Diluya cada patrón hasta una concentración final de 1 ng/mL utilizando metanol puro de grado LC/MS.
  4. Agrupe los patrones en grupos, de modo que cada grupo no contenga ningún patrón isomérico. Consulte la Tabla complementaria 1 para ver el desglose de los 14 grupos de estándares de fentanilo.

2. Preparación de fases móviles de HPLC

  1. Prepare la fase móvil A (MPA) utilizando 5 mM/L de formiato de amonio (NH4, HCO2) enH2O con ácido fórmico al 0,05% (85%).
    1. Pesar 0,078 g de NH4HCO2, verter en un matraz aforado de 250 ml y llenar con agua hasta aproximadamente 2/3rd. Revuelva para mezclar bien.
    2. Una vez completamente disuelto, añadir 0,125 mL de ácido fórmico (85%). Llene con agua hasta la línea de llenado (250 mL) y mezcle.
  2. Prepare la fase móvil B (MPB) utilizando ácido fórmico al 0,05% en una mezcla de metanol acetonitrilo 1:1.
    1. Vierta 125 mL de acetonitrilo en un matraz aforado y agregue metanol hasta que llegue a la línea de llenado.
    2. Revuelva para mezclar bien. Añadir 0,125 mL de ácido fórmico al 0,05% al matraz y mezclar para homogeneizar.

3. Desarrollo del método HPLC

  1. Abra el software LC en la pantalla de inicio. En la tabla de ejemplo, situada en el centro de la ventana, cree un nuevo protocolo.
    1. Anote la columna del vial con la ubicación de la muestra. Anote la columna de ID de ejemplo con el formato YYYYMMDD_NAME (descriptor representativo). Anote la columna de volumen con el volumen de inyección deseado (15 μL).
  2. Anote la columna de ruta de datos con la ubicación en la que se guardarán los datos.
  3. Entrada del método HPLC
    1. Seleccione Nuevo en la barra de la tabla de ejemplo situada en el centro de la pantalla. En el método de separación, seleccione la flecha desplegable y haga clic en Nuevo método en la ventana emergente.
    2. Aparecerá una nueva ventana etiquetada como método de separación, aquí edite el tiempo de adquisición o el método del sistema del marco de control de instrumentos (ICF).
    3. Haga doble clic en el botón Editar método del sistema ICF para abrir la ventana emergente para editar el gradiente binario, como se ve en la Figura 1.
    4. En la pestaña de gradiente binario, una representación visual del gradiente está a la izquierda y el desglose del gradiente está a la derecha, establezca las marcas de tiempo, el caudal y las concentraciones de MPA y MPB.
    5. Asegúrese de que el tiempo de parada esté configurado en 18 minutos, el caudal en 0,400 mL/min y el límite de presión mínimo y máximo en 0 psi y 6000 psi.
    6. Establezca las concentraciones de marca de tiempo de la siguiente manera:
      A los 0,00 min, establezca la concentración B en 20,0.
      A la 1,50 min, ajuste la concentración B a 25,0.
      A los 3.00 min, ajuste la concentración B a 27.0.
      A las 6.00 min, establezca la concentración B en 27.0.
      A los 6,50 min, ajuste la concentración B a 30,0.
      A las 7.00 min, ajuste la concentración B a 95.0.
      A las 16.00 min, ajuste la concentración B a 95.0.
      A las 16.50 min, establezca la concentración B en 20.0.

4. Inicialización de la HPLC

  1. En la sección de columna de HPLC, inserte la columna LC (columna de HPLC monolítica C18 de 100 mm x 4,6 mm) y los protectores de columna (columna de protección de 5 mm x 4,6 mm). Preste atención a la presión mínima y máxima de la columna.
  2. Ejecute un espacio en blanco de muestra (la misma solución tampón) para comprobar si hay fugas y crear una línea de base. Busca fugas. Las fugas podían observarse por las fluctuaciones de presión de la columna. Si hay fugas, determine de dónde podrían provenir y apriete las conexiones.
  3. Ejecute una muestra en blanco (la misma solución tampón) utilizando el programa LC deseado para preacondicionar la columna.

