Las células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo (AdMSC) tienen potentes propiedades inmunomoduladoras útiles para tratar enfermedades asociadas con la inflamación. Demostramos cómo aislar y cultivar AdMSCs murinas y glía mixta primaria, estimular AdMSCs para que regulen al alza los genes antiinflamatorios y los factores de crecimiento, evaluar la migración de AdMSCs y co-cultivar AdMSCs con glia primaria infectada con priones mixtos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo cocultivadas con glía mixta primaria para reducir la inflamación inducida por priones
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células estromales mesenquimales (MSC) son potentes reguladores de la inflamación a través de la producción de citocinas antiinflamatorias, quimiocinas y factores de crecimiento. Estas células muestran la capacidad de regular la neuroinflamación en el contexto de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad priónica y otros trastornos del plegamiento incorrecto de proteínas. Las enfermedades priónicas pueden ser esporádicas, adquiridas o genéticas; Pueden ser el resultado del mal plegamiento y la agregación de la proteína priónica en el cerebro. Estas enfermedades son invariablemente mortales, sin tratamientos disponibles.
Uno de los primeros signos de la enfermedad es la activación de los astrocitos y la microglía y la inflamación asociada, que se produce antes de la agregación de priones detectable y la pérdida neuronal; por lo tanto, las propiedades antiinflamatorias y reguladoras de las MSC se pueden aprovechar para tratar la astrogliosis en la enfermedad priónica. Recientemente, demostramos que las MSC derivadas del tejido adiposo (AdMSC) cocultivadas con células BV2 o glía mixta primaria reducen la inflamación inducida por priones a través de la señalización paracrina. En este artículo se describe un tratamiento fiable que utiliza AdMSCs estimuladas para disminuir la inflamación inducida por priones.
Una población heterocigota de AdMSCs puede aislarse fácilmente del tejido adiposo murino y expandirse en cultivo. La estimulación de estas células con citoquinas inflamatorias mejora su capacidad para migrar hacia el homogeneizado del cerebro infectado por priones y producir moduladores antiinflamatorios en respuesta. Juntas, estas técnicas se pueden utilizar para investigar el potencial terapéutico de las MSC en la infección por priones y se pueden adaptar para otras enfermedades neuroinflamatorias y de plegamiento incorrecto de proteínas.
Introducción
La inflamación glial desempeña un papel clave en una variedad de enfermedades neurodegenerativas, como el Parkinson, el Alzheimer y la enfermedad priónica. Aunque la agregación anormal de proteínas se atribuye a gran parte de la patogénesis de la enfermedad y la neurodegeneración, las células gliales también desempeñan un papel en la exacerbación de esta 1,2,3. Por lo tanto, dirigirse a la inflamación inducida por la glía es un enfoque terapéutico prometedor. En la enfermedad priónica, la proteína priónica celular (PrPC) se pliega mal a la proteína priónica asociad....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Los ratones fueron criados y mantenidos en el Laboratorio de Recursos Animales del Estado de Colorado, acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Lab Animal Care International, de acuerdo con el protocolo # 1138, aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Colorado.
1. Aislar e infectar glía cortical primaria mixta con priones
- Para aislar glía mixta primaria que contiene astrocitos y microglía, obtenga crías de ratón C57Bl/6 de cero a dos días de edad.
