Ensayo de tapón de gel de matriz in vivo modificado para estudios de angiogénesis

Resumen

El método aquí presentado puede evaluar el efecto de los reactivos sobre la angiogénesis o la permeabilidad vascular in vivo sin tinción. El método utiliza la inyección de dextrano-FITC a través de la vena de la cola para visualizar los neovasos o la fuga vascular.

Resumen

Se han desarrollado varios modelos para investigar la angiogénesis in vivo. Sin embargo, la mayoría de estos modelos son complejos y costosos, requieren equipos especializados o son difíciles de realizar para su posterior análisis cuantitativo. En este trabajo se presenta un ensayo de tapón de gel de matriz modificada para evaluar la angiogénesis in vivo. En este protocolo, las células vasculares se mezclaron con gel de matriz en presencia o ausencia de reactivos proangiogénicos o antiangiogénicos, y luego se inyectaron por vía subcutánea en la espalda de los ratones receptores. Después de 7 días, se inyecta solución salina tampón fosfato que contiene dextrano-FITC a través de la vena de la cola y se hace circular en los vasos durante 30 min. Los tapones de gel de matriz se recogen y se incrustan con gel de inclusión de tejido, luego se cortan secciones de 12 μm para la detección de fluorescencia sin tinción. En este ensayo, el dextrano-FITC con alto peso molecular (~150.000 Da) se puede utilizar para indicar los vasos funcionales para detectar su longitud, mientras que el dextrano-FITC con bajo peso molecular (~4.400 Da) se puede utilizar para indicar la permeabilidad de los neovasos. En conclusión, este protocolo puede proporcionar un método fiable y conveniente para el estudio cuantitativo de la angiogénesis in vivo.

Introducción

La angiogénesis, el proceso de formación de neovasos a partir de vasos preexistentes, desempeña un papel fundamental en muchos procesos fisiológicos y patológicos, como el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, la aterosclerosis, el desarrollo tumoral, etc.1,2,3,4,5. Este proceso dinámico involucra varias etapas, incluyendo la degradación de la matriz, la proliferación de células vasculares, la migración y autoorganización para formar estructuras tubulares y la estabilización de los neovasos

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Médica de Wenzhou (XMSQ2021-0057, 19 de julio de 2021). Todos los reactivos y consumibles se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Preparación del medio de cultivo

1. Medio de cultivo 10x M199: Disolver el polvo de M199 a una concentración de 10x con 90 mL de agua desionizada y agregar 10 mL de suero fetal bovino (FBS), luego pasar a través de un filtro de 0,22 μm. Conservar el medio a 4 °C durante un máximo de 2 meses.
2. Medio de cul....

Resultados

La Figura 1 es el diagrama de flujo que muestra cómo preparar la mezcla de gel de matriz, células vasculares, medio de cultivo y reactivo. A continuación, la mezcla se inyectó por vía subcutánea en la espalda de ratones Nu/Nu y se calentó con una almohadilla térmica para acelerar su coagulación y finalmente formar un tapón de gel.

La Figura 2A es el diagrama de flujo para indicar los vasos con dextrano marcado con fluorescencia. Se in.......

Discusión

Presentamos un método fiable y conveniente para la evaluación cuantitativa de la angiogénesis in vivo sin tinción. En este protocolo, las células vasculares se mezclaron con gel de matriz en presencia de reactivos proangiogénicos o antiangiogénicos, y luego se inyectaron por vía subcutánea en la parte posterior de los ratones Nu/Nu para formar un tapón de gel (Figura 1). Después de 7 días de formación del tapón de gel, se inyectó dextran-FITC por vía intravenosa y se hizo circular d.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
portaobjetos de microscopio de adherencia	CITOTEST	188105
sistema de anestesia	RWD	R640-S1
contador de células	Invitrogen	AMQAX1000
placa de cultivo celular	Corning	430167
criocortadora	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Casetes de Inclusión	CITOTEST	80203-0007
Medio Celular Endotelial	ScienCell	35809
Suplementos de Crecimiento Endotelial	ScienCell	1025
Suero Fetal Bovino	Gibco	10100147C
Fibroblasto Factor de crecimiento 1	AtaGenix	9043P-082318-A01	FGF1
Microscopio de fluorescencia	Nikon	ECLIPSE Ni
Almohadilla térmica	Boruida	30-50-30
Jeringa de insulina	BD	300841
Isoflurano	RWD	R510-22-10
Laboratorio  Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medio 199 polvo	Gibco	31100-035
Microtubos	Axygen	MCT-150-C
Temperatura óptima de corte (OCT) Compuesto	SUKURA	4583	Gel incrustante de tejidos
Palmitato Ácido	KunChuang	KC001
Penicilina-estreptomicina líquida	Solarbio	P1400
Tampón de fosfato solución salina	Solarbio	P1022
Instrumentos quirúrgicos	RWD	RWD
Instrumento de inyección de venas de cola	KEW BASIS	KW-XXY
Solución de tripsina-EDTA	Solarbio	T1320
Temperatura ultrabaja Congelador	eppendorf	U410
Factor de Crecimiento Endotelial Vascular	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF

WH007N07