5. Desarrollo del método TIMSTOF MS/MS

  1. Abra la aplicación timsControl. En el lado izquierdo de la ventana están las configuraciones de MS y TIMS.
    1. En la configuración de MS, establezca el inicio y el final del escaneo en 50 m/z y 1800 m/z, respectivamente. Seleccione el modo positivo para la polaridad de iones y seleccione la fragmentación en serie de acumulación paralela para el modo de escaneo.
    2. En Configuración de TIMS, establezca el modo en personalizado, el inicio de 1/K0 en 0,40 Vs/cm2, el final de 1/K0 en 1,85 Vs/cm2, el tiempo de rampa establecido en 150,0 ms y el promedio de MS establecido en 1.
  2. En la selección inferior de pestañas en Origen, realice los siguientes cambios en los dos cuadros de configuración.
    1. En la fuente, ajuste el desplazamiento de la placa final a 500 V, el capilar a 4500 V, el nebulizador a 3,0 bar, el gas seco a 10,0 L/min y la temperatura seca a 200 °C.
    2. En la configuración de la bomba de jeringa, asegúrese de que la jeringa sea Hamilton 1 mL, que esté activa y que el caudal esté configurado en 80,0 μL/h.
  3. En la pestaña Optimizar, realice los siguientes cambios en las pestañas de configuración para General, Procesamiento y TIMS.
    1. En la pestaña de configuración general, configure las siguientes secciones: transferencia, celda de colisión, cuadrupolo, enfoque previo a TOF y detección.
      1. En la configuración de transferencia, establezca la deflexión 1 delta en 70,0 V, el embudo 1 RF en 341,0 Vpp, la energía CID en 0,0 eV, el embudo 2 RF en 300,0 Vpp, la RF multipolar en 300,0 Vpp.
      2. En la configuración de la celda de colisión, asegúrese de que la energía de colisión esté establecida en 6,0 eV y la RF de colisión en 1200,0 Vpp.
      3. En la configuración del cuadrupolo, asegúrese de que la energía iónica esté configurada en 6,0 eV y la masa baja en 250,00 m/z.
      4. En la configuración de TOF previo al foco, establezca el tiempo de transferencia en 75,0 μs y el almacenamiento previo al pulso en 5,0 μs.
    2. En la pestaña Configuración de procesamiento, configure las siguientes secciones: detección de picos de espectros de masas y detección de picos de movilidad.
      1. En la configuración de picos de espectros de masas, anule la selección de la suma de intensidades (área) y establezca el umbral absoluto en 667.
    3. En la pestaña TIMS, configure las siguientes secciones: desplazamientos, control de cambio de iones y parámetros avanzados.
      1. En la configuración de compensaciones, establezca Δt1 en -20,0 V, Δt2 en -100,0 V, Δt3 en 40,0 V, Δt4 en 80,0 V, Δt5 en 0,0 V, Δt6 en 120,0 y la celda de colisión en 250,0 V.
      2. En la configuración de control de carga de iones, haga clic en la casilla para habilitar y establecer la intensidad objetivo en 5,00 M.
      3. En los parámetros avanzados, habilite la acumulación de bloqueo para el rango de movilidad.
  4. En la pestaña MS/MS, establezca el modo de escaneo en acumulación paralela-fragmentación en serie y configure las siguientes secciones: iones precursores, programación, exclusión activa, configuración de energía de colisión, configuración de ancho de aislamiento y paso paso TIMS.
    1. En Iones precursores, establezca el número de rampas de fragmentación en serie de acumulación en paralelo en 8, el mínimo de carga en 1 y el máximo de carga en 5.
    2. En Configuración de programación, habilite las repeticiones precursoras. En Exclusión activa, marque la casilla para habilitar y establecer la versión en 0,40 min después.
    3. No ajuste la configuración de energía de colisión y la configuración de ancho de aislamiento. Haga clic en el cuadro Paso a paso de TIMS para habilitarlo.

6. Movilidad y calibración de masas

  1. Realice la calibración para los dominios m/z y de movilidad. En la configuración de calibración m/z, seleccione uno de los perfiles de mezcla de afinación precargados en el cuadro de lista de referencias que aparece en el menú desplegable.
  2. Para calibrar, cargue la jeringa para el TOF con una solución de mezcla de afinación. En el lado derecho de la ventana, use la configuración titulada modo de calibración para los diversos tipos de calibración que se establecerán para lograr la puntuación más alta.
  3. Asegúrese de que la puntuación esté lo más cerca posible del 100%. Cambia entre lineal, cuadrático y cuadrático mejorado para lograr la mejor puntuación.
  4. Calibrar para la movilidad siguiendo los pasos 6.1-6.3 utilizados para calibrar m/z.
  5. Una vez calibrado, guarde el método MS seleccionando la pestaña Método en la barra superior. En el menú desplegable, seleccione Guardar como para generar un nuevo archivo de método MS.