NOTA: Este protocolo es una adaptación de los protocolos anteriores 1....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La estimulación de AdMSCs con TNFα o interferón-gamma (IFNγ) durante 24 h induce cambios en la expresión de moléculas antiinflamatorias y factores de crecimiento. El tratamiento de las AdMSC con TNFα o interferón-gamma (IFNγ) aumenta el ARNm del gen 6 (TSG-6) estimulado por TNF, mientras que el TNFα, pero no el IFNγ, provoca un aumento del ARNm del factor de crecimiento transformante beta-1 (TGFβ-1). La estimulación con TNFα o IFNγ induce un aumento en el ARNm del factor de crecimiento endotelial vascul.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Aquí demostramos un protocolo fiable y relativamente barato para evaluar los efectos de las células estromales mesenquimales derivadas del tejido adiposo (AdMSCs) en la disminución de la inflamación inducida por priones en un modelo de células gliales. Las AdMSC se pueden aislar y expandir fácilmente en cultivo para su uso en tan solo 1 semana. Este protocolo produce consistentemente una población heteróloga de células que expresan marcadores consistentes con los de las células estromales mesenquimales por inmunofluoresc.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Lab Animal Resources por su cría de animales. Nuestras fuentes de financiación para este manuscrito incluyen el Fondo Boettcher, el Fondo Murphy Turner, la Facultad de Medicina Veterinaria de CSU y el Consejo de Investigación de la Facultad de Ciencias Biomédicas. Las figuras 2A, 2C y 3A se crearon con BioRender.com.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,25% Tripsina | Cytiva | SH30042.01 | |
| pipetas serológicas de 5 mL | Celltreat | 229005B | |
| Placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos | Celltreat | 229106 | |
| placas de cultivo celular de 10 cm | Peak Serum | PS-4002 | |
| pipetas serológicas de 10 ml | Celltreat | 229210 | |
| tubos cónicos de | 15 mLCelltreat | 667015B | |
| 50 mL tubos cónicos | Celltreat | 667050B | |
| BV2 línea celular de microglía | AcceGen Biotech | ABC-TC212S | |
| células | Biologix Research Company | 70-2180 | |
| Violeta cristalino | Microscopía electrónica Ciencias | 12785 | |
| Dispasa | Thermo Scientific | 17105041 | |
| DMEM/F12 | Caisson Labs | DFL14-500ML | |
| DNase-I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| Aminoácidos esenciales | Thermo Scientific | 11130051 | |
| Etanol (100%) | EMD Millipore | EX0276-1 | |
| Suero fetal bovino (calor inactivado) | Peak Serum | PS-FB4 | Se puede comprar como calor inactivado o inactivado en el laboratorio |
| Formaldehído | EMD Millipore | 1.04003.1000 | |
| Vidrio 10 mL pipeta serológica | Corning | 7077-10N | |
| Hank' s Balances Solución salina | Sigma Aldrich | H8264-500ML | |
| Hemocitómetro/Cámara Neubauer | Daigger | HU-3100 | |
| DMEM de alta glucosa | Cytiva | SH30022.01 | |
| DMEM de baja glucosa que contiene L-glutamina | Cytiva | SH30021.01 | |
| MEM/EBSS | Cytiva | SH30024. FS | |
| no esenciales | Sigma-Aldrich | M7145-100M | |
| Paraformaldehído (16%) | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Penicilina/estreptomicina/neomicina | Sigma-Aldrich | P4083-100ML | |
| Solución salina tamponada con fosfato | Cytiva | SH30256.01 | |
| Proteína IFN-gamma recombinante de ratón | R& D Systems | 485-MI | |
| Ratón Recombinante TNF-alfa (aa 80-235) Proteína, CF | R& D Systems | 410-MT | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Recubrir el interior de las pipetas de vidrio aspirando hacia arriba y hacia abajo dos veces en Sigmacote y dejando secar completamente. Envolver en papel de aluminio y pipetas de autoclave 24 h después. |
| Stemxyme | Worthington Biochemical Corporation | LS004106 | Mezcla de colagenasa/dispasa |
| Hisopo de algodón estéril envuelto individualmente | Puritan Medical | 25-8061WC | |
| Insertos de cultivo de tejidos Thincert, 24 pocillos, tamaño de poro = 8 y micro; m | Greiner Bio-One | 662638 | |
| Thincert Insertos de cultivo de tejidos, 6 pocillos, tamaño de poro = 0,4 y micro; m | Greiner Bio-One | 657641 |
Referencias
- Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
- Smith, H. L., et al. Astrocyte unfolded protein response induces a specific reactivity state t....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