7. Creación de un método de fragmentación en serie de adquisición independiente de datos (dia)

  1. Una vez que se ha recopilado un conjunto de datos en fragmentación en serie de acumulación paralela de adquisición dependiente de datos (dda), ejecute los experimentos en dia. Abra la aplicación de software de movilidad iónica y cargue el método dda guardado en el paso 6.5.
  2. Deje todos los ajustes iguales para la configuración de MS, cámbielo de acumulación paralela-fragmentación en serie a fragmentación en dia-acumulación paralela-en serie.
  3. En la parte inferior del panel, seleccione la pestaña MSMS y luego haga clic en Editor de ventanas para abrir la ventana emergente dia que se muestra en la Figura 2.
  4. Cargue el conjunto de datos dda guardado anteriormente (archivo .m) usando el botón abrir análisis ubicado en la parte superior de la ventana emergente.
  5. Aparece un mapa de calor en la parte inferior izquierda que muestra ventanas con un polígono de ventanas que se extiende en diagonal a través del gráfico. Haga clic y arrastre para cambiar el tamaño del polígono para que se ajuste a los datos en el mapa de calor (las esquinas se pueden seleccionar haciendo doble clic en las líneas laterales, aparecerá un punto que se puede arrastrar y cambiar de tamaño).
  6. A la derecha de las ventanas se encuentra la configuración de la ventana. Establezca el ancho de la masa (50 es ir a) y establezca la superposición horizontal, ambos en Da.
  7. Establezca el número de ventanas de movilidad por ancho de masa y la superposición vertical.
  8. Haga clic en Calcular ventanas en la parte inferior derecha de la ventana emergente para ver las ventanas que se muestran con la nueva configuración. Una vez que sea adecuado, haga clic en Aplicar ventanas dia-PASEF al método. Esto cerrará la ventana emergente y la devolverá a la pantalla de inicio.

8. Procesamiento de datos TOF de movilidad iónica de HPLC

  1. Abra el software de análisis de datos. En la esquina superior izquierda, haga clic en la pestaña Archivo y seleccione Abrir en el menú desplegable. En la ventana de nuevos archivos, seleccione los archivos de su elección y haga clic en Abrir.
  2. Compruebe la calibración. Haga clic con el botón derecho en el nombre del archivo debajo del cuadro de análisis y seleccione Propiedades. Aparecerá una ventana etiquetada como archivo name_analysis propiedades. Seleccione Estado de calibración.
  3. En el cuadro desplegable, seleccione Calibración de instrumento para el espectrómetro de masas. Confirme que el error no sea mayor que 1 μg/mL. Seleccione Calibración de movilidad inicial y confirme que el error no sea superior a 1 μg/mL.
  4. Prepare un cromatograma en el software de análisis de datos como se describe a continuación.
    1. Haga clic con el botón derecho en Cromatograma debajo del nombre del archivo, seleccione Editar cromatograma. En tipo, haga clic en el cuadro desplegable y seleccione Cromatograma iónico extraído.
    2. En filtro, seleccione Todos los MS y con el modo de escaneo seleccione Todos. Esto es para ver los picos de la molécula de interés en lugar de solo sus fragmentos.
    3. Debajo de esto, busque las dos opciones de filtro para la selección de moléculas: masas o fórmula resaltadas en azul.
    4. Si utilizas masas para extraer un ion, inserta la m/z teórica de la molécula de interés. Para este caso, seleccione (masa para obtener un resultado representativo) m/z.
    5. Si utiliza una fórmula para extraer un ion, inserte la fórmula de la molécula, así como las formas de iones de interés para el cromatograma. En este caso, seleccione el ion protonada, [M+H]+.
    6. Establezca la polaridad en modo positivo.
  5. Espectro de masas
    1. Haga clic con el botón derecho en la línea de base del pico del compuesto y arrastre hasta el otro borde del pico. Esto creará un espectro masivo de fragmentos dentro de ese tiempo de retención.
  6. Generación de Mobilogram
    1. Haga clic con el botón derecho en la pestaña de la izquierda titulada mobilograma y seleccione Editar mobilograma. Aparecerá una ventana titulada editar trazos de mobilograma. Siga los pasos 8.4.2-8.4.7 para editar el cromatograma.
    2. En la entrada de tiempo de retención, agregue el intervalo de tiempo de retención del pico de interés.
    3. Una vez seleccionados los parámetros, haga clic en Agregar seguido de Aceptar en la parte superior derecha de la ventana de edición de trazas de mobilograma.
    4. Después de un corto período de tiempo, el software procesará las selecciones deseadas y generará un cromatograma. Repita los pasos 8.6.1-8.6.3 para todos los iones de la mezcla.
    5. Generación de los espectros compuestos
      1. En la parte inferior de la ventana de vista de espectro, seleccione Profile MS y Fragment MS. Esto permitirá incluir iones de escaneo completo y PASEF.
      2. En la vista de espectro, haga clic con el botón derecho y seleccione Copiar espectros compuestos. Con los datos de espectro que aparecen a la derecha, encuentre más información sobre el compuesto, como la resolución, la capacidad de resolución, la intensidad y la relación señal/ruido (S/N).
    6. Procesamiento de datos
      1. Para procesar los datos, integre manualmente el cromatograma y los picos de movilidad para obtener información importante sobre la molécula de interés.
      2. Haga clic con el botón derecho en Buscar y seleccione Integrar solo cromatograma o mobilograma. Haga clic con el botón izquierdo y arrastre para resaltar el pico deseado. Se mostrará la información que incluye el tiempo de retención, el área, la relación S/N y la movilidad.

Resultados

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El kit de detección de análogos de fentanilo de 250 estándares análogos se dividió en 14 grupos: 12 grupos de 17 análogos y 2 grupos de 16 análogos, para evitar interferencias m/z. Cada análogo se caracteriza además por su m/z, tiempo de retención (RT), movilidad (K) y patrón de fragmentación MS/MS.

En la Figura 3 y la Figura 4 se muestran ejemplos de separaciones isoméricas para la fórmula química C22H28N2O2 y C21H28N2OS, respectivamente.

El kit de detección de análogos de fentanilo contiene cuatro isómeros con la fórmula química C22H28N2O2 (consulte la figura 3). La inspección de la Figura 4 muestra el cromatograma iónico extraído [M+H]+ , los mobilogramas, el patrón isotópico y el patrón de fragmentación MS/MS. El metoxiacetil fentanilo y el carbamato de fentanilo se separan bien en los dominios LC y de movilidad del para-metoxiacetil fentanilo y el b-hidroxi fentanilo. Sin embargo, se logra una clara separación entre el para-metoxiacetil fentanilo y el B-hidroxil fentanilo gracias a sus patrones de fragmentación.

El kit de detección de análogos de fentanilo contiene tres isómeros con la fórmula química C21H28N2OS. La inspección de la Figura 4 muestra el cromatograma iónico extraído [M+H]+ , los mobilogramas, el patrón isotópico y el patrón de fragmentación MS/MS. El a-metiltiofentanilo y el (±)-trans-3-metiltiofentanilo se separan en el dominio LC, pero no en el dominio de movilidad. Además, el (±)-trans-3-metil tiofentanilo y el (±)-cis-3-metiltiofentanilo se separan en el dominio de movilidad y no en el dominio LC. Esto demuestra la complementariedad de la LC y la separación de la movilidad, mejorando la identificación de las especies isoméricas a través de la ortogonalidad de dominios. La Figura 4D resume este resultado proporcionado por la LC y la movilidad.

figure-results-1
Figura 1: Rampa de gradiente en el software. Gradientes de los puntos de tiempo aplicados durante la separación en función del porcentaje de concentración de B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Configuración de la ventana dia-PASEF. En los métodos de MS dia-PASEF, los ajustes de MS/MS son únicos. El gráfico de la izquierda muestra los polígonos de la ventana ajustados a partir de los datos registrados en el método dda-PASEF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Cromatograma iónico extraído típico, mobilograma extraído y proyección de MS amplificada para opioides isoméricos. (A) Estructuras de metoxiacetil fentanilo, para-metoxiacetil fentanilo, β-hidroxi fentanilo, carbamato de fentanilo y los respectivos (B) tiempo de retención típico, (C) movilidad típica, (D) señal isomérica, (E) fragmentos principales y (F) representación de la fragmentación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Cromatogramas iónicos típicos extraídos y mobilogramas extraídos para opioides isoméricos. (A) Estructuras de α-metil tiofentanilo, (±)-trans-3-metil tiofentanilo y (±)-cis-3-metil tiofentanilo. Para los isómeros respectivos (B) tiempo de retención típico, (C) movilidad típica, (D) ortogonalidad entre el tiempo de retención y la movilidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla complementaria 1: Grupos de mezcla. Esta tabla describe qué opioides se encuentran en cada una de las 14 mezclas creadas para este procedimiento. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

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La separación analítica de muestras biológicas que contienen un alto contenido de isoméricos puede ser un desafío analítico. En este trabajo, el método descrito tiene como objetivo caracterizar 29 conjuntos de isómeros, para un total de 185 análogos de un kit estándar de 250 opioides. Durante la preparación del grupo de prueba, es importante asegurarse de que no haya dos análogos con m/z que no puedan distinguirse experimentalmente. Los datos descritos aquí utilizan estándares que no provienen de una matriz basada en humanos, si este método se va a utilizar en un experimento de campo; Son necesarios ensayos adicionales que utilicen la matriz de interés para garantizar la aplicabilidad del método. La matriz podría hacer que los analitos se ionicen de manera diferente a como lo hacen en un experimento sin matriz, por lo que es imperativo determinar qué formas de iones prevalentes se observarán. En el análisis, la identificación se basa en los patrones isotópicos de las formas más abundantes (por ejemplo, [M+H]+1 y [M+Na]+1).

La elección del programa LC es crítica en los casos en que los isómeros no están separados en el dominio de la movilidad. La disminución de la pendiente del gradiente puede aumentar la especificidad del método al aumentar la diferencia entre los picos cromatográficos.

Durante el análisis de datos, es importante que se ignoren las señales no relevantes a la hora de determinar el tiempo de retención y la movilidad. Las ventajas de HRMS permiten ventanas m/z estrechas (resolución de masa típica de ~50.000) con filtrado de movilidad adicional, reduciendo así el ruido químico.

El método descrito aquí proporciona una biblioteca de referencia para la detección de análogos de fentanilo a partir de una muestra desconocida. Los patrones de fragmentación RT, K, isotópicos y MS notificados se utilizan como calificadores durante el procesamiento de datos y la asignación desconocida. En comparación con el análisis RMM LC-QQQ tradicional, si bien se pueden lograr LOD similares 13,19,27, la ventaja única es la detección de opioides alternativos no incluidos en la base de datos generada con el kit FID. Cada nuevo opioide requerirá el análisis utilizando un estándar sintético para su validación final.

Divulgaciones

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Matthew Willetts y Melvin A. Park son empleados de Bruker Daltonics Inc, el fabricante del instrumento comercial timsTOF Pro2. Todos los demás autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

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El autor desea agradecer el apoyo inicial del Dr. César Ramírez durante el desarrollo inicial del método.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Formiato de amonio para HPLCFluka17843-50G
Eppendorf  Microcentrífuga Snap-Cap Safe-Lock TubesFisher05-402-25
ESI-L Mezcla de ajuste de baja concentraciónAgilentG1969-85000
Kit de detección de análogos de fentanilo (FAS) Cayman Chemical9003237, 9003286, 9003380, 9003381kit de 250 opioides estéticos, 210 análogos del fentanilo, divididos en un kit y versiones de panel emergente 1-4
Ácido fórmico Optima LC/MSFisherA117-50
Columna de protección de ónix (5 x 4,6 mm) PhenomenexCHO-7649columna de protección para columnas C18
Ónix monolítico C18 Columna HPLC (100 x 4,6 mm)PhenomenexCHO-7643fase reversa C18 Columna LC
Acetonitrilo de grado Optima FisherA996-4
Metanol de grado OptimaFisherA454-4
Agua de grado OptimaFisherW7-4
PipetaFisher05-719-510kit de 1-10 y micro; L, 10-100 y micro; L, y 100-1000 y micro; Pipeta
L Puntas de pipeta 10µ LFisher94060100
Puntas de pipeta 1000µ LFisher94056710
Puntas de pipeta 200µ LFisher94060310
Mezclador de placasIKA MS 3 D S1IKA MS 3 digtital
Prominence LC-20 CE cromatógrafo líquido ultrarrápidoShimadzu, Japónequipado con DGU-20A5, LC-20AD, SIL-20AC, CTO-20A, SPD-M20A, CBM-20A, SPD-20A
timsTOF ProBruker Daltonics Inc., Billerica, MAtimsTOF instrumento con PASEF 

Referencias

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